Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

University of Utah School of Medicine

The yeast PHO2 gene encodes a homeodomain protein that exemplifies combinatorial control in transcriptional activation. Pho2 alone binds DNA in vitro with low affinity, but in vivo it activates transcription with at least three disparate DNA-binding proteins: the zinc finger protein Swi5, the helix-loop-helix factor Pho4, and Bas1, an myb-like activator. Pho2 + Swi5 activates HO, Pho2 + Pho4 activates PHO5, and Pho2 + Bas1 activates genes in the purine and histidine biosynthesis pathways. We have conducted a genetic screen and identified 23 single amino acid substitutions in Pho2 that differentially affect its ability to activate its specific target genes. Analysis of the mutations suggests that the central portion of Pho2 serves as protein-protein interactive surface, with a requirement for distinct amino acids for each partner protein.

Mutations in the pho2 (bas2) transcription factor that differentially affect activation with its partner proteins bas1, pho4, and swi5.

Le g&egrave;ne PHO2 de levure code pour une prot&eacute;ine de l&#39;hom&eacute;odomaine qui exemplifie contr&ocirc;le combinatoire dans l&#39;activation transcriptionnelle. Pho2 seul lie l&#39;ADN in vitro avec faible affinit&eacute;, mais in vivo, il active la transcription au moins trois prot&eacute;ines de liaison &agrave; l&#39;ADN disparates : la prot&eacute;ine de doigt de zinc Swi5, le facteur de l&#39;h&eacute;lice-boucle-h&eacute;lice Pho4 et Bas1, un activateur de myb-like. Pho2 + Swi5 active HO, Pho2 + Pho4 active PHO5 et Pho2 + Bas1 active les g&egrave;nes dans les voies de biosynth&egrave;se de la purine et histidine. Nous avons effectu&eacute; un d&eacute;pistage g&eacute;n&eacute;tique et identifi&eacute; 23 substitutions d&#39;acides amin&eacute;s unique dans Pho2 diff&eacute;rentiellement affecter sa capacit&eacute; &agrave; activer ses g&egrave;nes cibles sp&eacute;cifiques. L&#39;analyse des mutations sugg&egrave;re que la partie centrale du Pho2 sert de surface interactive de prot&eacute;ine-prot&eacute;ine, avec une exigence pour les acides amin&eacute;s distincts pour chaque prot&eacute;ine partenaire.

Des mutations dans le pho2 (bas2) facteur de transcription qui affectent diff&eacute;remment les activation avec son partenaire prot&eacute;ines bas1, pho4 et swi5.

Il gene PHO2 lievito codifica per una proteina di homeodomain che esemplifica il controllo combinatorio in attivazione trascrizionale. Pho2 solo si lega il DNA in vitro con bassa affinit&agrave;, ma in vivo che attiva la trascrizione con almeno tre disparati DNA-binding proteins: la proteina dito di zinco Swi5, il fattore helix-loop-helix Pho4 e Bas1, un attivatore myb-like. Pho2 + Swi5 attiva HO, Pho2 + Pho4 attiva PHO5, e Pho2 + Bas1 attiva geni nelle vie di biosintesi delle purine e istidina. Abbiamo condotto una schermata genetica e identificati 23 singolo aminoacidiche in Pho2 che differenzialmente influiscono sulla sua capacit&agrave; di attivare i geni bersaglio specifico. L&#39;analisi delle mutazioni suggerisce che la porzione centrale del Pho2 serve come superficie interattiva della proteina-proteina, con un requisito per gli amminoacidi distinti per ogni proteina partner.

Mutazioni nella pho2 (bas2) fattore di trascrizione che influenzano differenzialmente attivazione con i suoi partner proteine bas1, pho4 e swi5.

Plasmidi swap marcatore possono essere utilizzati per modificare i marcatori per geni perturbati con marcatori nutrizionali nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Descriviamo 18 nuovi plasmidi swap marcatore, e rivediamo anche altri plasmidi disponibili per le conversioni marcatore. Tutti questi plasmidi hanno regioni lunghi di identit&agrave; della sequenza di accompagnamento, e quindi l&#39;efficienza di ricombinazione omologa mediata dalla conversione di marker &egrave; molto alta. Marcatore swap permettono di eseguire facilmente croci per costruire doppi ceppi mutanti anche se ciascuno dei ceppi perturbati contiene l&#39;indicatore stesso, come &egrave; il caso con il marcatore KanMX utilizzato nell&#39;insieme lievito knockout. Marcatore swap utilizzabile anche per cambiare il marcatore selezionabile su plasmidi, eliminando la necessit&agrave; di subcloning.

Nuovi plasmidi &#39;swap marcatore&#39; per conversione marcatori selezionabili sul germogliamento lievito interruzioni gene e plasmidi.

Marker swap plasmids can be used to change markers for genes disrupted with nutritional markers in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We describe 18 new marker swap plasmids, and we also review other plasmids available for marker conversions. All of these plasmids have long regions of flanking sequence identity, and thus the efficiency of homologous recombination mediated by marker conversion is very high. Marker swaps allow one to easily perform crosses to construct double mutant strains even if each of the disrupted strains contains the same marker, as is the case with the KanMX marker used in the yeast knockout collection. Marker swaps can also be used to change the selectable marker on plasmids, eliminating the need for subcloning.

New 'marker swap' plasmids for converting selectable markers on budding yeast gene disruptions and plasmids.

Plasmides de marqueur swap peuvent &ecirc;tre utilis&eacute;s pour modifier les marqueurs de g&egrave;nes perturb&eacute;s avec marqueurs nutritionnels chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous d&eacute;crivons les 18 nouveaux plasmides swap de marqueur, et nous passons en revue &eacute;galement autres plasmides disponibles pour les conversions de marqueur. Toutes ces plasmides ont longues r&eacute;gions de flanquement d&#39;identit&eacute;, et donc l&#39;efficacit&eacute; de la recombinaison m&eacute;di&eacute;e par conversion de marqueur est tr&egrave;s &eacute;lev&eacute;. Swaps de marqueur permettent d&#39;effectuer facilement des croisements pour construire des souches mutantes doubles m&ecirc;me si chacune des souches perturb&eacute;s contient le m&ecirc;me rep&egrave;re, comme c&#39;est le cas avec le marqueur de KanMX utilis&eacute; pour la collecte de knockout de levure. Swaps de marqueur permet &eacute;galement de modifier le marqueur de s&eacute;lection sur les plasmides, &eacute;liminant le besoin de subcloning.

Nouveaux plasmides &laquo; swap marqueur &raquo; pour la conversion des marqueurs s&eacute;lectionnables sur bourgeonnement levure disruptions GENIQUES et plasmides.

Changes in developmental state: demolish the old to construct the new.

Changements dans l&#39;&eacute;tat du d&eacute;veloppement : d&eacute;molir l&#39;ancien pour construire la nouvelle.

Cambiamenti nello stato dello sviluppo: demolire il vecchio per costruire il nuovo.

Mutations in the RAM network genes, including CBK1, MOB2, KIC1, HYM1, and TAO3, cause defects in bud site selection, asymmetric apical growth, and mating projections. Additionally, these mutants show altered colony morphology, cell separation defects, and reduced CTS1 expression, phenotypes also seen by mutating the Ace2 transcription factor. We show that an ACE2 multicopy plasmid suppresses the latter three defects of RAM network mutations, demonstrating that Ace2 is downstream of the RAM network and suggesting that these phenotypes are caused by reduced expression of Ace2 target genes. We show that wild-type W303 strains have a bud4 mutation and that combining bud4 with either ace2 or cbk1 in haploids results in altered colony morphology. We describe a timed sedimentation assay that allows quantitation of cytokinesis defects and subtle changes in budding pattern and cell shape. Experiments examining budding patterns and sedimentation rates both show that Ace2 and Cbk1 have independent functions in addition to their common pathway in transcription of genes such as CTS1. SWI5 encodes a transcription factor paralogous to ACE2. Additive effects are seen in cbk1 swi5 strains, and we show that activation of some target genes, such as EGT2, requires either Swi5 or Ace2 with Cbk1. The relative roles and interactions of Ace2, Cbk1, and Bud4 in bud site selection, polarized growth, and cell separation are discussed.

ACE2, CBK1, and BUD4 in budding and cell separation.

Des mutations dans les g&egrave;nes du r&eacute;seau RAM, notamment CBK1, MOB2, KIC1, HYM1 et TAO3, entra&icirc;nent des d&eacute;fauts dans la s&eacute;lection de sites de bourgeon, croissance apicale asym&eacute;trique et des projections accouplements. En outre, ces mutants montrent la morphologie des colonies alt&eacute;r&eacute;e, cellule des d&eacute;fauts de la s&eacute;paration et r&eacute;duction de l&#39;expression CTS1, ph&eacute;notypes &eacute;galement vus par mutation du facteur de transcription ECA2. Nous montrons qu&#39;un plasmide multicopy ACE2 supprime ce dernier trois d&eacute;fauts de mutations de r&eacute;seau RAM, d&eacute;montrant que Ace2 est en aval du r&eacute;seau RAM et en sugg&eacute;rant que ces ph&eacute;notypes sont caus&eacute;es par la r&eacute;duction de l&#39;expression de g&egrave;nes cibles ECA2. Nous montrent que les souches sauvages W303 ont une mutation de bud4 et que bud4 combinaison avec ace2 ou cbk1 dans les r&eacute;sultats de haplo&iuml;des dans la morphologie des colonies alt&eacute;r&eacute;e. Nous d&eacute;crivons un essai chronom&eacute;tr&eacute; de s&eacute;dimentation qui permet la quantification de la cytokin&egrave;se d&eacute;fauts et des changements subtils dans en herbe forme de motif et de la cellule. Exp&eacute;riences examinant la s&eacute;dimentation et les mod&egrave;les en herbe tarifs les deux montrent que Ace2 et Cbk1 ont des fonctions ind&eacute;pendantes en plus de leur voie commune dans la transcription de g&egrave;nes tels que CTS1. SWI5 code pour un facteur de transcription paralogue &agrave; ACE2. Effets additifs sont observ&eacute;es chez les souches swi5 cbk1, et nous montrons que l&#39;activation de certains g&egrave;nes cibles, tels que EGT2, requiert Swi5 ou ECA2 avec Cbk1. Les auteurs discutent les r&ocirc;les relatifs et les interactions de Ace2, Cbk1 et Bud4 dans le choix du site de bourgeon, la croissance polaris&eacute;e et la s&eacute;paration des cellules.

Ace2, CBK1 et BUD4 dans la s&eacute;paration en herbe et de la cellule.

Mutazioni nei geni RAM rete, tra cui CBK1, MOB2, KIC1, HYM1 e TAO3, causano difetti nella selezione del sito bud, asimmetrica crescita apicale e proiezioni degli amori. Inoltre, questi mutanti Visualizza Colonia alterata morfologia, cella separazione difetti e ridotta espressione di CTS1, fenotipi anche visti da mutazione del fattore di trascrizione Ace2. Dimostriamo che un plasmide gestisce ACE2 elimina i difetti di quest&#39;ultimi tre delle mutazioni di rete RAM, dimostrando che Ace2 &egrave; a valle della rete RAM e suggerendo che questi fenotipi sono causati da ridotta espressione dei geni bersaglio Ace2. Dimostriamo che il selvaggio-tipo W303 ceppi hanno una mutazione di bud4 e quello bud4 combinazione con ace2 o cbk1 risultati aploidi in morfologia alterata di Colonia. Descriviamo un dosaggio temporizzato di sedimentazione che permette la quantificazione della Citocinesi in difetti e sottili cambiamenti in erba forma delle cellule e pattern. Esperimenti esaminando la sedimentazione e modelli in erba prezzi entrambi Visualizza Ace2 e Cbk1 hanno funzioni indipendenti oltre al loro percorso comune nella trascrizione dei geni come CTS1. SWI5 codifica per un fattore di trascrizione paralogous a ACE2. Effetti additivi sono visti in cbk1 swi5 ceppi, e ci mostrano che l&#39;attivazione di alcuni geni bersaglio, ad esempio EGT2, richiede Swi5 o Ace2 con Cbk1. I relativi ruoli e interazioni di Ace2, Cbk1 e Bud4 nella selezione del sito bud, crescita polarizzata e separazione delle cellule sono discussi.

ACE2, CBK1 e BUD4 nella separazione delle cellule e in erba.

Fattori di trascrizione con identica specificit&agrave; di DNA-binding spesso attivano diversi geni in vivo. Ace2 lievito e Swi5 sono tali attivatori, con obiettivi classifichiamo come Swi5-only, Ace2, o entrambi. Definiamo due modi unici di regolamentazione. ACE2 e Swi5 entrambi legano in vitro di geni solo Swi5 come HO, ma solo Swi5 si lega e attiva in vivo. Al contrario, Ace2 e Swi5 entrambi si legano in vivo di geni solo Ace2, come CTS1, ma associato a promotore Swi5 non riesce ad attivare. Mostriamo che attivazione da Swi5 &egrave; impedito dall&#39;associazione di Forkhead fattori Fkh1 e Fkh2, che recluta la Rpd3(Large) dell&#39;istone deacetylase del complesso al promotore CTS1. Analisi globale dimostra che tutti i geni solo Ace2 sono vincolati da Ace2 sia Swi5 e anche da Fkh1/2. Geni normalmente attivati da Ace2 o Swi5 possono essere convertiti in geni Ace2-solo con l&#39;inserimento di siti Fkh-associazione. Cos&igrave; Fkh proteine, che inizialmente la funzione di attivare SWI5 e ACE2, successivamente la funzione antiactivators Swi5 specifici.

Proteine forkhead controllano il risultato dell&#39;associazione di fattore di trascrizione antiactivation.

Transcription factors with identical DNA-binding specificity often activate different genes in vivo. Yeast Ace2 and Swi5 are such activators, with targets we classify as Swi5-only, Ace2-only, or both. We define two unique regulatory modes. Ace2 and Swi5 both bind in vitro to Swi5-only genes such as HO, but only Swi5 binds and activates in vivo. In contrast, Ace2 and Swi5 both bind in vivo to Ace2-only genes, such as CTS1, but promoter-bound Swi5 fails to activate. We show that activation by Swi5 is prevented by the binding of the Forkhead factors Fkh1 and Fkh2, which recruit the Rpd3(Large) histone deacetylase complex to the CTS1 promoter. Global analysis shows that all Ace2-only genes are bound by both Ace2 and Swi5, and also by Fkh1/2. Genes normally activated by either Ace2 or Swi5 can be converted to Ace2-only genes by the insertion of Fkh-binding sites. Thus Fkh proteins, which function initially to activate SWI5 and ACE2, subsequently function as Swi5-specific antiactivators.

Forkhead proteins control the outcome of transcription factor binding by antiactivation.

Facteurs de transcription avec la sp&eacute;cificit&eacute; de liaison &agrave; l&#39;ADN identique activent souvent diff&eacute;rents g&egrave;nes in vivo. Levure Ace2 et Swi5 sont des activateurs, avec des objectifs que nous classons en Swi5 seule, ECA2 seulement, ou les deux. Nous d&eacute;finissons deux modes de r&eacute;glementation uniques. Ace2 et Swi5 fois lient in vitro des g&egrave;nes Swi5 uniquement comme HO, mais seulement Swi5 se lie et active in vivo. En revanche, ECA2 et Swi5 fois lient in vivo aux g&egrave;nes Ace2 uniquement, tels que CTS1, mais li&eacute; aux promoteur Swi5 ne parvient pas &agrave; activer. Nous montrons que l&#39;activation par Swi5 emp&ecirc;che la liaison de la Forkhead facteurs Fkh1 et Fkh2, qui recrutent les histones Rpd3(Large) d&eacute;sac&eacute;tylase complexe sur le promoteur CTS1. Analyse globale montre que tous les g&egrave;nes Ace2 uniquement li&eacute;s par ECA2 et Swi5 et aussi par Fkh1/2. G&egrave;nes normalement activ&eacute;s par ECA2 ou Swi5 peuvent &ecirc;tre convertis en g&egrave;nes Ace2 uniquement par l&#39;insertion de Fkh-accepteurs. Ainsi les prot&eacute;ines Fkh, qui fonctionnent au d&eacute;part pour activer SWI5 et ECA2, fonctionnent par la suite comme antiactivators Swi5 sp&eacute;cifiques.

Prot&eacute;ines de forkhead contr&ocirc;lent le r&eacute;sultat de la liaison de facteur de transcription d&#39;antiactivation.

Previous studies have revealed many parallels in the cell cycle regulation of the Ace2 and Swi5 transcription factors. Although both proteins begin entry into the nucleus near the start of mitosis, here we show that Ace2 accumulates in the nucleus and binds DNA about 10 min later in the cell cycle than Swi5. We used chimeric fusions to identify the N-terminal region of Ace2 as responsible for the delay, and this same region of Ace2 was required for interaction with Cbk1, a kinase necessary for both transcriptional activation by Ace2 and asymmetric distribution of Ace2. Ace2 and Swi5 also showed differences in prevalence during the cell cycle. Swi5 is apparently degraded soon after nuclear entry, whereas constant Ace2 levels throughout the cell cycle suggest Ace2 is exported from the nucleus. Our work suggests that the precise timing of Ace2 accumulation in the nucleus involves both a nuclear export sequence and a nuclear localization signal, whose activities are regulated by phosphorylation.

Regulation of the yeast Ace2 transcription factor during the cell cycle.

Des &eacute;tudes ant&eacute;rieures ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; de nombreux parall&egrave;les dans la r&eacute;gulation du cycle cellulaire des facteurs de transcription Ace2 et Swi5. Bien que les deux prot&eacute;ines commencent &agrave; p&eacute;n&eacute;trer le noyau peu apr&egrave;s le d&eacute;but de la mitose, nous d&eacute;montrons que Ace2 s&#39;accumule dans le noyau et lie l&#39;ADN environ 10 min plus tard dans le cycle cellulaire que Swi5. Nous avons utilis&eacute; des fusions de chim&eacute;riques d&#39;identifier la r&eacute;gion N-terminale de Ace2 comme responsable du retard, et cette m&ecirc;me r&eacute;gion de Ace2 &eacute;tait n&eacute;cessaire pour l&#39;interaction avec Cbk1, une kinase n&eacute;cessaire pour les deux l&#39;activation transcriptionnelle de Ace2 et une distribution asym&eacute;trique de Ace2. Ace2 et Swi5 ont aussi montr&eacute; des diff&eacute;rences dans la pr&eacute;valence au cours du cycle cellulaire. Swi5 se d&eacute;grade apparemment peu apr&egrave;s l&#39;entr&eacute;e de nucl&eacute;aire, alors que les niveaux de Ace2 constants tout au long du cycle cellulaire sugg&egrave;rent qu&#39;ace2 est export&eacute; du noyau. Notre travail sugg&egrave;re que le calendrier pr&eacute;cis de Ace2 accumulation dans le noyau implique &agrave; la fois une s&eacute;quence d&#39;exportations nucl&eacute;aires et un signal de localisation nucl&eacute;aire, dont les activit&eacute;s sont r&eacute;glement&eacute;es par la phosphorylation.

R&egrave;glement du facteur de transcription levure Ace2 durant le cycle cellulaire.

Studi precedenti hanno rivelato molti paralleli nella regolazione dei fattori di trascrizione Ace2 e Swi5 ciclo cellulare. Sebbene entrambe le proteine iniziano in entrata il nucleo vicino all&#39;inizio della mitosi, qui mostriamo che Ace2 si accumula nel nucleo e si lega il DNA circa 10 min pi&ugrave; tardi nel ciclo cellulare pi&ugrave; Swi5. Abbiamo usato chimerici fusioni per identificare la regione N-terminale di Ace2 come responsabile per il ritardo, e questa stessa regione di Ace2 &egrave; stato richiesta per l&#39;interazione con Cbk1, una chinasi necessaria per entrambi attivazione trascrizionale di Ace2 e distribuzione asimmetrica di Ace2. ACE2 e Swi5 inoltre ha mostrato differenze in prevalenza durante il ciclo cellulare. Swi5 &egrave; apparentemente degradato subito dopo la voce nucleare, considerando che i livelli di Ace2 costanti per tutto il ciclo cellulare suggeriscono che ACE2 viene esportato dal nucleo. Il nostro lavoro suggerisce che i tempi precisi di accumulo Ace2 nel nucleo comporta una sequenza di esportazione nucleare sia un segnale nucleare di localizzazione, le cui attivit&agrave; sono regolate da fosforilazione.

Regolazione del fattore di trascrizione lievito Ace2 durante il ciclo cellulare.

We have created a resource to rapidly map genetic traits to specific chromosomes in yeast. This mapping is done using a set of 16 yeast strains each containing a different chromosome with a conditionally functional centromere. Conditional centromere function is achieved by integration of a GAL1 promoter in cis to centromere sequences. We show that the 16 yeast chromosomes can be individually lost in diploid strains, which become hemizygous for the destabilized chromosome. Interestingly, most 2n - 1 strains endoduplicate and become 2n. We also demonstrate how chromosome loss in this set of strains can be used to map both recessive and dominant markers to specific chromosomes. In addition, we show that this method can be used to rapidly validate gene assignments from screens of strain libraries such as the yeast gene disruption collection.

Chromosome-scale genetic mapping using a set of 16 conditionally stable Saccharomyces cerevisiae chromosomes.

Nous avons cr&eacute;&eacute; une ressource pour mapper rapidement des traits g&eacute;n&eacute;tiques &agrave; des chromosomes sp&eacute;cifiques chez la levure. Ce mappage s&#39;effectue &agrave; l&#39;aide d&#39;un ensemble de levure 16 souches chacun contenant un chromosome diff&eacute;rent avec un centrom&egrave;re sous condition fonctionnel. Fonction conditionnelle centrom&egrave;re est obtenue par int&eacute;gration d&#39;un promoteur GAL1 dans cis aux s&eacute;quences du centrom&egrave;re. Nous montrons que les 16 chromosomes de levure peuvent &ecirc;tre individuellement perdus dans les souches diplo&iuml;des, qui deviennent les h&eacute;mizygotes pour le chromosome d&eacute;stabilis&eacute;. Fait int&eacute;ressant, la plupart 2n - 1 souches endoduplicate et devenir 2n. Nous montrons aussi comment perte de chromosomes dans cette s&eacute;rie de souches peut &ecirc;tre utilis&eacute; pour mapper les marqueurs r&eacute;cessives et dominantes &agrave; des chromosomes sp&eacute;cifiques. En outre, nous montrons que cette m&eacute;thode peut &ecirc;tre utilis&eacute;e pour valider rapidement les affectations de la g&egrave;ne &agrave; partir des &eacute;crans des biblioth&egrave;ques de souche comme la collection de perturbation de g&egrave;ne de levure.

Chromosome-&eacute;chelle g&eacute;n&eacute;tique de mappage &agrave; l&#39;aide d&#39;un ensemble de 16 conditionnellement stables Saccharomyces cerevisiae chromosomes.

Abbiamo creato una risorsa per mappare rapidamente tratti genetici specifici cromosomi in lievito. Questo mapping viene eseguito utilizzando un set di lievito 16 ceppi ciascuno contenente un cromosoma diverso con un centromero condizionalmente funzionale. Funzione condizionale centromero &egrave; ottenuta dall&#39;integrazione di un promotore GAL1 in cis sequenze centromero. Mostriamo che i 16 cromosomi di lievito possono essere perso individualmente in ceppi diploidi, che diventano emizigoti per il cromosoma destabilizzato. &Egrave; interessante notare che, la maggior parte delle 2n - 1 ceppi endoduplicate e diventare 2n. Abbiamo anche dimostrare come la perdita del cromosoma in questo insieme di ceppi pu&ograve; essere utilizzato per mappare sia recessive e dominante marcatori specifici cromosomi. Inoltre, ci mostrano che questo metodo pu&ograve; essere utilizzato per convalidare velocemente le assegnazioni gene da schermi di librerie di ceppo come l&#39;insieme di perturbazione gene lievito.

Cromosoma-scala genetica mapping utilizzando un set di 16 condizionatamente stabili Saccharomyces cerevisiae cromosomi.

Cells devote considerable resources to nutrient homeostasis, involving nutrient surveillance, acquisition, and storage at physiologically relevant concentrations. Many Saccharomyces cerevisiae transcripts coding for proteins with nutrient uptake functions exhibit peak periodic accumulation during M phase, indicating that an important aspect of nutrient homeostasis involves transcriptional regulation. Inorganic phosphate is a central macronutrient that we have previously shown oscillates inversely with mitotic activation of PHO5. The mechanism of this periodic cell cycle expression remains unknown. To date, only two sequence-specific activators, Pho4 and Pho2, were known to induce PHO5 transcription. We provide here evidence that Mcm1, a MADS-box protein, is essential for PHO5 mitotic activation. In addition, we found that cells simultaneously lacking the forkhead proteins, Fkh1 and Fkh2, exhibited a 2.5-fold decrease in PHO5 expression. The Mcm1-Fkh2 complex, first shown to transactivate genes within the CLB2 cluster that drive G(2)/M progression, also associated directly at the PHO5 promoter in a cell cycle-dependent manner in chromatin immunoprecipitation assays. Sds3, a component specific to the Rpd3L histone deacetylase complex, was also recruited to PHO5 in G(1). These findings provide (i) further mechanistic insight into PHO5 mitotic activation, (ii) demonstrate that Mcm1-Fkh2 can function combinatorially with other activators to yield late M/G(1) induction, and (iii) couple the mitotic cell cycle progression machinery to cellular phosphate homeostasis.

Coupling phosphate homeostasis to cell cycle-specific transcription: mitotic activation of Saccharomyces cerevisiae PHO5 by Mcm1 and Forkhead proteins.

Cellules consacrent des ressources consid&eacute;rables &agrave; l&#39;hom&eacute;ostasie des &eacute;l&eacute;ments nutritifs, impliquant la surveillance des &eacute;l&eacute;ments nutritifs, acquisition et stockage physiologiquement aux concentrations. Nombreuses transcriptions de cerevisiae Saccharomyces codant pour des prot&eacute;ines avec des fonctions d&#39;absorption des &eacute;l&eacute;ments nutritifs pi&egrave;ce accumulation p&eacute;riodique de pointe au cours de la phase M, indiquant qu&#39;un aspect important de l&#39;hom&eacute;ostasie des &eacute;l&eacute;ments nutritifs comprend r&eacute;gulation transcriptionnelle. Phosphate inorganique est une centrale pour les macronutriments que nous avons d&eacute;j&agrave; montr&eacute; oscille inversement avec activation mitotique de PHO5. Le m&eacute;canisme de cette expression p&eacute;riodique cycle cellulaire reste inconnu. A ce jour, seuls deux activateurs de s&eacute;quence-sp&eacute;cifique, Pho4 et Pho2, &eacute;taient connus pour induire la transcription PHO5. Nous montrons ici que Mcm1, une prot&eacute;ine MADS-box, est essentielle pour l&#39;activation mitotique PHO5. En outre, nous avons constat&eacute; que les cellules d&eacute;pourvues simultan&eacute;ment les prot&eacute;ines forkhead, Fkh1 et Fkh2, montraient une 2.5-fold diminution PHO5 expression. Le complexe Mcm1-Fkh2, tout d&#39;abord d&eacute;montr&eacute; que transactiver de g&egrave;nes au sein du cluster CLB2 qui animent la progression/m G (2), &eacute;galement li&eacute; directement au promoteur PHO5 dans une mani&egrave;re d&eacute;pendante du cycle cellulaire dans les dosages de l&#39;immunopr&eacute;cipitation de la chromatine. SDD3, un composant sp&eacute;cifique &agrave; le Rpd3L histone d&eacute;sac&eacute;tylase complexe, a &eacute;t&eacute; &eacute;galement recrut&eacute; &agrave; PHO5 en g (1). Ces r&eacute;sultats donnent un (i) plus m&eacute;caniste aper&ccedil;u PHO5 activation mitotique, (ii) d&eacute;montrer que Mcm1-Fkh2 peut fonctionner combinatoirement avec autres activateurs &agrave; c&eacute;der fin M/G(1) induction et (iii) le m&eacute;canisme de progression du cycle cellulaire mitotique &agrave; l&#39;hom&eacute;ostasie du phosphate cellulaire en couple.

Couplage de l&#39;hom&eacute;ostasie du phosphate &agrave; transcription cycle cellulaire sp&eacute;cifique : activation mitotique de Saccharomyces cerevisiae PHO5 de prot&eacute;ines Mcm1 et Forkhead.

Cellule dedicano risorse considerevoli all&#39;omeostasi nutritiva, che comportano la sorveglianza nutrizionale, acquisizione e archiviazione a concentrazioni fisiologicamente rilevanti. Molte trascrizioni di Saccharomyces cerevisiae che codifica per le proteine con funzioni di assorbimento dei nutrienti presentano accumulo periodico picco durante la fase M, che indica che un aspetto importante dell&#39;omeostasi nutrienti comporta la regolazione trascrizionale. Fosfato inorganico &egrave; un macronutriente centrale che abbiamo dimostrato in precedenza oscilla inversamente con attivazione mitotica di PHO5. Il meccanismo di questa espressione periodico ciclo cellulare rimane sconosciuto. Ad oggi, solo due sequenza-specifici attivatori, Pho4 e Pho2, erano noti per indurre la trascrizione di PHO5. Qui forniamo prove che Mcm1, una proteina di MADS-box, &egrave; essenziale per l&#39;attivazione mitotica PHO5. Inoltre, abbiamo scoperto che cellule contemporaneamente mancano le proteine forkhead, Fkh1 e Fkh2, esposta una d&#39; diminuzione espressione PHO5. Il complesso Mcm1-Fkh2, per la prima volta a transactivate i geni all&#39;interno del cluster CLB2 che guidano la progressione m G (2), connesso anche direttamente presso il promotore di PHO5 in modo dipendente dal ciclo cellulare in dosaggi di immunoprecipitazione della cromatina. Sds3, un componente specifico per il deacetylase dell&#39;istone Rpd3L complesso, &egrave; stato reclutato anche per PHO5 in g (1). Questi risultati forniscono (i) ulteriormente meccanicistico in PHO5 attivazione mitotica, (ii) dimostrare che Mcm1-Fkh2 pu&ograve; funzionare combinatoriamente con altri attivatori resa fine M/G(1) ad induzione, e (iii) coppia il macchinario di progressione mitotica ciclo cellulare per l&#39;omeostasi cellulare fosfato.

Omeostasi del fosfato di accoppiamento alla trascrizione specifici del ciclo cellulare: mitosi attivazione di Saccharomyces cerevisiae PHO5 di proteine Mcm1 e Forkhead.

Transcription factor binding sites are found in either nucleosome-free or nucleosome-embedded locations, thus in vivo relationships between nucleosome position and gene activation are not fully understood. In this issue of Developmental Cell, Bai et al. show that binding sites located in nucleosome depleted regions guarantee high reliability, not amplitude, of promoter firing.

First time, every time: nucleosomes at a promoter can determine the probability of gene activation.

Sites de liaison de facteurs de transcription sont trouvent en soit exempt de nucl&eacute;osomes ou endroits incorpor&eacute;s nucl&eacute;osome, relations ainsi in vivo entre la position des nucl&eacute;osomes et l&#39;activation de g&egrave;nes ne sont pas totalement comprises. Dans ce num&eacute;ro de Developmental Cell, spectacle de Bai et coll. que sites de fixation situ&eacute; au nucl&eacute;osome appauvri r&eacute;gions garantie fiabilit&eacute; &eacute;lev&eacute;e, pas l&#39;amplitude, du promoteur de tir.

La premi&egrave;re fois, chaque fois : nucl&eacute;osomes &agrave; un promoteur peuvent d&eacute;terminer la probabilit&eacute; de l&#39;activation de g&egrave;nes.

Siti di legame del fattore trascrizione sono trovati in entrambi nucleosome-libero o incorporato nucleosome posizioni, cos&igrave; in vivo relazioni tra posizione nucleosome e attivazione del gene non sono completamente chiari. In questo numero di cellulare dello sviluppo, Bai et al Visualizza che siti di legame si trovano nel nucleosoma impoverito regioni garanzia di elevata affidabilit&agrave;, non di ampiezza, di promotore di infornamento.

Warren P. Voth

Department of Pathology

University of Utah School of Medicine

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Warren P. Voth

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University of Utah School of Medicine

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Department of Pathology