<em>piggyBac</em> Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Baylor College of Medicine 

Transfert de g&egrave;ne de cellules somatiques a permis l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles in vivo par co-infection du virus multiples. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se que le syst&egrave;me de transposon hautement efficace ax&eacute;e sur le plasmide piggyBac permettrait l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles &agrave; long terme chez la souris in vivo. Nous avons utilis&eacute; une strat&eacute;gie multiple-transposon livraison pour cr&eacute;er un syst&egrave;me d&#39;expression inductible par la t&eacute;tracycline in vitro dans les cellules humaines en livrant les deux g&egrave;nes sur transposons distincts pour l&#39;expression du g&egrave;ne rapporteur inductible avec un marqueur de transposon s&eacute;lectionnable distinct. &Eacute;valuation de lign&eacute;es cellulaires stables a r&eacute;v&eacute;l&eacute; 100 % de clones s&eacute;lectionn&eacute;s expos&eacute; expression inductible via expression stable de trois transposons distincts simultan&eacute;ment. Ensuite, nous avons v&eacute;rifi&eacute; et constat&eacute; que transfert de g&egrave;nes piggyBac au foie ou des poumons pouvait atteindre expression du g&egrave;ne rapporteur stable chez les souris in vivo chez les animaux d&eacute;ficients immunitaires ou immunocomp&eacute;tents. Une seule injection de transposons piggyBac pouvait r&eacute;aliser l&#39;expression de g&egrave;ne inductible &agrave; long terme dans le foie de souris in vivo, confirmant notre strat&eacute;gie multiple-transposon utilis&eacute; dans des cellules cultiv&eacute;es. Le syst&egrave;me de transposon ax&eacute;e sur le plasmide piggyBac permet l&#39;expression des g&egrave;nes constitutive ou inductible in vivo pour des applications th&eacute;rapeutiques et biologiques potentielles sans l&#39;utilisation de vecteurs viraux.

PiggyBac l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles ax&eacute;e sur le transposon in vivo apr&egrave;s transfert de g&egrave;nes de cellules somatiques.

Somatic cell gene transfer has permitted inducible gene expression in vivo through coinfection of multiple viruses. We hypothesized that the highly efficient plasmid-based piggyBac transposon system would enable long-term inducible gene expression in mice in vivo. We used a multiple-transposon delivery strategy to create a tetracycline-inducible expression system in vitro in human cells by delivering the two genes on separate transposons for inducible reporter gene expression along with a separate selectable transposon marker. Evaluation of stable cell lines revealed 100% of selected clones exhibited inducible expression via stable expression from three separate transposons simultaneously. We next tested and found that piggyBac-mediated gene transfer to liver or lung could achieve stable reporter gene expression in mice in vivo in either immunocompetent or immune deficient animals. A single injection of piggyBac transposons could achieve long-term inducible gene expression in the livers of mice in vivo, confirming our multiple-transposon strategy used in cultured cells. The plasmid-based piggyBac transposon system enables constitutive or inducible gene expression in vivo for potential therapeutic and biological applications without using viral vectors.

PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.

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PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#x8868;&#x8FBE;&#x540E;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x3002;

Somatische Gentransfer erlaubte durch Induktion Genexpression in-vivo durch Coinfection mehrere Viren. Wir die Hypothese, dass das hocheffiziente Plasmid-basierte PiggyBac-Transposon-System langfristig durch Induktion Genexpression bei M&auml;usen in-vivo erm&ouml;glichen w&uuml;rde. Wir verwendeten eine Multiple-Transposon-Lieferung-Strategie ein Tetracyclin-inducible Ausdruck-System in den menschlichen Zellen in-vitro-schaffen, durch die Bereitstellung von zwei Gene auf separaten Transposonen f&uuml;r Induktion Reporter Genexpression zusammen mit einem separaten w&auml;hlbar Transposon-Marker. Auswertung von stabilen Zelllinien ergab, dass 100 % der ausgew&auml;hlten Klone durch Induktion Ausdruck durch den stabilen Ausdruck aus drei separaten Transposonen gleichzeitig ausgestellt. Wir als n&auml;chstes getestet und festgestellt, dass PiggyBac-vermittelte Gentransfer, Leber oder Lunge stabil Reporter Genexpression bei M&auml;usen in-vivo in immunkompetenten oder immun mangelhaft Tiere erreichen konnten. Eine einzige Injektion von PiggyBac Transposonen erreichen konnte langfristig durch Induktion Genexpression in der Leber von M&auml;usen in vivo best&auml;tigen unsere Strategie des Multiple-Transposon in kultivierten Zellen verwendet. Das Plasmid-basierte PiggyBac-Transposon-System erm&ouml;glicht konstitutive oder durch Induktion Genexpression in-vivo f&uuml;r m&ouml;gliche therapeutische und biologische Anwendungen ohne Verwendung von virale Vektoren.

PiggyBac Transposon-basierte durch Induktion Genexpression in-vivo nach somatische Gentransfer.

Trasferimento genico delle cellule somatiche &egrave; consentito inducible gene expression in vivo attraverso coinfezioni di pi&ugrave; virus. Abbiamo ipotizzato che il sistema di Trasposone altamente efficiente basata su plasmide piggyBac consentirebbe a lungo termine espressione inducible gene nel topo in vivo. Abbiamo usato una strategia multipla-trasposone consegna per creare un sistema di espressione inducibile tetraciclina in vitro nelle cellule umane consegnando i due geni su trasposoni separati per l&#39;espressione del gene reporter viscoelastico insieme a un indicatore separato Trasposone selezionabile. Valutazione delle variet&agrave; di cellula stabili ha rivelato il 100% dei cloni selezionati esposto espressione inducibile via espressione stabile da tre distinti trasposoni simultaneamente. Abbiamo quindi testato e trovato che piggyBac-mediata del gene transfer al fegato o polmone potrebbe raggiungere i espressione del gene reporter stabile nel topo in vivo negli animali carenti o immunitarie o immuni. Una singola iniezione di piggyBac trasposoni potrebbe raggiungere a lungo termine espressione inducible gene nel fegato di topo in vivo, che conferma la nostra strategia di multiplo-trasposone utilizzato in cellule in coltura. Il sistema di transposon piggyBac plasmide-based permette espressione genica costitutiva o inducibile in vivo per le potenziali applicazioni terapeutiche e biologiche senza l&#39;utilizzo di vettori virali.

PiggyBac basata su trasposone inducible gene expression in vivo dopo il trasferimento di geni di cellule somatiche.

&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x306F;&#x3001;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E; in vivo &#x8907;&#x6570;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x91CD;&#x611F;&#x67D3;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9577;&#x671F;&#x306E;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; in vivo &#x3067;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x306A;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C3;&#x30C9; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3060;&#x308D;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8907;&#x6570;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x914D;&#x4FE1;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x8A98;&#x5C0E;&#x767A;&#x73FE;&#x7CFB; in vitro &#x3067;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x5225;&#x3005; &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x500B;&#x5225;&#x9078;&#x629E;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x8A98;&#x5C0E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x4E0A;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x30BB;&#x30EB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30F3;&#x306E; 100 &#xFF05; &#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x5F0F; 3 &#x3064;&#x306E;&#x5225;&#x3005; &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x767A;&#x73FE;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3092;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x5C55;&#x793A;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6B21;&#x306B;&#x3001;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x3001;&#x809D;&#x81D3;&#x3084;&#x80BA;&#x3078;&#x306E; piggyBac &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x514D;&#x75AB;&#x62C5;&#x5F53;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x514D;&#x75AB;&#x6B20;&#x4E4F;&#x52D5;&#x7269;&#x306E;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x306E;&#x5358;&#x56DE;&#x6295;&#x4E0E;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x57F9;&#x990A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5F53;&#x793E;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D3;&#x30DC;&#x3001;&#x809D;&#x81D3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x9577;&#x671F;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x69CB;&#x6210;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6CBB;&#x7642;&#x3068;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x305B;&#x305A;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x8A98;&#x5C0E;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x304C; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x5F8C;&#x3002;

&#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1;&#xC744; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC758; coinfection&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xAE30;&#xBC18;&#xC758; piggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC0DD;&#xC950; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7A5;&#xAE30;&#xAC04; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC83;&#xC744; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC138;&#xC6E0;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB2E4;&#xC911; transposon &#xBC30;&#xB2EC; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD56D;&#xC0DD;&#xBB3C;&#xC9C8;&#xC744; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC2DD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xCCB4; &#xC678; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xC120;&#xD0DD; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; transposon &#xD45C;&#xC2DD; &#xD568;&#xAED8; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB9AC;&#xD3EC;&#xD130; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCC4;&#xB3C4; transposons&#xC5D0; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558; &#xC5EC;. &#xC548;&#xC815;&#xC801; &#xC140; &#xB77C;&#xC778;&#xC758; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC120;&#xD0DD; &#xB41C; &#xD074;&#xB860;&#xC758; 100% &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBCC4;&#xB3C4; transposons&#xC5D0;&#xC11C; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC2DD; &#xD1B5;&#xD574; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC2DD; &#xC804;&#xC2DC; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E4;&#xC74C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD558; &#xACE0; piggyBac &#xC911;&#xC7AC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9; &#xAC04; &#xB610;&#xB294; &#xD3D0;&#xB97C; &#xC548;&#xC815; &#xB9AC;&#xD3EC;&#xD130; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xC0DD;&#xC950; immunocompetent &#xB610;&#xB294; &#xBA74;&#xC5ED; &#xACB0;&#xD54D; &#xB3D9;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5BB;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xBC1C;&#xACAC;. PiggyBac transposons&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC8FC;&#xC0AC; &#xC950; in vivo, &#xACBD;&#xC791;&#xB41C; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xB2E4;&#xC911; transposon &#xC804;&#xB7B5; &#xD655;&#xC778; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC04;&#xC740;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7A5;&#xAE30; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xB2EC;&#xC131;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xB454; piggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xBCA1;&#xD130;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC801; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC801; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xC815; &#xB610;&#xB294; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

PiggyBac transposon &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; vivo &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9; &#xD6C4;.

Transferencia g&eacute;nica de c&eacute;lulas som&aacute;ticas ha permitido la expresi&oacute;n de genes inducibles en vivo a trav&eacute;s de la coinfecci&oacute;n de m&uacute;ltiples virus. Nuestra hip&oacute;tesis es que el sistema del transpos&oacute;n piggyBac eficientes basadas en el pl&aacute;smido permitir&iacute;a a largo plazo genes inducibles en ratones in vivo. Utilizamos una estrategia m&uacute;ltiple-transposon entrega para crear un sistema de expresi&oacute;n inducible por tetraciclina in vitro en c&eacute;lulas humanas mediante la entrega de los dos genes en transposones separados para la expresi&oacute;n del gen reportero inducible junto con un marcador independiente transposon seleccionable. Evaluaci&oacute;n de l&iacute;neas celulares estables revel&oacute; 100% de clones seleccionados exhibi&oacute; expresi&oacute;n inducible mediante la expresi&oacute;n estable de transposones separados tres simult&aacute;neamente. A continuaci&oacute;n probamos y encontr&oacute; que transferencia de genes mediada por piggyBac al h&iacute;gado o al pulm&oacute;n podr&iacute;a alcanzar reportero estable de genes en ratones in vivo en animales deficientes inmunocompetentes o inmunes. Una sola inyecci&oacute;n de transposones piggyBac podr&iacute;a alcanzar a largo plazo expresi&oacute;n inducible gene en los h&iacute;gados de ratones in vivo, confirmando nuestra estrategia m&uacute;ltiple-transposon utilizado en c&eacute;lulas cultivadas. El sistema del transpos&oacute;n piggyBac basadas en pl&aacute;smido permite expresi&oacute;n constitutiva o inducible gene in vivo para posibles aplicaciones terap&eacute;uticas y biol&oacute;gicas sin utilizar vectores virales.

Expresi&oacute;n de genes inducibles basadas en el transpos&oacute;n PiggyBac in vivo despu&eacute;s de la transferencia de genes de c&eacute;lulas som&aacute;ticas.

&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x6700;&#x8FD1;&#x53D1;&#x8FBE;&#x56FD;&#x5BB6;&#x52A8; piggyBac (pB) &#x8F6C;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB; [&#x5305;&#x542B;&#x4E03;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8; (7pB)] &#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7684;&#x672C;&#x673A;&#x94C5;&#x3001; 7pB &#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x52A0;&#x65B0;&#x9709;&#x7D20;&#x6297;&#x6027;&#x5361;&#x5E26;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x5728;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x548C; HeLa &#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x5E73;&#x8868;&#x8FBE;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x57F9;&#x517B;&#x3002;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB;&#x4E2D;&#x7684;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x6362;&#x4F4D;&#x6548;&#x7387;&#x5C55;&#x793A;&#x672C;&#x673A; pB &#x548C; SB100X&#xFF0C;&#x7761;&#x7F8E;&#x4EBA;&#x7684;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x6700;&#x6D3B;&#x8DC3;&#x7684;&#x8F6C;&#x3002;&#x5F53;&#x4F20;&#x9012;&#x5230;&#x4E3B;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6269;&#x589E;&#xFF0C;7pB &#x589E;&#x52A0;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F20;&#x9012;&#x4E24;&#x81F3;&#x4E09;&#x500D;&#x76F8;&#x6BD4; piggyBac &#x548C; SB100X&#x3002;&#x52A8; 7pB &#x8F6C;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x4E0D;&#x53D7;&#x589E;&#x52A0; 24 kDa N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x6807;&#x8BB0;&#xFF0C;&#x800C; SB100X &#x8868;&#x73B0;&#x5927;&#x52A8;&#x8109;&#x8F6C;&#x4F4D;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86; 50%&#x3002;&#x52A8; 7pB &#x88AB;&#x76F8;&#x6BD4;&#x672C;&#x673A; pB &#x548C; SB100X &#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x8F6C; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x8367;&#x5149;&#x7D20;&#x9176;&#x8BB0;&#x8005;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x9650;&#x5236;&#x5242;&#x91CF;&#x6C34;&#x52A8;&#x529B;&#x5C3E;&#x9759;&#x8109;&#x6CE8;&#x5165;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9075;&#x5FAA;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x8FBE; 6 &#x4E2A;&#x6708;&#xFF0C;&#x5E76;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x5927;&#x7EA6; 10 &#x500D;&#x66F4;&#x591A;&#x957F;&#x671F;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E0E;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x7248;&#x672C;&#x7684; 7pB &#x76F8;&#x6BD4;&#x4E0E;&#x672C;&#x673A;&#x94C5;&#x6216; SB100X &#x6CE8;&#x5165;&#x5C0F;&#x9F20;&#x6CE8;&#x5C04;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x51FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x52A8; piggyBac &#x5143;&#x7D20;&#x53EF;&#x4EE5;&#x589E;&#x52A0;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x548C;&#x5E94;&#x4F7F;&#x6539;&#x8FDB;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x4EA4;&#x4ED8;&#x4F7F;&#x7528; piggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x5404;&#x79CD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

&#x52A8; piggyBac &#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;

We characterized a recently developed hyperactive piggyBac (pB) transposase enzyme [containing seven mutations (7pB)] for gene transfer in human cells in vitro and to somatic cells in mice in vivo. Despite a protein level expression similar to that of native pB, 7pB significantly increased the gene transfer efficiency of a neomycin resistance cassette transposon in both HEK293 and HeLa cultured human cells. Native pB and SB100X, the most active transposase of the Sleeping Beauty transposon system, exhibited similar transposition efficiency in cultured human cell lines. When delivered to primary human T cells ex vivo, 7pB increased gene delivery two- to threefold compared with piggyBac and SB100X. The activity of hyperactive 7pB transposase was not affected by the addition of a 24-kDa N-terminal tag, whereas SB100X manifested a 50% reduction in transposition. Hyperactive 7pB was compared with native pB and SB100X in vivo in mice using hydrodynamic tail-vein injection of a limiting dose of transposase DNA combined with luciferase reporter transposons. We followed transgene expression for up to 6 months and observed approximately 10-fold greater long-term gene expression in mice injected with a codon-optimized version of 7pB compared with mice injected with native pB or SB100X. We conclude that hyperactive piggyBac elements can increase gene transfer in human cells and in vivo and should enable improved gene delivery using the piggyBac transposon system in a variety of cell and gene-therapy applications.

Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.

Nous avons caract&eacute;ris&eacute; une enzyme de transposase piggyBac hyperactif r&eacute;cemment d&eacute;velopp&eacute;s (pB) [contenant sept mutations (7pB)] pour un transfert de g&egrave;nes dans des cellules humaines in vitro et aux cellules somatiques chez les souris in vivo. Malgr&eacute; une expression de niveau de prot&eacute;ines similaire &agrave; ce que PB native, 7pB a sensiblement augment&eacute; l&#39;efficacit&eacute; de transfert de g&egrave;ne d&#39;un transposon de cassette de r&eacute;sistance de n&eacute;omycine HEK293 et HeLa cultiv&eacute; des cellules humaines. Natif de pB et de SB100X, la transposase plus active du syst&egrave;me de transposon de belle au bois dormant, expos&eacute; semblable efficacit&eacute; de transposition dans les lign&eacute;es cellulaires humaines cultiv&eacute;es. Quand livr&eacute;s &agrave; des cellules T humaines primaires ex vivo, 7pB favoriser la livraison de g&egrave;ne-de deux &agrave; trois fois contre piggyBac et SB100X. L&#39;activit&eacute; de la transposase 7pB hyperactif n&#39;est pas affect&eacute;e par l&#39;ajout d&#39;une balise de N-terminal de 24 kDa, tandis que SB100X se manifeste une r&eacute;duction de 50 % de transposition. 7PB hyperactifs a &eacute;t&eacute; compar&eacute;e &agrave; la native de pB et de SB100X in vivo chez la souris &agrave; l&#39;aide d&#39;injection hydrodynamique de queue veineuse d&#39;une dose limite d&#39;ADN transposase combin&eacute; avec les transposons Rapporteur lucif&eacute;rase. Nous transgene expression jusqu&#39;&agrave; 6 mois de suivi et observ&eacute; environ 10 fois plus &eacute;lev&eacute;e &agrave; long terme expression des g&egrave;nes chez les souris inject&eacute;es avec une version optimis&eacute;e codon de 7pB par rapport aux souris inject&eacute;es avec native pB ou SB100X. Nous concluons que les &eacute;l&eacute;ments de piggyBac hyperactif peuvent augmenter le transfert de g&egrave;nes dans les cellules humaines et in vivo et devraient permettre la livraison de g&egrave;ne am&eacute;lior&eacute;e en utilisant le syst&egrave;me de transposon piggyBac dans une vari&eacute;t&eacute; d&#39;applications cellulaire et th&eacute;rapie g&eacute;nique.

PiggyBac hyperactif transfert de g&egrave;nes dans les cellules humaines et in vivo.

Wir zeichnen sich eine neu entwickelte hyperaktive PiggyBac (pB) Transposase Enzym [mit sieben Mutationen (7pB)] Gentransfer in menschliche Zellen in vitro und in somatischen Zellen in M&auml;usen in-vivo. Trotz einer Ebene Proteinexpression &auml;hnlich der native pB, 7pB deutlich erh&ouml;ht die gen-Transfer-Effizienz der eine Neomycin Widerstand Kassette Transposon in HEK293 und HeLa kultivierte menschliche Zellen. Native pB und SB100X, die aktivsten Transposase des Systems Transposon Dornr&ouml;schen ausgestellt &auml;hnliche Umsetzung Effizienz in kultivierten menschlichen Zelllinien. Beim prim&auml;ren menschlichen T-Zellen ex Vivo zugestellt, erh&ouml;hte 7pB gen Lieferung zwei-bis dreifache im Vergleich zu PiggyBac und SB100X. Die Aktivit&auml;t der hyperaktive 7pB Transposase war nicht durch die Zugabe von einem 24-kDa-N-Terminal-Tag betroffen, w&auml;hrend SB100X 50 % Erm&auml;&szlig;igung bei Umsetzung manifestiert. Hyperaktive 7pB wurde mit native pB und SB100X in-vivo in M&auml;usen mit hydrodynamischen Schwanz-Vene-Injektion einer einschr&auml;nkenden Dosis von Transposase DNA kombiniert mit Luciferase Reporter Transposonen verglichen. Wir folgten Transgenexpression f&uuml;r bis zu 6 Monaten und ca. 10-fache h&ouml;here langfristige Genexpression bei M&auml;usen injiziert mit einem Codon-optimierte Version der 7pB verglichen mit M&auml;usen injiziert mit native pB oder SB100X zu beobachten. Wir schlie&szlig;en, dass hyperaktive PiggyBac Elemente Gentransfer in menschliche Zellen und in-vivo erh&ouml;hen k&ouml;nnen und sollten verbesserte gen Lieferung mit dem PiggyBac-Transposon-System in einer Vielzahl von Zell- und Gentherapie Anwendungen aktivieren.

Hyperaktive PiggyBac Gentransfer in menschliche Zellen und in vivo.

Abbiamo caratterizzato un sviluppata di recente piggyBac iperattivo (pB) permettono enzima [contenente sette mutazioni (7pB)] trasferimento genico in cellule umane in vitro e di cellule somatiche nel topo in vivo. Nonostante un&#39;espressione di livello proteico simile alla che di pB nativi, 7pB aumentato significativamente l&#39;efficienza di trasferimento del gene di un trasposone di neomicina resistenza cassetta HEK293 sia HeLa in coltura le cellule umane. Nativo pB e SB100X, l&#39;ha pi&ugrave; attivo del sistema Trasposone Sleeping Beauty, esposto simile efficienza trasposizione in linee cellulari umane coltivate. Quando consegnate a cellule T umane primarie ex vivo, 7pB aumentato consegna gene due-triplice confrontati con piggyBac e SB100X. L&#39;attivit&agrave; di 7pB iperattivo ha non &egrave; stata influenzata dall&#39;aggiunta di un tag N-terminale 24-kDa, mentre SB100X si manifesta una riduzione del 50% nella trasposizione. 7PB iperattivo &egrave; stato confrontato con nativo pB e SB100X in vivo nei topi utilizzando idrodinamico coda-vena iniezione di una dose limita di DNA ha combinato con trasposoni reporter luciferasi. Abbiamo seguito l&#39;espressione del transgene per fino a 6 mesi e osservato circa 10 volte maggiore espressione genica a lungo termine in topi iniettati con una versione ottimizzata di codone di 7pB rispetto ai topi iniettati con pB nativi o SB100X. Concludiamo che elementi piggyBac iperattivo possono aumentare il trasferimento genico in cellule umane e in vivo e dovrebbero consentire miglioramento gene consegna utilizzando il sistema del transposon piggyBac in una variet&agrave; di applicazioni cellulare e terapia genica.

PiggyBac iperattivo trasferimento genico in cellule umane e in vivo.

[7 &#x3064;&#x306E;&#x5909;&#x7570; (7pB) &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3092;&#x542B;&#x3080;]&#x3001;&#x6700;&#x8FD1;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A; piggyBac (pB) &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x9175;&#x7D20;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE; in vitro &#x3068; in vivo &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E; pB &#x306E; 7pB &#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x30CD;&#x30AA;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x62B5;&#x6297;&#x30AB;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; HEK293 &#x3068; hela &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x9001;&#x52B9;&#x7387;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x4F3C;&#x3066;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x5F0F;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x57F9;&#x990A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E; pB &#x3068; SB100X&#x3001;&#x7720;&#x308C;&#x308B;&#x68EE;&#x306E;&#x7F8E;&#x5973;&#x306E; transposon &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306A;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x8EE2;&#x4F4D;&#x52B9;&#x7387;&#x3067;&#x57F9;&#x990A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Ex vivo &#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30D2;&#x30C8; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x914D;&#x4FE1;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;7pB &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30C7;&#x30EA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30FC; 2 - piggyBac &#x3068; SB100X &#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066; 3 &#x500D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;SB100X &#x8EE2;&#x4F4D;&#x306E; 50 &#xFF05; &#x524A;&#x6E1B;&#x3092;&#x4F53;&#x73FE;&#x3057;&#x305F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A; 7pB &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3001;24 kDa &#x306E; N &#x672B;&#x7AEF;&#x30BF;&#x30B0;&#x306E;&#x4ED8;&#x52A0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F71;&#x97FF;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A; 7pB &#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E; pB &#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6D41;&#x4F53;&#x5C3E;&#x9759;&#x8108;&#x6CE8;&#x5165;&#x30EB;&#x30B7;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC; &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x305F;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC; DNA &#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x6295;&#x4E0E;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067; SB100X &#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F; transgene &#x5F0F; 6 &#x30F6;&#x6708;&#x9593;&#x7D9A;&#x304F;&#x3057;&#x3001;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E; pB &#x307E;&#x305F;&#x306F; SB100X &#x3092;&#x6295;&#x4E0E;&#x3057;&#x305F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066; 7pB &#x3092;&#x6295;&#x4E0E;&#x3057;&#x305F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x7D04; 10 &#x500D;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x9577;&#x671F;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A; piggyBac &#x8981;&#x7D20;&#x304C;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068; in vivo &#x3067;&#x5897;&#x3084;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x69D8;&#x3005; &#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x5FDC;&#x7528;&#x3067; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30C7;&#x30EA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3092;&#x7DE0;&#x7D50;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x6D3B;&#x767A;&#x306A; piggyBac &#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x4F1D;&#x9054;.

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB41C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; piggyBac (pB) transposase &#xD6A8;&#xC18C; [&#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; 7 &#xAC1C;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (7pB)] &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC; &#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0; &#xBC0F; &#xC950; in vivo &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD2B9;&#xC9D5;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC900; &#xC2DD; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; Pb&#xC758; 7pB &#xD06C;&#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00; HEK293 &#xBC0F; &#xD5EC;&#xB7EC; &#xB124;&#xC624; &#xB9C8;&#xC774; &#xC2E0; &#xC800;&#xD56D; &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8; transposon&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1; &#xD6A8;&#xC728;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC30;&#xC591;. &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; pB &#xBC0F; SB100X, &#xC7A0;&#xC790;&#xB294; &#xBBF8;&#xB140; transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC778; transposase &#xAD50;&#xC591;&#xB41C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xC804;&#xC704; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131;&#xC744; &#xC804;&#xC2DC;. Ex vivo &#xAE30;&#xBCF8; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; 7pB &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC30;&#xB2EC;&#xC744; 2-&#xC0BC; &#xBC30; Piggybac&#xC640; sb100x&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD65C;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; 7pB transposase&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; SB100X &#xAC01; &#xC131; &#xC804;&#xC704;&#xC5D0; 50% &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; 24 kDa N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xD0DC;&#xADF8;&#xB97C; &#xCD94;&#xAC00; &#xD558; &#xC5EC; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD65C;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; 7pB &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; Pb&#xC640; SB100X &#xB8E8;&#xC2DC;&#xD398;&#xB77C;&#xC544;&#xC81C; &#xAE30;&#xC790; transposons&#xC640; &#xD568;&#xAED8; transposase DNA&#xC758; &#xC81C;&#xD55C; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC758; &#xC720;&#xCCB4; &#xAF2C;&#xB9AC; &#xC815; &#xB9E5; &#xC8FC;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0DD;&#xC950;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBE44;&#xAD50; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB4A4;&#xC5D0; 6 &#xAC1C;&#xC6D4; &#xB3D9;&#xC548; transgene &#xC2DD; &#xBC0F; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; pB &#xB610;&#xB294; sb100x&#xC744; &#xC8FC;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xC0DD;&#xC950;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; 7pb&#xC758; codon&#xC5D0; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xBC84;&#xC804;&#xC744; &#xC8FC;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xC0DD;&#xC950;&#xC5D0; &#xC57D; 10 &#xBC30; &#xD070; &#xC7A5;&#xAE30; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xAD00;&#xCC30;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACB0;&#xB860; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; piggyBac &#xC694;&#xC18C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC99D;&#xAC00; &#xC2DC;&#xD0AC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC30;&#xB2EC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC0F; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; piggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC124;&#xC815; &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; piggyBac &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9;.

Hemos caracterizado una reciente hiperactivo piggyBac (pB) transposasa enzima [que contiene siete mutaciones (7pB)] transferencia de genes en c&eacute;lulas humanas in vitro y a las c&eacute;lulas som&aacute;ticas de ratones in vivo. A pesar de una expresi&oacute;n de nivel de prote&iacute;na similar a que de nativo pB, 7pB aument&oacute; significativamente la eficiencia de transferencia de genes de un transposon de cassette de resistencia neomicina en HEK293 y HeLa cultiva c&eacute;lulas humanas. Nativo pB y SB100X, la transposasa m&aacute;s activa del sistema durmiente transposon, exhibieron similar eficacia de transposici&oacute;n en l&iacute;neas de c&eacute;lulas humanas cultivadas. Cuando las c&eacute;lulas T humanas primarias ex vivo, 7pB aument&oacute; entrega gene-de dos a tres veces en comparaci&oacute;n con piggyBac y SB100X. La actividad de la transposasa 7pB hiperactivo no fue afectada por la adici&oacute;n de una etiqueta de N-terminal de 24 kDa, mientras que SB100X se manifiesta una reducci&oacute;n del 50% en la transposici&oacute;n. 7PB hiperactivo se compar&oacute; con nativos pB y SB100X in vivo en ratones mediante inyecci&oacute;n de cola-vena hidrodin&aacute;mica de una dosis limitante de la transposasa ADN combinado con transposones de reportero de luciferasa. Hemos seguido de la expresi&oacute;n del transg&eacute;n por hasta 6 meses y observ&oacute; la expresi&oacute;n del gen a largo plazo aproximadamente 10 veces mayor en los ratones inyectados con una versi&oacute;n optimizada de cod&oacute;n de 7pB en comparaci&oacute;n con los ratones inyectados con pB o SB100X. Concluimos que el hiperactivo piggyBac elementos pueden aumentar la transferencia de genes en c&eacute;lulas humanas y en vivo y deben permitir la oferta de gene mejorada usando el sistema del transpos&oacute;n piggyBac en una variedad de aplicaciones de celular y terapia g&eacute;nica.

Joseph E. Doherty

Department of Medicine,
Division of Nephrology,
Program in Cell and Molecular Biology,
Department of Medicine, Division of Nephrology

Baylor College of Medicine

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Joseph E. Doherty

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Baylor College of Medicine

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Department of Medicine,
Division of Nephrology,
Program in Cell and Molecular Biology,
Department of Medicine, Division of Nephrology