نقدم نهجا تجريبيا قيما للتحقيق في حركية تنشيط الخلايا العصبية اللاإرادية الجوهرية المفاجئة في القلوب المنفخة والتفاعل بين نشاط الكاتيكولامين القلبي والكولين. يمكن أن تكون قلوب الفئران المنحشرة حساسة جدا للتغيرات في البيئة ، مثل درجة الحرارة والأكسجين وتركيز التعزيد. إنها تتطلب مراقبة أوثق من النماذج الحيوانية الكبيرة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يستغرق micro-LED بعض التجربة والخطأ في البداية للحصول على نتائج متسقة. نحن نعمل على فهم ما يحدث في القلب عندما يتم تنشيط الجهازين الودي والبارالسمبتاوي في نفس الوقت. الجديد هو أننا ندرس هذا الموضوع باستخدام علم البصريات الوراثي لتحفيز العقد القلبية والخلايا العصبية داخل القلب نفسه.
يتميز مصباح LED الصغير الموضح هنا بأنه منخفض التكلفة وسهل التكرار نسبيا. نظرا لحجمه ، فإن micro LED قابل للمناورة ويمكنه استهداف مناطق القلب بشكل أكثر دقة من مصادر الضوء الأكبر. للبدء ، تحت مجهر تشريح في منطقة جيدة التهوية ، قم بلحام الأطراف المجردة من سلكين نحاسيين معزولين إلى نقاط الاتصال الخاصة بمصباح LED صغير 465 نانومتر.
قم بتوصيل micro-LED بمصدر طاقة ، وقم بتشغيله لاختبار اللحام. قم بقص الجزء السفلي من سنتيمتر واحد من طرف ماصة مفلترة سعة 200 ميكرولتر. ادفع الفلتر للخارج باستخدام قضيب صغير القطر.
أدخل مؤشر LED الصغير بأسلاك متصلة في طرف الماصة بحيث يكون مؤشر LED متدفقا مع نهاية الطرف. أعد تركيب الفلتر الموجود أعلى طرف الماصة لتأمين مؤشر LED والأسلاك. ثم قم بلصق حواف LED على طرف الماصة.
دع الغراء الفائق يجف. لتحضير مطاط السيليكون ، اخلطي القاعدة وعامل المعالجة حتى يصبح المحلول موحدا. قم بإزالة أي فقاعات من الخليط باستخدام غرفة مفرغة.
بعد ذلك ، خذ أنبوب طرد مركزي سعة 0.5 ملليلتر وقم بتسجيل الجوانب لتسهيل إزالة LED. قم بلصق الجزء الخارجي من أنبوب الطرد المركزي لمنع التسرب. صب ما يقرب من 0.2 مل من المطاط الصناعي السيليكوني في الأنبوب.
ضع طرف ماصة micro-LED في الأنبوب، مما يضمن مسافة ملليمتر واحد على الأقل بين مؤشر LED وأسفل الأنبوب. ضع أنبوب الطرد المركزي micro-LED في وضع مستقيم في فرن 50 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات أو طوال الليل. بمجرد تصلب المطاط الصناعي ، قم بإزالة LED من الأنبوب.
بمجرد المعالجة ، قم بقص أي مطاط صناعي زائد من طرف LED بسكين أداة مساعدة دقيق لا يترك أكثر من ملليمتر واحد. للبدء ، أضف 175 مل من محلول Krebs-Henseleit أو KH إلى نظام التروية. ضع مرشحا غشائيا بحجم 10 ميكرومتر في نظام نضح Langendorff.
ثم ابدأ الدورة الدموية. قم بتشغيل الحمامات المائية واضبطها للحفاظ على درجة حرارة الانحيم عند 37 درجة مئوية. لمعايرة مقياس التدفق ، أوقف التدفق في نظام التروية باستخدام محبس.
ثم اضغط على زر الصفر في مقياس الجريان لإجراء المعايرة. افتح برنامج الحصول على بيانات LabChart. قم بتكوين البرنامج ليشمل 12 قناة.
قم بإعداد قنوات لدرجة حرارة حمام القلب ، ودرجة حرارة تحريم الأبهر ، ويؤدي تخطيط القلب إلى واحد إلى ثلاثة للعملاء المحتملين المحسوبين الإضافيين ، وحساب معدل ضربات القلب ، ومعدل التدفق ، وإخراج مولد الوظيفة لتتبع نبضات LED. بعد ذلك ، استخدم القناة المخصصة لمعدل ضربات القلب لحساب معدل ضربات القلب. قم بتنشيط ميزة القياسات الدورية ، وقم بضبطها لاكتشاف مخطط كهربية القلب بالماوس على الرصاص الأول.
استخدم امتداد Cardiac Access الخاص ب LabChart لحساب ثلاثة عملاء متوقعين aVR و aVL و aVF بناء على العملاء المحتملين الأول والثاني. بعد تخدير الفأر والقتل الرحيم ، أمسك عملية الخنجري بزوج من الملقط ، وقم بتقطيع تجويف البطن باستخدام مقص جراحي. اقطع الحجاب الحاجز بعناية لفتح التجويف الصدري.
ثم اقطع الضلوع لكشف القلب والرئتين. أمسك الرئتين برفق واستئصال القلب والرئتين. ضع القلب في طبق يحتوي على محلول KH الهيباريني.
قم بإزالة الرئتين وأي رواسب دهنية كبيرة. تحت مجهر تشريح ، اضبط على تكبير 2x. انقل القلب النظيف إلى طبق ثان من محلول KH الهيباريني.
حدد موقع الشريان الأورطي وحركه فوق القنية باستخدام ملقط ناعم. ثبت القلب في القنية بخياطة حريرية 4-0. بعد ذلك ، اغسل القنية ببلعة من KH الهيبارين لإزالة الدم من الأوعية التاجية.
قم بتوصيل القلب المقنن بنظام التروية وضعه في طبق PDMS المليء بالقرعة. ضع أقطاب إبرة تخطيط القلب في طبق PDMS وفقا لمثلث أينثوفن. قم بتدوير القلب بحيث يمكن الوصول إلى الأذين الأيسر.
استخدم مقصا صغيرا ذاتي الفتح لإنشاء شق بحجم ملليمتر واحد في الأذين الأيسر. أدخل أنبوبا قطره ملليمتر واحد في الشق للسماح للنفيوم المحبوس في البطين الأيسر بالتصريف. بعد ذلك ، قم بتدوير القلب بحيث يكون الأذين الأيمن متجها لأعلى ويمكن الوصول إلى العقدة الجيبية الأذينية للإضاءة.
اضبط أقطاب تخطيط القلب حسب الحاجة عن طريق تقريبها من القلب لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. للتنشيط البصري الوراثي ، قم بتوصيل جهاز micro-LED بمولد وظائف وتكوينه لإنتاج موجات نبضية بتردد 10 هرتز ، وعرض نبضة 30 مللي ثانية ، وسعة 10 فولت من الذروة إلى الذروة. ضع micro-LED برفق على العقدة الجيبية الأذينية.
ثم قم بتشغيل مولد الوظائف ولاحظ التغيرات في معدل ضربات القلب من التحفيز الضوئي. تشير التغيرات الفورية في معدل ضربات القلب إلى التنشيط الفعال. قم بإيقاف تشغيل مولد الوظائف.
اسمح لمعدل ضربات القلب بالعودة إلى مستويات ما قبل التنشيط. إذا أدى التنشيط البصري الوراثي إلى تغير معدل ضربات القلب أقل من 100 نبضة في الدقيقة ، فقم بتغيير موضع micro-LED لإضاءة الخلايا العصبية في الأذين الأيمن. أدى التحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية ChAT إلى تقليل معدل ضربات القلب بأكثر من 100 نبضة في الدقيقة أثناء التحفيز الضوئي دون أن يحافظ النورادرينالين على الانخفاض طوال فترة التحفيز.
مع 2000 نانومول من النورادرينالين ، انخفض معدل ضربات القلب بمقدار 40 نبضة في الدقيقة وبدأ في التعافي قبل إطفاء الضوء. كان قمع البصريات الوراثي لمعدل ضربات القلب عن طريق التحفيز الضوئي للخلايا العصبية ChAT أقل فعالية في التغلب على الزيادات في معدل ضربات القلب الناجمة عن جرعات عالية من النورادرينالين ، مما أدى إلى أوقات قمع أقصر وانخفاض أقل في معدل ضربات القلب.
