הודות טים ​​דויל, PhD והמרכז סטנפורד בתחום ההדמיה Vivo לסיוע עם הדמיה פליטת אור. כמו כן, הודות Ngan הואנג, PhD לשיתוף הטכניקה שלה על תא גזע שיתוף זריקה עם פתרון מטריקס. לבסוף, בזכות סטיב לבד, Ph.D. לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים וטרינרי.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של ג&#39;ין Fusion פעמיים Reporter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה של פליטת אור בתאי גזע עובריים אנושיים, תחילה עליך להשיג תאים ביציבות להביע גן הכתב בלוציפראז כגון בלוציפראז גחלילית מונע על ידי האמרגן מכוננת כמו היוביקוויטין או EF1a. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתמקדות של פרוטוקול זה על יישומים גן הכתב, כך נהלים מפורטים לא ניתנים כאן. עם זאת, האסטרטגיה הכללית של המעבדה שלנו היא להשתמש היתוך כפול לבנות וקטור המכיל גחלילית בלוציפראז (fluc) משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (egfp) מופרדים על ידי spacer בתוך pCDNA 3.1 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, גן היתוך כפול שלנו נמצא במקור הזרם של האמרגן ציטומגלווירוס ב pCDNA 3.1 (+), כך בקטע 3.3 kbp היה נכרת באמצעות NdeI ו NotI העיכול סוף בוטה-ligated לתוך האתר שיבוט מרובות של SIN (עצמית inactivating ) וקטור lentiviral, תחת שליטה של ​​מקדם יוביקוויטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lentiviral התמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs ניתן transduced 3-5 ימים לאחר מעבר על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 (כייל ויראלי של כ 107 מודגרות עם 106 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המניה ויראלי מופשר ניתן להוסיף ישירות המדיה hESC טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן התקשורת 12 ו - 24 שעות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, יעילות התמרה יכול להעריך על ידי איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, FACS ניתן להשתמש כדי לבודד תאים נגועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Culturing hESCs ומבוא הדמיה הקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות hESCs חיובי בלוציפראז שלך מזין ללא תנאים. אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי WiCell ולהשתמש צלחות 6-היטב מצופה גורם גדילה מופחת Matrigel, או באמצעות אמצעי התקשורת מותנה או מסחריים, מזין ללא התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את התאים חיובי בלוציפראז, תצטרך לקבל את הכתב בדיקה D-luciferin כבר מוכנה. כדי לעשות זאת luciferin, aliquot ב 1-1.5 ההכנות מ&quot;ל בריכוז סופי של 45 מ&quot;ג / מ&quot;ל. שמור את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש ולהימנע מחשיפה לאור על ידי כיסוי עם מגבת נייר כאשר לא אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמחיש את התאים חיובי בלוציפראז, אנו משתמשים IVIS 50 ו IVIS 200 מערכות דימות (Xenogen Corporation, Alameda, CA). מערכת זו האחרונה כוללת מנגנון isoflourane משולבת קאמרית אינדוקציה עבור הרדמה זמנית של חיות קטנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת הדמיה חוץ גופית של פליטת אור hESCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה פליטת אור חוץ גופית, חשוב לשמור על תנאים סטריליים. לכן, מערכת הדמיה צריך להיות סטרילי, רצוי בחדר תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה, הסר את המדיה התא להוסיף PBS מספיק כדי לכסות את התאים. לדוגמה, להוסיף 1mL PBS היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה תרבויות hESC שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחס של D-Luciferin כדי PBS צריך להיות 1:100, אז להוסיף 10 μL של מופשר D-Luciferin היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן דקה אחת, ואז לקחת תמונה באמצעות זמן חשיפה של שנייה 1. אם האות חלש, להגדיל את מרווח החשיפה ונסה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האות bioluminescent משקף מספר התא, כך מבחני quantitation יכול להתבצע המתואמים אות עם מספרים תאים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של העכבר על הזרקת תאים in vivo הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתב הגן הדמיה מספק שיטה תפוקה גבוהה, זול רגיש עבור תאים המעקב לאחר ההשתלה על ימים, שבועות ואפילו חודשים. זה חשוב במיוחד מאז בתאי גזע מושתלים לעתים קרובות בצורת teratomas, נדחות על ידי המערכת החיסונית של המארח, או פשוט למות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה הפשוטה ביותר ליצירת תפלצת הדמיה in vivo היא להזריק hESCs המבטאים את הגן כתב בלוציפראז גחלילית לתוך גבם של עכברים SCID ולרכוש תמונות bioluminescent עם מערכת IVIS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להשתיל את התאים, או להשתמש dispase collagenase כדי לשחרר את התאים, לשטוף כמה פעמים, להשעות אותם בתערובת 01:01 של גורם הגדילה מופחתת matrigel ו DMEM. בדרך כלל אנחנו הראשונים לערבב את התאים DMEM מקורר ולאחר מכן להוסיף matrigel. עבור כל אתר הזרקה תת עורית, אנו מזריקים 200,000 תאים תלוי בנפח 50-100 ul תערובת matrigel / DMEM. מספר התא יכול להיות מותאם בהתאם ליישום שלך. זכור לשמור את הכל על קרח לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים מוכנים, להרדים את העכבר על ידי הצבת אותו בתיבה אינדוקציה עם הזרם isoflurane מופעלת. אחרי 1-5 דקות, העכבר ישנה ניתן להציב על שולחן הניתוחים עם isoflurane רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כי באופן טבעי הפרווה אוטומטי מאיר ועלול לטשטש את התמונה bioluminescent, נצטרך להסיר את השיער מן הצד האחורי של העכבר. הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא להשתמש במכונת גילוח חשמלית, אבל אתה יכול גם להשתמש להסרת שיער ג&#39;ל. נגבו עם אלכוהול לעקראת העור לאחר מכן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין מתלה הנייד שלך מזרק. 23-27 מחטים מד העבודה הטובה ביותר מאז הם לא סותמים עם תאים. אם המחט גדולה מדי (&lt;23 מד) את דרכי מחט עלול להשאיר חור גדול שדרכו תאים יכול לדלוף החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את התאים מתחת לעור לחלק האחורי של העכבר. בגלל העור רופף למדי, השתמש באגודל ובאצבע לצבוט ולמתוח את האזור אתה רוצה להזריק. להזריק מתחת לעור, נזהרת שלא לנקב עמוק מדי. כמו כן, מנסה לשמור את המחט מלהחליק מתוך הזריקה בזמן מדכא על הבוכנה: זה ימנע יצירת חור בעור שדרכו התאים יכול לדלוף אם תנסה להזריק שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים מוזרקים, לחכות כמה שעות כדי לאפשר העכבר להתעורר להתרוצץ מחדש לפני הרדמה הדמיה פליטת אור. פעולה זו נמנע רעילות isoflurane. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של התאים המושתלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה חיה כל פליטת אור, אנחנו עושים זריקה intraperitoneal של D-luciferin במשקל מ&quot;ג / ק&quot;ג 375 הגוף. לשקול את בעל החיים כדי לחשב את המינון לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את D-luciferin ב הצפק, ממש ליד קו האמצע. להיזהר לא להיכנס עמוק מדי או שאתה יכול לגרום נזק לאיברים פנימיים. אם העכבר מתחיל להתעורר, מקום אותו בתיבה בנוקאאוט ולחכות דקה או שתיים. עבור עכברים, פליטת אור מקסימלית מתרחשת בדרך כלל 15-40 דקות לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור למקום נייר שחור מט בתיבת הדמיה לעזור לקלוט את כל האור הנפלטת לא hESCs. מניחים את העכבר (עד הישבן) בחדר הדמיה עם isoflurane, על גבי נייר שחור. התחלה עם זמן חשיפה של 10 שניות. אם אות רווי, לנסות ולהקטין את זמן החשיפה, אם חלש מדי, להגדיל את החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן חשיפה האות עבר אופטימיזציה עבור העכבר, להתחיל לקחת תמונות מכל רגע עד האות מגיע לשיא. הדבר נעשה כמיטב באמצעות תוכנת הדמיה כדי לבחור &quot;אזורים של עניין (ROI)&quot; כי לכסות אתרי הזרקה שלך. על ידי ניטור עוצמת האות בכל ROI כל אתה יכול בקלות לקבוע מתי האות מתחילה ירידה, המציין את עוצמת האות המקסימלי הושג. אות המקסימלי צריך לשמש הנתונים הסופיים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מרוצה עם התמונות שלך, הסר את העכבר מן isoflurane ולאפשר לו להתעורר בכלוב שלה. בדרך כלל, העכבר צריך להתעורר תוך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתב פליטת אור הדמיה הגן ניתן לחזור על בסיס יומי, שבועי וחודשי ככל hESCs לשרוד החיה. אותות מן תפלצת רוחנית מתפתחת יגדל אקספוננציאלית לאורך זמן, בדרך כלל בסדר גודל של שבועות, כפי hESCs מתחילים להתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקורס הזמן הרצוי של תמונות פליטת אור נרכש, בעלי חיים עשוי להיות קורבן וקטעי רקמה המשמש היסטולוגיה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Passier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cardiomyocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+cultures.">Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures.</a> Stem Cells. 23, 772-780 (2003).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Baharvand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells+in+a+defined+adherent+culture+conditi.">Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi.</a> Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> BMC Neurosci. 4, (2007).</li><li>Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Insulin-producing+Islet-like+Clusters+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 17, 17 (2007).</li><li>Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+hurdles+for+the+transplantation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells:+role+of+molecular+imaging.">Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).</li><li>Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging:+looking+at+problems,+seeing+solutions.">Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions.</a> Science. 302, 605-608 (2003).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature medicine. 4, 245-247 (1998).</li><li>Bhaumik, S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+Renilla+luciferase+reporter+gene+expression+in+living+mice.">Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).</li><li>Tisi, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+thermostable+firefly+luciferase.">Development of a thermostable firefly luciferase.</a> Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).</li><li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects.">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival,+proliferation,+and+migration+after+cardiac+delivery.">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Embryonic+Stem+Cell+Misbehavior+and+Suicide+Gene+Ablation.">Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation.</a> Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).</li><li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects.">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+reporter+genes+for+molecular+imaging+of+transplanted+embryonic+stem+cells.">Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells.</a> Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Level+Sustained+Transgene+Expression+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Using+Lentiviral+Vectors.">High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors.</a> Stem Cells. 21, 111-117 (2003).</li><li>Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+hematopoietic+cells+differentiated+from+human+embryonic+stem+cell-derived+CD45(neg)PFV+hemogenic+precursors.">Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors.</a> Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).</li><li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase.">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem cells. 26, 119-126 (2008).</li><li>Liew, C. -. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , .</li></ol>

לעומת שיטות אחרות כגון PET ו-MRI, פליטת אור בעל רזולוציה מרחבית מוגבלת חדירה לרקמות מופחת בשל האנרגיה חלשה יחסית של פוטונים הנפלטים (2-3 eV); מסיבות אלה יש עד כה לא היה רלוונטי בחיות גדולות. עם זאת, פליטת אור יש את היתרון של להיות בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה, ולא פולשנית, מה שהופך אותו רצוי מ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Matrigel&#x2122; Basement Membrane Matrix</td>
<td>Growth factor reduced (optional: phenol-red free)</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biosynth AG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius).</td>
</tr>
<tr>
<td>Baked Pasteur pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>92006</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells

הגילוי של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) גדל באופן דרמטי את הכלים העומדים לרשות מדענים רפואיים מעוניין רפואה רגנרטיבית. עם זאת, הזרקה ישירה של hESCs, ותאי להבדיל hESCs, לתוך אורגניזמים חיים עד כה כבר הקשו על ידי מוות של תאים משמעותי, היווצרות תפלצת רוחנית, ודחייה מארח החיסונית. הבנת התנהגות hESC vivo לאחר ההשתלה דורש טכניקות הדמיה חדשנית longitudinally לפקח לוקליזציה hESC, שגשוג, ואת הכדאיות. הדמיה מולקולרית נתן החוקרים אמצעי תפוקה גבוהה, לא יקר, רגיש עבור מעקב התפשטות תאים vivo לאורך ימים, שבועות ואפילו חודשים. התקדמות זו גדל באופן משמעותי את הבנת במרחב ובזמן קינטיקה של engraftment hESC, התפשטות, תפלצת היווצרות בנושאים החיים. התקדמות גדולה הדמיה מולקולרית כבר את הסיומת של מבחני גן פולשנית כתב ביולוגיה מולקולרית תאית לתוך in vivo מרובת פלטפורמות שיטת הדמיה. גנים אלו הכתב, בשליטת היזמים משפרי מהונדסים כי לנצל מכונות תעתיק של התא המארח, הם הציגו לתוך התאים באמצעות מגוון של שיטות וקטור וקטור לא. לאחר בתא, גנים הכתב יכול להיות גם עיבד constitutively או רק בתנאים ביולוגיים או הסלולר ספציפי, בהתאם לסוג של האמרגן בשימוש. תמלול ותרגום של גנים לחלבונים כתב ביו מזוהה אז עם מכשור, רגיש פולשנית (למשל, מצלמות CCD) באמצעות האות מניבות בדיקות כגון D-luciferin. כדי למנוע את הצורך לעקוב אחר האור מעוררים בתאי גזע in vivo כפי שנדרש לצורך דימות פלואורסצנטי, כתב פליטת אור גן מערכות הדמיה דורשים רק בדיקה מנוהל exogenously לגרום פליטת האור. גחלילית בלוציפראז, נגזר Photinus גחלילית pyralis, מקודד אנזים המזרז D-luciferin על המטבוליט הפעיל אופטית, oxyluciferin. פעילות אופטית אז יכול להיות במעקב עם מצלמת CCD חיצוני. ביציבות transduced תאים שנושאים את הכתב לבנות בתוך הדנ&quot;א בכרומוזומים שלהם יעבור הכתב לבנות DNA לתאי הבת, המאפשר ניטור האורך של הישרדות hESC ושגשוגם in vivo. יתר על כן, כי הביטוי של המוצר גן הכתב נדרש דור האות, קיימא רק בתאי אב ובתו תיצור אות פליטת אור; תאים אפופטוטיים מת או לא. בסרטון הזה, החומרים הספציפיים הדרושים ריבוי שיטות מעקב בתאי גזע היווצרות תפלצת עם הדמיה פליטת אור יתוארו.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

in-vitro-vivo-bioluminescence-reporter-gene-imaging-human-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

21.7K Views.  Stanford University School of Medicine. עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

Video: In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...