Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Riepilogo

Noi descriviamo come misurare vicino a membrana e globale dinamiche di calcio intracellulare negli astrociti in coltura utilizzando riflessione interna totale e epifluorescenza.

Abstract

Il cervello contiene cellule gliali. Astrociti, un tipo di cellule gliali, sono da tempo noti per fornire un ruolo passivo di supporto ai neuroni. Tuttavia, una crescente evidenza suggerisce che gli astrociti possono anche partecipare attivamente nella funzione del cervello attraverso le interazioni funzionali con i neuroni. Tuttavia, molti aspetti fondamentali della biologia astrociti rimangono controversi, chiari e / o sperimentale inesplorati. Una questione importante è la dinamica dei transitori calcio intracellulare negli astrociti. Questo è importante perché il calcio è così affermato come un importante messaggero secondo e perché è stato proposto che elevazioni di calcio astrociti possono innescare il rilascio di trasmettitori da astrociti. Tuttavia, non vi è stata alcuna descrizione dettagliata e soddisfacente di calcio vicino a membrana plasmatica di segnalazione negli astrociti. Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è un potente strumento per analizzare gli eventi di segnalazione fisiologicamente rilevanti all'interno di circa 100 nm della membrana plasmatica delle cellule vive. Qui, usiamo microscopia TIRF e descrivono come monitor vicino membrana plasmatica e globale dinamiche di calcio intracellulare quasi simultaneamente. L'ulteriore perfezionamento e l'applicazione sistematica di questo approccio ha il potenziale per informare sui dettagli precisi della segnalazione calcio astrociti. Una comprensione dettagliata delle dinamiche di calcio astrociti possono fornire una base per capire se, come, quando e perché astrociti e neuroni subiscono interazioni funzionali calcio-dipendente.

Protocollo

Procedure sperimentali

La procedura sperimentale consiste di due parti principali che sono descritti in maniera saggia passo sotto.

Parte 1: PREPARAZIONE CULTURE astrociti dell'ippocampo

In breve, misto astrociti-neuroni dell'ippocampo culture sono state preparate utilizzando un protocollo ben definito ^1,2,3. Abbiamo ottimizzato il procedimento per produrre sano astrociti in coltura. Tutte le procedure di seguito elencati deve essere effettuata in un ambiente sterile come una cappa a flusso laminare.

Coprioggetto preparazione

• Coprioggetto 22 mm (VWR, 48380-068)
• Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), aliquote (1 mg / ml)
• Laminina aliquote (20 mg / ml): aggiungere 49 ml di acqua sterile a 1 mg / ml soluzione laminina (Sigma L2020), fanno aliquote da 1,2 ml e conservare a -20 ° C

1. Sciogliere PDL in acqua sterile (50 mg / ml)
2. Autoclave i coprioggetti, sciacquare con acqua sterile e posto in PDL (20 ml per 100 lamelle). Lasciare a temperatura ambiente per una notte.
3. Sostituire il PDL con acqua sterile (3 lavaggi estensiva). Poi asciugare i coprioggetti e conservare a 4 ° C.
4. Il giorno prima della placcatura astrociti, coprioggetto posto individuale in un pozzo sterile su un 6-pozzetti (pozzetti a fondo piatto Piatti con coperchio, sterile da BD Bioscience). Mettere 400 ml di laminina su ogni coprioggetto e incubare una notte, in incubatrice per evitare l'evaporazione.

Dissezione

Dissezione dei media:

• 500 ml di Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) (1X), liquido (Invitrogen, 14155-063)
• HEPES 5 ml di soluzione (Sigma, H0887)

Mezzi di comunicazione dell'ippocampo:

• 412,5 ml di media minima essenziale (MEM) (1X), liquido Contiene sali di Earle, ma non rosso L-glutammina o fenolo (Invitrogen, 51200-038)
• 10 ml di glucosio (Sigma, D-(+)-glucosio anidro SIGMA ULTRA G7528) 1 M a MEM
• 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122)
• 5 ml di soluzione di sodio piruvato (Sigma, S8636)
• 12,5 ml HEPES soluzione 1 M (Sigma, H0887)
• 5 ml N-2 Supplement (100X), liquido (Invitrogen, 17502-048)
• 50 ml di siero di cavallo, inattivato per calore (Invitrogen, 26050-088)

Papaina soluzione:

• Aggiungere 5 ml di dissezione dei media in Worthington papaina-022 flaconcino (LK003178; concentrazione finale, 20 U / ml) e incubare a 37 ° C per 60 min.

1. Decapitare ratti di età compresa tra P1 (in genere 2 cuccioli) le linee guida controllati e approvati dalla normativa nazionale e Cura il tuo locale degli animali e del Comitato Istituzionale Usa.
2. Togliere la pelle e il cranio e il cervello posto nella piastra di Petri riempite con i media dissezione a freddo.
3. Rimosso meningi, sezionare entrambi gli emisferi e sezionare dell'ippocampo.
4. Tritate la dell'ippocampo in ~ 1X1 pezzi mm e digerire in soluzione papaina a 37 ° C per 11-13 minuti.
5. Una volta che i pezzi di tessuto sono insediati, rimuovere la papaina con cura e aggiungere 5 ml di terreno dell'ippocampo a rimuovere tutte le tracce di un enzima. Ripetere questo passaggio e risospendere in media dell'ippocampo (2 ml).
6. Triturare le cellule ~ 5 volte fino a quando non ci sono grumi sinistra, con tre fiamma lucido pipette di fori progressivamente più piccoli (1000 micron, ~ 500 micron e ~ 300 micron).
7. Una volta triturato, le cellule passano attraverso un filtro cella (dimensione dei pori, 70 micron, BD Bioscience). Contare le cellule in 10 ml di sospensione. Regolare il volume di terreno dell'ippocampo in modo da avere 400000 cellule / ml.
8. Aspirare il laminina fuori i coprioggetti, e prima che le coperture possono asciutto, piatto 200 microlitri della sospensione cellulare per coprioggetto.
9. Lasciateli per attaccare per 60 minuti in incubatrice, e poi aggiungere 2 ml di terreno dell'ippocampo per bene.
10. Il giorno successivo, aspirare vecchi media dell'ippocampo per rimuovere le cellule morte e detriti e aggiungere 2 ml di pre-riscaldato terreno fresco dell'ippocampo.

Manutenzione

Mezzi di comunicazione Neurobasal:

• 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
• 10 ml di siero B27 supplemento gratuito (Invitrogen, 17504-044)
• 5 ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, 15140-122)
• 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149)

Feed the culture astrociti-neuroni due volte alla settimana con il mezzo neurobasal, a partire da quattro giorni dopo la placcatura. Preincubare i media di circa 30 minuti in incubatrice in un pallone ventilato per equilibrare la temperatura e CO _2.

Parte 2: IMAGING DI CALCIO

Registrazione dell'ippocampo tampone: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1,8 mM CaCl _2, 0,8 mM MgCl _2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES (Tutti i prodotti chimici da Sigma), pH 7.4 (corretto con NaOH).

Caricamento indicatore colorante calcio in astrociti

1. Posizionare la cultura in un bene su un 6-pozzetti riempiti con 2 ml di buffer di registrazione dell'ippocampo contenente 2,5 mM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% Pluronic soluzione ® F-127, il 20% in DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubare a temperatura ambiente per 10-30 min.
2. Rimuovere Fluo-4 soluzione e lavare coprioggetto 3 volte con buffer di registrazione dell'ippocampo e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
3. Posizionare il coprioggetto sulla camera, e pulire il lato del vetrino con il liquido per pulire le lenti.
4. Metti una piccola goccia di olio da immersione (olio DF immersione TIPO da Cargille) l'obiettivo e mettere da camera (camera aperta per 25 coprioggetto tondo mm dalla Warner Instruments) sul palco del microscopio (Olympus IX71).
5. Guarda le cellule usando la luce di trasmissione per vedere come le cellule aspetto, e portarli a fuoco. Poi illuminare le cellule con 488 nm da un monocromatore (policroma V da TILL Vision) e determinare se il segnale di fluorescenza di Fluo-4 è uniforme e rilevabile negli astrociti.
6. Usa EPI e TIRF illuminazione per misurare il calcio negli astrociti.

Microscopia TIRF

In breve, usiamo un microscopio Olympus IX71 dotato di una fotocamera IXON Andor DV887DCS EMCCD. Il controllo di eccitazione e di acquisizione delle immagini è ottenuta utilizzando un software TILLVision. Le travi di 454/488/515 nm Argon (100 mW) e 442 nm allo stato solido (45 mW) i laser sono combinati e controllati con una FINO Polilinea laser combinatore, TIRF porta a condensatore a doppio e acoustoptical filtro sintonizzabile e controller (AOTF; tutto da FINO Photonics) e inseriti in una fibra Kineflex a banda larga per l'ingresso nel condensatore TIRF. Usiamo un Olympus 60X 1,45 lente NA per raggiungere TIRF. Il guadagno della telecamera è adeguato, per ogni astrociti per fornire il miglior segnale al rumore delle immagini. Lo sfondo ed i principi della microscopia TIRF sono state recentemente recensione ^{4, 5.} La maggior parte dei componenti ottici che utilizziamo sono stati acquistati da TILL Photonics, che ora fa parte di Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondità di penetrazione TIR può essere calcolato dalle equazioni di seguito.

d = profondità di penetrazione

n1 = indice di rifrazione del vetro

n2 = indice di rifrazione di cellule

un angolo di incidenza =

NAi = apertura numerica di incidenza

Al fine di garantire il laser è allineato in modo ottimale per TIRF riteniamo utile osservare 100 nm perline fluorescenti (Invitrogen, F8803). Vi presentiamo fotogrammi e video di perline con EPI e microscopia TIRF. Quando nel TIRF, si osserva un aumento drammatico nel rapporto segnale-rumore e le perline visualizzazione diffusione browniano. Per noi è utile osservare il comportamento di 100 nm con perline microscopia TIRF su base regolare (~ una volta a settimana) per essere sicuri che TIRF ottimale si verifica, piuttosto che l'illuminazione compromessa obliqua che si verificherebbe se l'angolo critici non sono stati pari a α (vedi Fig. 1).

Applicazione di agonisti accoppiata G-proteina recettore

Astrociti esprimono una varietà di Gq recettori accoppiati ^{6, 7} tra cui i recettori metabotropici del glutammato e recettori P2Y (agonista, ATP, ADP). L'attivazione di questi recettori porta ad un aumento significativo dei livelli intracellulari di calcio in astrociti. Per esempio, si può facilmente osservare prospetti del calcio intracellulare durante l'applicazione di ATP (30 mM) a ^8-10 astrociti. Usiamo una soluzione rapida switcher da Warner Instruments chiamato VC-77SP Fast-Passo del sistema di perfusione (http://www.warneronline.com/index.cfm). Con questo metodo le soluzioni possono essere applicate in meno di ~ 10 ms.

Cartoon FIGURA 1. Fotografie e immagini del set up. A. mostra una fotografia del microscopio montato su un airtable, mentre (B) mostra una fotografia del gruppo laser, controllori e scatole fascio. C. Mostra una fotografia della scena microscopio con la camera montata per l'imaging. A sinistra il dispositivo di perfusione veloce può essere visto (insieme con il motore passo-passo e tubi theta). Sulla destra il headstage di un amplificatore Axopatch 200A è visto. Il fumetto schematizza il percorso della luce nel set up e come TIRF è raggiunto. Il laser viene focalizzato sul piano focale posteriore della lente dell'obiettivo 60X 1,45 NA e la sua posizione viene regolata fuori centro in modo che emerge in olio da immersione al α angolo critico. A questo punto il fascio soffre di riflessione interna totale e decade con una distanza λ (vedi equazione nel testo principale) nel mezzo di indice di rifrazione più basso. In questo caso, questo è il buffer di registrazione che circonda la astrociti e gli astrociti stessi. Il risultato è eccitazione ottica (e quindi immagini) di molecole all'interno di ~ 100 nm della membrana plasmatica. Nel cartone animato della cellula, viene visualizzato come verde "eccitato" recettori di membrana, mentre quelli all'interno della cellula o sulla superficie superiore della cella non sono entusiasti. Un resoconto completo di microscopia TIRF è stata fornita da Steyer e Almers ^4.

FIGURA 2. Immagini di 100 nm perline fluorescenti acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. mostra le immagini EPI di un campo di vista con diverse decine di 100 nm perline fluorescenti. Il punto rosso frecce per perline che si sono insediati sul vetrino di vetro, mentre le frecce blu indicano che sono perle di diffusione in acqua. B. mostra un'immagine TIRF dello stesso campo di vista, come mostrato in A. In questa visione solo le perle aderente mostrato dalle frecce rosse sono visibili. Questo perché questi si erano stabiliti sulla coverlsip vetro e sono stati pertanto nel campo 100 nm ~ evanescente. Le perle mostrato in A con frecce blu non sono in questa regione e sono quindi invisibili nelle immagini TIRF. I grafici mostrano inferiore rendering 3D delle immagini. E 'chiaro che un forte aumento del rapporto segnale-rumore si verifica per perline all'interno del campo evanescente quando osservate al microscopio TIRF. Infatti per queste immagini il rapporto segnale-rumore per EPI è stato 7,1 ± 0,6, mentre per TIRF era 20 ± 0,7.

FIGURA 3. Immagini di astrociti caricato con Fluo-4 colorante indicatore di calcio acquisito con EPI e microscopia TIRF. A. EPI immagini di un campo di vista con cinque astrociti. B. Una immagine TIRF dello stesso campo di vista mostrato in B. Nota che le immagini in A e B sono significativamente differenti. Questo perché con TIRF illuminazione solo le regioni membrana plasmatica in apposizione vicino al coprioggetto di vetro sono ripreso. I pannelli inferiori mostrano ATP-evocate transienti di calcio intracellulare ripreso con EPI e microscopia TIRF.

Discussione

E 'ben dimostrato che gli astrociti visualizzare prospetti del calcio intracellulare. Questi si verificano spontaneamente, può essere attivato da un'attività neuronale o mediante l'applicazione di agonisti per attivare i recettori sulla superficie astrociti ^11. Un tema importante e controverso è se astrociti prospetti del calcio intracellulare può innescare il rilascio di molecole di segnalazione che attivano i recettori sui neuroni ^{11, 12.} Questo è controversa perché c'è stata la prova a favore ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1	Tool	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Reagent	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid	Reagent	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red	Reagent	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid	Reagent	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate solution	Reagent	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES solution 1 M	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated	Reagent	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	Reagent	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red	Reagent	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid	Reagent	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	25030-149
Cell Strainers	Tool	BD Biosciences	352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile	Tool	BD Biosciences	353046
NaCl	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Reagent	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	Reagent	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	Microscope	Cargill Labs	16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume	Tool	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater	Tool	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids	Reagent	Invitrogen	F8803