המחברים מבקשים להודות דירק הרמן, אוליבר ונדט, זיגפריד הורן, הרטמוט Gutzeit ו יורג Bohn לעזרה משמעותית שלהם לגבי ריתוך ממס אדי. יתר על כן, ברצוננו להודות מיכאל הרטמן, אלכס Gerwald, ודניאל Leisen לקבלת סיוע טכני שלהם.

תהליך רצף מס &#39;1: הבלטות שבבי חם, וגם מרכך ריתוך Vapour CellChip בעיצוב מעוקב שלה הוא משוכפל על ידי הבלטה חמה או מיקרו הזרקה. לשם כך, אנו משתמשים עובש פליז micromachined עם גאומטריה ההופכי של השבב. מכולות - מסודרים מערך קבוע של עד 1,156 מכולות - יש עיצוב מעוקב עם אורך יתרון של 300 מיקרומטר. עבור הבלטות חם, תהליך השכפול מבוצע על WUM02 קונבנציונאלי (Jenoptik Mikrotechnik, גרמניה). הכלי מורכב משני לוחות מתכת עגולים. בשלב ראשון, צלחת דק PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) ממוקם במרכז הצלחת התחתון של הכלי נפתח. להכניס את התבנית microstructured מותקן centrically בצלחת העליון. לאחר מכן בכלי סגור לפינוי של עובש ו מחומם לטמפרטורה מעל הטמפרטורה זכוכית המעבר של הפולימר. על ידי לחיצה על צלחות ביחד, הפולימר צמיגה נדחף לתוך החללים פונו עד שהם מלאים לגמרי בדיוק משכפלים את הגיאומטריה של התבנית. לאחר הקירור הכלי, החלק microstructured פולימר ניתן demoulded. התהליך דורש מסה פולימר יותר נחוץ למעשה כדי למלא את החללים עובש. העודף הפולימר יוצר שכבת שיורי אשר ניתן להשתמש בהם כדי להקל על demoulding של החלק. עם זאת, כדי ליצור נקבוביות בקוטר קטן יותר מאשר 3 מיקרומטר התחתון של המכולות, שכבת שיורי עבה צריך להיות דליל למטה, או אפילו להסיר לחלוטין והוחלפו על ידי קרום נקבובי. כדי לפשט את תהליך האינטגרציה הנקבוביות, גב CellChip משוכפל נמחק לחלוטין על ידי מכונות עם טחנת יהלום. לשם כך, החלקים שתוקנו על צלחת הרכבה התקרר, בנוסף, המבנים שביר מוקפאות במים deionised כדי להגן עליהם מפני נזק. בשלב תהליך שעבר, סוף סוף יון מסחרי לעקוב חרוט קרום (פוליקרבונט, 10 עובי מיקרומטר, נקבוביות 3 מיקרומטר בגודל 2x10 6 נקבוביות / סמ&quot;ר, פייפר סינון GmbH) הוא קשור האחורי של המערך מכולות עכשיו נפתח גם על העליון והתחתון. תהליך מליטה היא תהליך ריתוך ממס אדי ביצע בתא, gastight מחומם [איור. 1], בהיקף של הבוכנה העליון צלחת נמוך ניד עם צ&#39;אק ואקום משולבת. 4 עד ארבעה CellChips במכונה ולעקוב אחר חרוט ממברנות נחשפים במקביל ממס מתאדה לאחר קאמרית פונתה. ואז, החלקים יצוק ואת הקרומים הם צמודים זה לזה על ידי הבוכנה העליון. לאחר תקופה קצרה של חשיפה (&lt;15 ים), החדר הוא פונה שוב ובכך להסיר את הממס. בשל הזמן הקצר מגע, רק פני השטח ליד החומר המומס עיוות של מבנה בתפזורת בשל העומס המכני ניתן להימנע מכך. לבסוף, החדר נפתח CellChips מרותך ממס ניתן להסיר מוכן תרבית תאים [איור. 2]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="איור 1" width="100" /></a> באיור 1. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="איור 2" width="100" /></a> איור 2. תהליך רצף מס &#39;2: הקרנה יונים כבדים, microthermoforming ותחריט מסלול (תהליך SMART) התהליך החדש נקרא SMART היא טכנולוגיה שפותחה לאחרונה מיקרו לייצור פונקציונליות קרום דמוי microstructures. 5 הטכנולוגיה מבוססת על תהליך thermoforming microtechnical, שנקרא &quot;microthermoforming&quot;. 6,7 בשלב זה תהליך מרכזי, אשר הותאמה מן מאקרוסקופיים לכודים תהליך גיליון Thermoforming, סרט דק מחומם פולימר נוצר ב מרוככת למצבו גומי אלסטי ידי לחץ גז לתוך חלל עובש [איור. 3]. בניגוד הבלטות חם או הזרקה, תהליך זה אינו להרכיב הראשי הפולימר אינו נמס. בשל העובדה כי הסרט נוצר עדיין עם לכידות חומר קבוע במצב מוצק, שינויים בחומר עם רזולוציות גבוהות לרוחב יכולה להיות הראשון שנוצר על מישוריים סרטים פולימר נשמרים לאורך כל תהליך גיבוש. לאחר השלב microthermoforming, שינויים אלה יכול להיות מעובד יותר סלקטיבי, למשל, על ידי טיפול כימי רטוב. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="איור 3" width="400" height="217" /> איור 3 תהליך SMART עקרונית מורכב משלושה שלבי התהליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת דפוסים שינוי החליט על דק מאוד סרטים מישוריים פולימר בתהליך מראש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3D shaping של סרטים על ידי microthermoforming ללא אובדן (בדוגמת) שינויים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תהליך (אופציונלי) עבור functionalisation סופי דק דופן חלקים microstructured </li></ol> תהליך SMART אנחנו כרגע החלת עבור ייצור של CellChips נקבובי כולל את השלבים הבאים בתהליך [איור. 4]. סרט דק פולימרי, למשל, מ פוליקרבונט (Pokalon OG461Gl, 50 מיקרומטר, LoFo הייטק הסרטים GmbH, גרמניה), הוא מוקרן עם יונים כבדים מואץ (כגון Xe, Au או יונים U) במתקני מאיץ של GSI (דרמשטט, גרמניה) עם אנרגיות של כ. 1 GeV ו fluences בצו של 106 8 לאחר הקירור בכלי, חלק המוקפת חומה דקה ניתן demoulded. יונים / cm ². כאשר חודרת דרך הסרט, כל אחד מייצר יונים שביל ישר כמעט של חומר שונה, נקרא מסלול סמוי. טרום טיפול הסרטים הם thermoformed אז מערך של 25x25 microcontainers חומה דקה, כל אחד בקוטר ועומק של 300 מיקרומטר. התהליך מבוצע כיום על העיתונות שונה הבלטות חם [איור. 5], שם את הסרט פולימר הוא הידק בין שתי לוחיות מתכת. צלחת העליון מצויד עובש micromachined ואת התחתון מכיל את הלחץ ומחברים ואקום. הסרט הוא נמתח אל תוך microcavities פונו בעבר של עובש על ידי חנקן עם לחץ של עד 5 מגפ&quot;ס. הסרטים נוצרים ליד הטמפרטורה שלהם המעבר זכוכית למניעת לעקוב חישול. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="איור 4" width="400" height="119" /> איור 4 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="איור 5" width="100" /></a> איור 5 בתהליך הפוסט, המסילה יון חקוקות סלקטיבי נקבוביות ידי טבילה מיקרו כולו בינוני תחריט המתאים (למשל, מול 5 / L NaOH, 10% w / v MeOH). על ידי שליטה על פי תחריט תחריט תנאים, כגון טמפרטורה ריכוז, ומוספים מיוחדים (למשל, מקדמי לחרוט), גודל וצורה של הנקבוביות וכתוצאה מכך יכול להיות מותאם [איור. 6]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="איור 6" width="100" /></a> איור 6

<ol>
	<li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-like+culture+system+using+microstructures:+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation.">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li><li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenm&#252;ller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization.">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li><li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers.">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li><li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenm&#252;ller, R., Weibezahn, K. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microthermoforming+as+a+novel+technique+for+manufacturing+scaffolds+in+tissue+engineering+(CellChips.">Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).</li><li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenm&#252;ller, R., Weibezahn, K. -. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films.">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 .</li><li>Truckenm&#252;ller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips.">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microthermoforming+of+flexible,+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications.">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li><li>Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+tracks+in+solids.">Nuclear tracks in solids.</a> , .</li></ol>

למרות שיטות הוקמה microreplication של פולימר, כגון מיקרו הזרקה או הבלטה חמה, מתאימים לייצור microstructures, הם לא ממש יעילים בהפקת microstructures עם נקבוביות משולב ומבוקר מאוד, שכן דרוש CellChip. מבנים גדולים, נפוחים, למשל דורשים עיבוד יקר כדי להפחית עובי דופן עבור ניקוב לייזר הבאים או קירות צריך להיות מ?...

microfabrication of chip-sized scaffolds for three-dimensional cell cultivation

שימוש בטכנולוגיות microfabrication היא תנאי הכרחי כדי ליצור פיגומים לשחזור של הגיאומטריה ואת איכות מתמדת לטיפוח תלת מימדי התא. טכנולוגיות אלה מציעים קשת רחבה של יתרונות לא רק ייצור אלא גם עבור יישומים שונים. הגודל והצורה של צבירי תאים נוצרו יכול להיות מושפע ארכיטקטורה המדויק לשעתקו של הפיגום microfabricated, ולכן הדרך אורך דיפוזיה של חומרים מזינים וגזים ניתן controlled.1 זהו ללא ספק כלי שימושי כדי למנוע אפופטוזיס ו נמק של בשל מזין מספיק אספקת גז או הסרה של תאים מטבוליטים הסלולר. שבב פולימר שלנו, שנקרא CellChip, יש את הממדים החיצוניים של 2 x 2 ס&quot;מ עם שטח microstructured המרכזית. אזור זה מחולק מערך של עד 1156 microcontainers עם מימד אופייני של 300 מ &#39;אורך קצה לעיצוב מעוקב (CP-CF או שבב) או בקוטר של 300 מ&#39; עומק לעיצוב עגול (r-chip). 2 עד כה, הבלטות חמים או מיקרו הזרקה (בשילוב עם עיבוד מייגע הבאות של החלקים) שימש עבור ייצור של שבבי microstructured. בעיקרון, מיקרו הזרקה היא אחת הטכניקות רק פולימר שכפול מבוסס, עד עכשיו, הוא מסוגל לייצור המוני של פולימר microstructures.3 עם זאת, טכניקות לשניהם יש מגבלות לא רצויות מסוימות בשל העיבוד של פולימר צמיגה להמיס עם הדור הקירות דקים מאוד או משולב דרך החורים. במקרה של CellChip, שכבות תחתית דקה נחוצים כדי לנקב את הפולימר לספק נקבוביות קטנות בגודל מוגדר לספק תאים עם לדוגמא בינוני התרבות על ידי זלוף microfluidic של המכולות. על מנת להתגבר על המגבלות האלה וכדי להקטין את עלויות הייצור פיתחנו גישה microtechnical חדש על בסיס תהליך למטה scaled Thermoforming. עבור ייצור של שבבי חומה נקבובי מאוד דק פולימרי, אנו משתמשים בשילוב של קרינה יונים כבדים, microthermoforming ותחריט המסלול. בכל התהליך הזה שנקרא &quot;סמארט&quot; (שינוי המצע על ידי שכפול Thermoforming) סרטים פולימרי דק הם מוקרן עם קליעים כבדים האנרגטי של MeV כמה מאות מציגה שנקרא &quot;רצועות סמוי&quot; לאחר מכן, הסרט במצב גומי אלסטי נוצר לשלושה חלקים ממדי ללא שינוי או חישול את הרצועות. לאחר תהליך גיבוש, תחריט כימיים סלקטיבית ולבסוף ממירה את רצועות לתוך הנקבוביות גלילי בקוטר מתכווננת.

Watch this Scientific Journal Video about Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation at JoVE.com

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

אנו מציגים שני תהליכים עבור microfabrication של שבבי פולימרי נקבובי לעיבוד תלת ממדי התא. הראשון הוא הבלטות חם בשילוב עם תהליך אדי ריתוך ממס. השני משתמש בתהליך microthermoforming פיתחה לאחרונה בשילוב עם טכנולוגיית מעקב יון המוביל פישוט משמעותי של ייצור.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

microfabrication-chip-sized-scaffolds-for-three-dimensional-cell

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Karlsruhe Research Centre. אנו מציגים שני תהליכים עבור microfabrication של שבבי פולימרי נקבובי לעיבוד תלת ממדי התא. הראשון הוא הבלטות חם בשילוב עם תהליך אדי ריתוך ממס. השני משתמש בתהליך microthermoforming פיתחה לאחרונה בשילוב עם טכנולוגיית מעקב יון המוביל פישוט משמעותי של ייצור.

Video: Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

ראיון: bioreactors ועלו-Modified-3D פיגומים למחקר בתאי גזע

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...