WPS נתמך בחלקו על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (CA129359), סוזן ג&#39;קומן לריפוי הקרן (BCTR0706967), משרד ההגנה (BC084561), וזיידמן המרכז לחקר הסרטן, ואילו MKW נתמך על ידי מלגה מהאגודה האמריקנית לסרטן (PF-09-120-01). תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופקה על ידי מקרה המרכז למחקר הדמיה, מרכז לסרטן של הקייס (P30 CA43703), ומרכז סיסטיק פיברוזיס (P30 DK027651).

1. ביטוי יציב של לוציפראז Renilla CMV-Driven <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection ובחירה של אוכלוסייה משובטת יציבה הוא השיטה המועדפת לביטוי של עיתונאי לוציפראז renilla זה. גישה זו מניבה ביטוי לוציפראז renilla עקבי ואחיד יותר בעקבות הכניסה הבאה של מבנים משניים נוספים כתב (למשל, הגחלילית לוציפראז או חלבוני ניאון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים ממאירים עניין עם בלוציפראז renilla קידוד וקטור הביטוי, כגון pcDNA3.1-Hygro או אחר פלסמיד מחסה סמן בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות transfection, למקם את transfectants תחת ריכוז אנטיביוטיקה מותאם למספר ימים-to-שבועות כדי להקל על הבידוד של מושבות בודדות, אשר בודדו בהמשך בנפרד וsubcultured. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ≥ 10 מושבות renilla בודדות לוציפראז מבטא-לפקח על מידת ביטוי renilla. </li><liמושבות&gt; מבטאות כמויות גבוהות של לוציפראז renilla חשופות להמשך תפקודי מנתח כדי להבטיח ש( i) את מאפייני pathophysiological של עמיתי הוריהם נשמרים, וכן (ii) ערכי הביטוי renilla אינם חורג או השינוי לאורך זמן. פעולות אלה הן חיוניים כדי למנוע בידוד ולומד גרסות / סוטים משובטות, וכדי לאמת את שילוב נכון של מבנה renilla לתוך הגנום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע transfectant יציב מבודד ואומת, אפשר להסיר את לחץ הברירה ולהיות סמוכים ובטוח כי הביטוי של לוציפראז renilla יישאר קבוע לאורך אורכי זמן ממושכים במבחנת in vivo. </li></ol> 2. ביטוי, בחירה ואימות פונקציונלית של מושרה Firefly לוציפראז יזם-Driven <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone האמרגן של עניין לכתב pGL4-לוציפראז פלסמיד מחסה סמן לבחירה (למשל, פורomycin) שהוא שונה מזו משמשת לבחירה לביטוי renilla יציב (למשל, hygromycin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים ממאירים כמו בשלב הראשון, ולאחר מכן בחר לאוכלוסיית polyclonal יציבה של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-. בגלל המיקום שבו גן הדו&quot;ח משתלב בגנום יכול לעורר תופעות שגויות בביטוי והרגולציה שלה, מומלץ מאוד לבחור עבור אוכלוסיות polyclonal של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-בניגוד לאוכלוסיות משובטות כדי להבטיח שביטוי גן הכתב (אני) יותר משקף במדויק ששל גן אנדוגני בתאים הוריים, וכן (ii) השפעות אינטגרציה על ביטוי גנים הן ממוצעים ופחתו על פני אוכלוסיית התאים הטרוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ממאירים מהונדסים יציבות לבטא גם luciferases הגחלילית renilla והם מתייחסים אליהם כתאים כפולים bioluminescent כתב, או תאי DBR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש &lt;מסורתיem&gt; במבחני חוץ גופייה מבוססי תאים וציפראז כתב גנים, ודא כי תאי DBR לווסת ביטוי בלוציפראז גחלילית, או חיובי או שלילי, באופן concordant עם זה שנצפה בתאי transfected הורים זמנית עם הווקטורים האלה. כמו כן, ודא שביטוי CMV מונחה של renilla אינו מוסדר על ידי גירויי תאים שונים או בתנאי טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות זאת, התרבות DBR ותאים הוריים בצלחות 24 גם, ולאחר מכן transiently שיתוף transfect תאים הוריים עם CMV-renilla המקורי ואמרגן-גחלילית בונה משמש ליצירת תאי DBR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, טיפול DBR ותאי הורי transfected עם גורמים או סוכנים תרופתיים ידועים להסדיר את האמרגן של עניין, ולאחר מכן לכמת גחלילית והארת renilla באמצעות ערכת Assay לוציפראז Promega הכפולה. </li></ol> 3. הקמת 4T1 גידולי חלב ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קרצינומה גרורתי 4T1 חלב שאנומחדש מצא לפתוגנים מכרסמים adventitial חוסר הונדסו ביציבות להביע לוציפראז CMV מונע renilla (pcDNA3.1-CMV-renilla לוציפראז-hygro) וגחלילית לוציפראז SBE מונחה (pGL4.2-SBE-גחלילית לוציפראז-Puro) כ שתואר לעיל. engraftment orthotopic של תוצאות אלו תאי סרטן השד בהיווצרות ספונטניות של גרורות בעיקר לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי 4T1 אסור להגיע לנקודת מפגש בהתפשטותם במערכות תרבות מסורתיות 2-ממדי רקמות, והם צריכים להיות passaged היום לפניהם בחיסון גוף חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי 4T1 צריכים להיות מנותקים על ידי trypsinization, שטף ביסודיות בתקשורת צמיחה, ודילול בPBS לריכוז של 2x10 5 תאים / מ&quot;ל ומאוחסנים באופן מיידי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבות עכברי BALB / C (4-6 שבועות) צריכים להיות מורדמים עם מינון אינדוקציה של 3% isoflurane ונשמר תחת הרדמה במינון של 1% isoflurane. הכן את אתר ההזרקה על ידי ניגוב עם70% אלכוהול רפואי. השימוש במלקחיים, בעדינות לתפוס ולהרים את כרית החלב מפשעתי 4. זהירות, הנח צד פוע מחט מד 27.5 ולהזריק לתוך כרית שומן החלב ישירות מתחת לפטמה, טיפול מיוחד לא לדחוף את המחט לתוך חלל הבטן. שחרר את הבלוטה ולהזריק 50 μl של השעית התא (1x10 4 תאים) לאט לתוך כרית שומן החלב. </li></ol> 4. הדמיה ראשונית כפולה זריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר engrafting תאי 4T1 על כרית שומן החלב ואילו עכברים הם עדיין מורדמים, להזרים 100 μl של Coelenterazine RediJect לתוך וריד הזנב לרוחב. זהו ריכוז המצע האופטימלי מומלצים על ידי היצרן והטוב ביותר הנסבל על ידי בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את העכבר לחרטום isoflurane בתוך מערכת הדמית IVIS-200 ולרכוש תמונה זורחת 0.5-1 דקות. יעילות בין הזרקה ורכישה של תמונה היא חשובה מאוד, כאותללוציפראז renilla יורד בתלילות ~ 30 שניות לאחר ההזרקה. הנח את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולאפשר לו להתאושש ל≥ 1 שעה, מה שמבטיח שכל אות לוציפראז renilla שיורים התפוגגה ושהעכבר התאושש לגמרי מההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג של מלח אשלגן D-luciferin באמצעות הזרקת IP ולהמתין 5 דקות. זהו הריכוז האופטימלי של D-luciferin, המספק אות זורחת יציבה במשך 5-15 דקות לאחר החדרתו לבעלי חיים. הרדם את העכבר באמצעות isoflourane ולהחליף בIVIS-200, בטיפול כדי למקם את החיה במיקום יחסי לרכישת renilla המקורית דומה מאוד. העצמה הכוללת של אות גחלילית זה תהיה תלוי בפעילות של האמרגן של עניין, ו, פעילות לוציפראז כדוגמת המחשת גחלילית עשויה לדרוש פעמי רכישה מורחבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת תמונת חי IVIS המוגדרת למצב &quot;פוטונים&quot;, להקים values עבור רכישות גחלילית כאמצעי לבסס יחסי הארה יחסיים בסיסיים (RLR) renilla ו. </li></ol> 5. אורך זריח הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי 4T1 הם אגרסיביים מאוד, כך שהחיסון של 1x10 4 תאים בדרך כלל מוביל להיווצרות גידול מוחשית בתוך השבוע 1, והקטלניות של החיה בתוך 4-5 שבועות. גידולי 4T1 יש כיב נטייה טבועה בשבוע 4. הצמיחה והתחזוקה של גידולי כיבים עשויות לדרוש אישור IACUC נפרד. מחקרי הגידול 4T1 מוצגים במסמך זה אושרו על ידי IACUC באוניברסיטת Case Western Reserve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר לעיל, עכברים צריכים להיות מוזרקים שבועיים עם Coelenterazine RediJect לפקח צמיחת גידול כללית וגרורות, וכן עם D-luciferin לפקח איתות מסלול ספציפי במהלך שלבים שונים של התפתחות גידול. היזהר בכל פעם על מנת להבטיח את אות לוציפראז renilla התפוגגה לחלוטין לפני הרכישהשל אות בלוציפראז הגחלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כגידולי 4T1 להתפתח ולהתקדם, רכישות וציפראז renilla צריכות להיות מנורמלות לערכי renilla הראשוניים שנמדדו בעת הדבקת תאי גידול כאמצעי לנורמליזציה ולעקוב אחר צמיחת גידול ראשונית. וחשוב יותר, חישוב ערכי RLR לאורך הזמן יקים רגולציה הזמנית של מערכות איתות בודדות יחסית לצמיחה והתקדמות גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרורות ריאה גלויות מתבררות בתוך 3-4 שבועות לאחר engraftment התא 4T1 על כרית שומן החלב. השוואת ערכי RLR ריאות לעומת אלו שמחושבים לגידול הראשוני קובעת תקנה המרחבי של מערכות איתות בודדות יחסית לגידול וגרור. </li></ol> 6. הדמית bioluminescent כפולה של שני סוגי תאים ייחודיים בבעלי חיים יחידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קו אחד מהנדס סרטן שד לתא לוציפראז יציבות הביטוי CMV מונע renilla כפי שתואר לעיל. חזור על פעולה זותהליך הנדסי באמצעות בלוציפראז הגחלילית CMV מונחה על קו שני ברור סרטן שד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסמך זה אנו מעורבים renilla לוציפראז-להביע תאי 4T1 עם עמיתיהם nonmetastatic וisogenic גחלילית לוציפראז מבטאים-4T07 10, 11. יחסים משתנים של אוכלוסיות אלו מעורבות בסרטן שד תאים מוזרקים לאחר מכן לתוך כרית שומן החלב כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לרכוש גם גחלילית ותמונות וציפראז renilla להקים נציג RLRs ראשוני של תערובת תא נתון מחוסנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמית bioluminescent כפולה אורך תהיה לחזות ולעקוב אחר שינויים בהרכב התאי בתוך הגידול הראשוני, כמו גם את גרורת החלל ובזמן של כל נגזרת סרטן שד בהשוואה לצמיחת גידול ולהתפתחותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אוכלוסיות תאי סרטן השד בודדות יכולות להיות מחוסנות למקומות שונים בעכבר (כלומר רפידות בטן חלב ימניות ושמאליות שומן)כדי להעריך את ההשפעות המערכתיות שתי אוכלוסיות אלה תערוכה על אחד אחר במהלך שלבים שונים של צמיחת גידול וגרור. </li></ol> 7. נציג תוצאות: כוח עיקרי של הדמית bioluminescent כפולה טמון בעובדה שכל תמונה היא פנימי עקבית ומבוקרת, כך שהאותות המתמשכים הנגזרים מגידול הראשונית הפונקציה כמדד חשוב כדי לאמוד הצלחה או הכישלון הכוללת של כל renilla ורכישת גחלילית. היבט זה של הליך ההדמיה חשוב במיוחד במהלך רכישות של פעילות renilla לוציפראז, Coelenterazine שמצע הוא רגיש מאוד לחמצון כי תוצאות ביכולתה האוטומטית הארה. האיור 1 א מציג דוגמה לאפקט זה צד, שבא לידי ביטוי באופן מיידי כאותות זורחים לא ספציפיים הנגזרים ממערכת העיכול, ולא גידול הראשוני והמבוסס. בדרך כלל, אלה Coelenterazine הספציפי מאותת transpirלהלן דואר נכשל זריקות תוך ורידים של מצע לוציפראז renilla זה. עם זאת, ברגע שאותות עיקריים המופקים מגידול חזקים renilla הושגו (התרשים 1B, תמונה משמאל), זה בטוח להמשיך בלכידת מדידות מסלול איתות ספציפיות הנגזרות מהדמית הגחלילית לוציפראז (1B איור, לוח ימני), שD-luciferin מצע הוא מאוד יציב על הזרקת IP ומייצר רמות זניחות של הארה אוטומטית ברקע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> איור 1. רכישת renilla וגחלילית-נגזר תמונות bioluminescent לחשב בRLRs vivo. () דוגמה להזרקה נכשלה IV של Coelenterazine כתוצאה אות ספציפית ממערכת העיכול. המעגל וPT מצביעים על המיקום המשוער של הגידול הראשוני. (ב &#39;) רכישת renilla מוצלחת של עכבר נושאה גידול ראשוני 4T1 ו-pגרורות ulmonary (פנל שמאלי; 4wk לאחר engraftment כרית שומן). רכישת הגחלילית המקבילה מאפשרת חישוב RLRs הן מהגידול הראשוני והגרורות ריאתיות. (ג) ייצוג גרפי של גידול הראשוני והגרור RLRs ריאתי מחושב מעכברים המוצגים בלוח ב &#39;(n = 4).

<ol>
	<li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow:+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease.">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li><li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells.">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li><li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis.">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li><li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis.">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li><li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis.">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li><li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages.">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li><li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors.">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells.">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li><li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression.">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li><li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Light,+No+Lysis.">Bright Light, No Lysis.</a> Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).</li><li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents.">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכח המוחלט של שיטות הדמית bioluminescent טמון ביכולתם לכמת צמיחת גידול וגרור במחקרים ארוכים טווח מורכבים, שמסמך היה מעורב בשימוש בתאי סרטן אגרסיביים 4T1 שד. בגלל הליכים אלה מסתמכים על שילוב היציב של שני מבני כתב וציפראז, טכניקות אלה יכולים להיות מותאמות בקלות ותורגמו לשורות תאי סרטן אחרות של משתנה latencies סרטני ויכולות גרורתי. בדומה לתוצאות שהוצגו במסמך זה, חישוב RLRs הספציפי בתוך פיתוח גידולים ראשוניים והגרורים שלהם שלאט מאפשר זיהוי החלל ובזמן בזמן האמת של אירועי איתות ספציפיים שלהתרחש במהלך ההתקדמות גרורתית של גידולים ללא קשר לתקופת החביון שלהם. עם זיהוי של אירועים רגולטוריים פרומוטר ספציפיים, חשוב לבלו גם גידול הראשוני וגרורותיה לביצוע immunohistochemical הסטנדרטי ודיפרנציאליניתוח ביטוי גני l לאמת רגולציה דומה של הגן ו / או חלבון אנדוגני. מבחינה טכנית, האתגר העיקרי של ניתוחי bioluminescent כפולים טמון בתקופה הקצרה יחסית של אותות וציפראז renilla. ככזה, טכניקת הדמיה זו דורשת אופטימיזציה משמעותית של הליך הזרקת וריד הזנב, כמו גם הדמיה המיידית של חיות מוזרקות בנפרד, תהליך שצורך זמן ויחסית מעט יעיל לבלוציפראז גחלילית ההדמיה. לאחרונה, הציגה Promega &quot;Viviren&quot;, המייצג את מצע לוציפראז דור שני שאתרים של חמצון נחסמו על ידי esterification עד לכניסה זו מולקולת רווחים לתוך תאים, ובנקודה זו היא מולקולת מהירות דה אסטרי. באופן קולקטיבי, מצע הרומן הזה ביעילות מוריד אוטומטי הארה ולא ספציפי שינוי ו / או שפלה מצמיד עד 12 renilla-Induced אוטומטי הארה. בתוך כך, renill החדשמצע לוציפראז מייצר אותות זורחים בהירים, עם זאת, את העלויות העודפות הקשורות לרכישה ושימוש ב&quot; Viviren &quot;ספקו יחסית מעט מחקרים דרושים כדי להעריך את תכנית השירות הכולל של המצע הזה בניתוחי bioluminescent כפולים. לבסוף, הרגישות של כל assay bioluminescent היא ביקורתי תלויה המצלמה אופרנטית ברכישת יחידות אור בודדות CCD. אכן, כפי שהטכנולוגיות אלה לשפר, אנחנו חוזים נקודה בעתיד שבו היכולת שלנו לחזות את תגובות bioluminescent אור בתיווך מורכבים עשויה להתברר ביעילות בחיות חופשיות נעות 13.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] וקטור </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> מערכת Glomax Mult-idection </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> סדרת 200 IVIS </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td></td></tr><tr><td> מערכת Assay כפולה לוציפראז כתב </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelenterazine-h </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-luciferin K-סולט </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

ההבנה שלנו של איך ומתי מעבר תאי סרטן השד מגידולים ראשוניים שנקבעו לאתרים גרורתי גדל בקצב יוצא דופן מאז כניסתו של in vivo bioluminescent הדמית 1-3 טכנולוגיות. ואכן, היכולת לאתר ולכמת את צמיחת גידול longitudinally בקבוצה אחת של בעלי חיים להשלמת המחקר בניגוד להקרבת קבוצות בודדות של בעלי חיים בזמני assay ספציפיים חולל המהפכה באופן חוקרים לחקור גרורות סרטן השד. למרבה הצער, שיטות נוכחיות מונעות הערכה בזמן אמת של שינויים קריטיים שלהתרחש במערכות איתות של תאים כמו תאי סרטן שד (i) להתפתח בתוך גידולים ראשוניים, (ii) להפיץ בכל הגוף, וכן (iii) reinitiate תוכניות שגשוג באתרים של נגע גרורתי. עם זאת, הפיתוחים אחרונים בתחום הדמית bioluminescent עכשיו לעשות את זה אפשרי בו זמנית לכמת spatiotempor הספציפיאל שינויים בביטוי גנים כפונקציה של התפתחות גידול והתקדמות גרורתי באמצעות השימוש בתגובות הארת מצע כפולות. כדי לעשות זאת, חוקרים לנצל לשני אנזימי וציפראז אור לייצור שבודדו מהגחלילית (Photinus pyralis) וים האמנון והתמר (reniformis Renilla), אשר שניהם מגיבים למצעים סותרים שאפשרו בעבר השימוש נרחב-בתא במבחנה מבוססי מבחני כתב גני 4. כאן אנו מדגימים בשירות vivo של שני אנזימים כאלה שתגובת ההארה 1 מציינת במפורש את הגודל והמיקום של גידול מתפתח, תוך תגובת הזורח 2 משמשת אמצעי כדי להמחיש את מצב ההפעלה של מערכות איתות מסוימות במהלך שלבים שונים של גידול אלה והתפתחות גרורה. לפיכך, המטרות של מחקר זה הן כפולות. ראשית, נתאר את הצעדים הדרושים להקמת שורת תאים כפולה bioluminescent כתבזה, כמו גם אלו הנדרשים על מנת להקל את השימוש בם בחלל ובזמן לדמיין את הוויסות של ביטוי גנים בשלבים מסוימים של המפל גרורתי. שימוש במודל 4T1 של גרורות סרטן השד, אנו מראים כי בפעילות vivo של אלמנט כריכת Smad סינטטי (SBE) אמרגן היה ירידה דרמטית בגרורות ריאתי בהשוואה לזה שנמדד בגידול הראשוני 4-6. לאחרונה, גרורות סרטן השד הוצגו להיות מוסדרות על ידי שינויים במייקרו הגידול הראשוני וstroma תגובתי, כולל אלה המתרחשים בfibroblasts וחדירת תאי מערכת חיסון 7-9. לפיכך, המטרה השנייה שלנו תהיה להדגים את התועלת של טכניקות bioluminescent כפולות בניטור הגידול והלוקליזציה של שתי אוכלוסיות תאים ייחודיות קננו בתוך חיים אחד במהלך צמיחה וגרורות סרטן השד.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging at JoVE.com

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה וגרורותיהם<em&gt; In vivo</em&gt;.

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.4K Views.  Case Western Reserve University. להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה וגרורותיהם In vivo.

Video: In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Tumour Murine Bioluminescent כבדית דגם

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Dual-mode הדמיה של חמצון רקמות עורית ועל תפקוד כלי הדם

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

השרשה תוך גולגולתי עם 3D לאחר In vivo Bioluminescent הדמיה של gliomas Murine

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

השרשה ותוך גולגולת Stereotactic<em&gt; בחי</em&gt; הדמית bioluminescent של xenografts גידול במערכת מודל עכבר של multiforme glioblastoma

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

דגם orthotopic bioluminescent של התקדמות סרטן הלבלב

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

בעקבות כימותרפיה כלי דם רעילות - בזמן אמת<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של ירידת ערך כלי

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

אימות של Nanobody ונוגדנים מבוסס<em&gt; In vivo</em&gt; ניסויי גידול xenograft NIRF הדמיה בעכברים באמצעות<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytometry הזרימה ומיקרוסקופי

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...