Dissecção e isolamento das primeiras células-tronco hematopoéticas de camundongos saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região <ol><li> Antes de começar, é importante ter todos os reagentes e as ferramentas necessárias para o procedimento: <ul><li> Tesoura </li><li> Fórceps, tamanho 4, e grau cirúrgico com ponta dobrada fórceps, tamanho 5 / 45 (opcional) </li><li> 30 agulhas com seringa </li><li> 35mm e 100 milímetros placas de Petri </li><li> PBS com 10% e 20% de soro fetal bovino </li><li> e, finalmente, colagenase </li></ul></li><li> Para começar a dissecção, precisamos colher os cornos uterinos de uma fêmea grávida em 10,5 concepção pós dias. </li><li> Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados. Usamos asfixia de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical. </li><li> Abdômen da fêmea está molhado com etanol e da pele é aberto com uma tesoura. </li><li> Segurando a pele com uma pinça, cortes adicionais são feitas para abrir o peritônio. </li><li> O abdômen é aberto e os cornos uterinos podem ser visualizados. Utilizando uma pinça para segurar os cornos uterinos, corte cada extremidade distal e do centro de consumo tanto chifres. </li><li> Cornos uterinos são então colocados em uma placa de Petri contendo PBS frio com 10% de FBS de remoção dos tecidos uterinos. </li><li> Usando tamanho 4 pinças e trabalhando sob o microscópio, remova cuidadosamente a partir de tecido endometrial em torno de cada concepto embrião, tomando cuidado para não perfurar a placenta. </li><li> Depois de retirados, os embriões são colocados em um prato de doce com frio PBS e FBS 10%. </li><li> Remova cuidadosamente o tecido placentário para revelar o embrião envolto no saco vitelino, usando as pinças para cortar o embrião envolto saco vitelino longe da placenta em sua conjuntura. O saco vitelino contendo artérias vitelínico, e uma porção do cordão umbilical, pode ser gentilmente brincou longe do embrião e reserve na geladeira por dissociação. </li><li> O embrião é transferido para uma placa de Petri pequena, com níveis mínimos de PBS com FBS 10% - apenas o suficiente para molhar o embrião, mas não muito. Níveis ótimos manter o embrião estacionária enquanto a placa está lentamente agitada, mantendo-se o embrião firmemente no lugar durante a dissecção. </li><li> Mude para o 30 agulhas, que são usados ​​para remover as partes superiores e inferiores do embrião, cortando acima dos membros anteriores e abaixo dos membros posteriores. Tornando-se familiarizado com o uso das agulhas como instrumentos de corte pode ter alguma prática. Um método de uso repetido de pequenos cortes, atravessando as agulhas vão dissecar o tecido, com a agulha na mão dominante para agir como um guia de corte para a agulha que está na mão não-dominante. </li><li> Remover a parte dorsal do embrião. Este é o tecido que contém os somitos. Gentilmente cortar o tecido dorsal mais mantendo-se a uma distância suficiente da aorta (linha vermelha) para evitar qualquer Knicks. Corte da aorta resultaria em perda de sangue e pela incapacidade de visualizar facilmente a sua localização. Mais uma vez, fazendo pequenos cortes com as agulhas é vital para manter um local de corte preciso. </li><li> Empurrar o tecido extra para fora da vista e vire o embrião ao redor para cortar o tecido ventral, mais uma vez o corte o mais próximo da aorta quanto possível, sem knicking-lo. Cortes feitos muito longe de uma excelente localização resultaria em tecidos abdominal estar presente, o que pode ser removido uma vez que a AGM é isolado. </li><li> Posição do embrião com o lado dorsal para baixo ou as costas contra a placa. Suavemente splay o embrião aberto, empurrando os lados para baixo e visualizar a localização dos cumes gonadal. Estes estão localizados um pouco fora do centro, como tubo de estruturas semelhantes em ambos os lados da aorta. </li><li> Completar a dissecção, removendo o excesso de tecidos lado utilizando as técnicas de corte como antes. Uma vez que o tecido do lado do embrião é removido, então o embrião é virada de cabeça para baixo para remover o tecido lado restante. </li><li> Neste ponto, a AGM é inspecionado para qualquer excesso de tecido que pode ser removida facilmente com as agulhas sem lesão na aorta ou gônadas. Remover, tanto quanto o excesso resultados possíveis em melhor isolamento da população de células-tronco, uma vez que dependem de apenas uma célula de alguns marcadores de superfície para a purificação. </li><li> Usando a pinça de ponta curvada, gentilmente recolher cada AGM e coloque no frio PBS com FBS 10% até que esteja pronto para a dissociação. </li></ol> Dissociação e Análise FACS <ol><li> Para dissociar o tecido, sacos primeiro lugar gema e AGMs em tubos separados. </li><li> Girar rapidamente para tecidos pellet e descartar PBS com 10% de FBS. </li><li> Ressuspender tecidos colagenase 0,25% em PBS com FBS 20%, com volume suficiente para cobrir adequadamente os tecidos. </li><li> Incubar os tecidos a 37 graus. 25-30mins para AGMs e 35-40mins de gema de sacos. </li><li> No final da incubação, gentilmente pipeta tecidos para cima e para baixo para dissociação em suspensões única célula. </li><li> Lavar os tecidos com excesso de PBS wiº 10% FBS, agregar as células e ressuspender em fresco PBS estéril com 10% de FBS. </li><li> Para a análise FACS, as células são coradas de acordo com recomendações do fabricante. Nós usamos um FACSAria da BD Biosciences para executar citometria de fluxo. Devido ao tamanho e fragilidade das células embrionárias, a abertura de triagem é ajustado para um diâmetro maior do que para adultos células hematopoiéticas, que também estudo no laboratório. Da mesma forma, a pressão é ajustado para ser menor do que as condições exigidas pelo adulto células hematopoiéticas. Por exemplo, a triagem no FACSAria, o tamanho do bico seria 100 microns ea pressão espécie seria de 30 psi. </li><li> Para as análises de células-tronco, células positivas triple expressando a cKit marcadores, CD34, CD41 e são isoladas e classificadas a partir do saco vitelino e positivos duplo (cKit, CD34) são isolados a partir da AGM via FACS. Um gráfico típico ficaria assim: cKit células positivas são analisadas para CD34 e CD41 em simultâneo ou individualmente. Normalmente, células apresentam uma gradação de positividade para cada marcador com a população de células-tronco encontradas como um subconjunto das populações positivo. Estes gráficos mostram-nos que temos conseguido um bom rendimento celular com 100-300 células por saco vitelino e AGM por. </li></ol>

isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and agm

No embrião de rato, hematopoiese precoce ocorre simultaneamente em múltiplos órgãos, que inclui o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região. Estas regiões são fundamentais na definição do sistema sanguíneo nos embriões e leva ao movimento eventual de células-tronco no fígado fetal e, em seguida, o desenvolvimento de células-tronco adultas na medula óssea. Início de células-tronco hematopoéticas podem ser isolados a partir desses órgãos através da microdissecção do embrião seguido de triagem de citometria de fluxo para obter uma população mais puro. Ainda não está claro como estas populações de células-tronco contribuem para a piscina fetal e células-tronco adultas. Além disso, nosso laboratório investiga como as células-tronco no início funcionalmente diferem fetal e adulto de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, classifica o nosso laboratório de diferentes populações de células-tronco hematopoéticas e testar seu papel funcional no contexto de uma variedade de modelos genéticos. Neste vídeo, demonstramos o processo de micro-dissecção que utilizamos com freqüência e também mostrar os resultados de um plotfter FACS típico isolar estas populações raro, é possível executar uma variedade de testes funcionais, incluindo: testes de colônia e transplantes de medula óssea.

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Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

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Biology

14.6K visualizações.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.