המחקר שלנו מתמקד בעיקר בקשר בין תיקון DNA להזדקנות. באופן ספציפי, אנו מסתכלים על הפרעות למינופתית שונות ואנו רוצים ללמוד כיצד הן עשויות להשפיע על תיקון ה-DNA. הראינו כי הפרעת למינופתיה הקשורה להזדקנות מוקדמת ותוחלת חיים קצרה המכונה תסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה קשורה למעשה לכמות מוגברת של נזק ל-DNA ולתיקון DNA לא מדויק.
המעבדה שלנו רוצה לחקור את ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים לחולי למינופתה כדי ללמוד אם לגישות האלה תהיה השפעה חיובית גם על תיקון הדנ"א ועל נזק לדנ"א. כדי להתחיל, הנח החלקת כיסוי אחת לכל באר של צלחת סטרילית בת 6 בארות באמצעות מלקחיים. הוסף שני מיליליטר של מדיום הנשר השונה של Dulbecco, או DMEM, לכל באר בצלחת 6 הבארות.
שואבים את המדיה מתאי ה-HeLa המתורבתים בבקבוק ושוטפים את התאים על ידי הוספת 15 מיליליטר PBS. סובבו את הבקבוק בעדינות כדי לשטוף את התאים, שאפו את ה-PBS והוסיפו שני מיליליטר של טריפסין-EDTA לציפוי התאים. הניחו את הבקבוק המצופה בטריפסין באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שתי דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק.
לאחר מכן הוסיפו שמונה מיליליטר של DMEM בתוספת לבקבוק המכיל את התאים הטריפסינים ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפריד בין תאים גושים. אוספים את מתלה התאים מהבקבוק לצינור פוליסטירן של 15 מיליליטר. לאחר ספירת התאים, הוסף 500, 000 תאים טיפה אחר טיפה ישירות על כל אחת מהחלקות הכיסוי בצלחת 6 הבארות.
הנח את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים לצמוח בן לילה. לקיבוע תאים, שאפו את המדיה מהבארות של צלחת 6 הבארות למחרת. הוסף שני מיליליטר PBS לכל באר כדי לשטוף את התאים ולשאוב את כל PBS לחלוטין מהבארות.
לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת פורמלדהיד 4% לכל באר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושאבו את התמיסה לחלוטין מהבארות. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של תמיסת פרמביליזציה לכל באר. הניחו לתמיסה לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שאפו אותה לחלוטין.
שוטפים את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS בכל באר. שאפו באופן מלא לאחר כל שטיפה. לאחר שכל PBS נשאב מהבארות, הוסף שני מיליליטר של מאגר מדלל נוגדנים, או ADB, לכל באר כדי לחסום את התאים לצביעה אימונופלואורסצנטית.
דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם טלטול אורביטלי עדין. לקראת סוף תקופת החסימה. הכן את דילול הנוגדנים העיקרי על ידי ערבוב לומן B1 ונוגדני DNA דו-גדיליים ב-ADB.
בתום הדגירה יש לשאוב את ה- ADB מהבארות. הדביקו חתיכת סרט פרפין על משטח ישר, וודאו שהשטח גדול מספיק כדי להכיל את כל החלקות הכיסוי המעובדות. עבור כל החלקת כיסוי, פיפטה 75 מיקרוליטר של דילול הנוגדנים העיקרי על סרט הפרפין והימנע מבועות כלשהן.
בעזרת מלקחיים, הנח כל צד של תא החלקה כלפי מטה על טיפת הנוגדן. מכסים את החלקות כיסוי הדגירה במכסה של צלחת 6 הבארות ומאפשרים להחלקות הכיסוי לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את החלקות הכיסוי מסרט הפרפין והנח אותם בחזרה לצלחת 6 הבארות כשצד התא פונה כלפי מעלה.
שטפו את החלקות הכיסוי על ידי ניעורם שלוש פעמים למשך חמש דקות עם שני מיליליטר PBST. במהלך הכביסה האחרונה, הכינו את דילול הנוגדנים המשני. לאחר הכביסה האחרונה, יש לשאוף PBST לחלוטין.
הוסף נוגדן משני לסרט הפרה והנח את החלקות הכיסוי על סרט פרפין, צד התא כלפי מטה. לאחר מכן הניחו כיסוי מגן קל על החלקות הכיסוי כדי להגן על התאים מפני אור ולדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את החלקות הכיסוי מסרט הפרפין והנח אותם בחזרה לצלחת 6 הבארות, וודא שצד התא פונה כלפי מעלה, לאחר מכן יבש את החלקות הכיסוי על ידי הוספת שני מיליליטר כל אחד של 70%90% ו-100% אתנול לבארות, מה שמאפשר לכל תמיסה לשבת במשך דקה עד שתיים לפני ההסרה.
בעזרת מלקחיים, הסר את החלקות הכיסוי מהבארות והניח אותן על מגבון נטול מוך לייבוש באוויר, מוגן מפני אור. התקן את החלקות הכיסוי כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית באמצעות 20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לכל החלקת כיסוי. חבטות גרעיניות היו נפוצות יותר בתאי HeLa ZMPST24 נוקאאוט כאשר כ-50% מהגרעינים הראו בלבים, בהשוואה ל-17% בתאי ביקורת HeLa.
דליפת DNA נצפתה בעיקר בתאי נוקאאוט ZMPSTE24 HeLa, בעוד שלא נצפתה דליפת DNA בתאי ביקורת HeLa, דליפת DNA התרחשה בחלק מתאי הנוקאאוט ZMPSTE24, אפילו בהיעדר בלבל גרעיני נראה לעין.
