Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

Riepilogo

HC11 differenziazione lattogenica può essere caratterizzata dalla formazione di strutture a cupola denominata mammospheres. Le strutture possono essere elencati mediante microscopia a contrasto di fase per aiutare a quantificare la differenziazione lattogenica.

Abstract

Una misura fenotipica comunemente usato per determinare il grado di differenziazione lattogenica nel topo colture di cellule epiteliali mammarie è la formazione di strutture cellulari a forma di cupola denominata mammospheres

Protocollo

1. Il HC11 cellule sono state coltivate a confluenza per 6 giorni in RPMI 1640 medium supplementato con 10% di siero di vitello fetale, insulina 5μg/ml, 10 HEPES mM, 10ng/ml fattore di crescita epidermico (EGF) per stabilire la competenza.
2. Le cellule sono state lavate con PBS e mantenuti in terreni di coltura senza FEG per 24 ore.
3. Per indurre la differenziazione lattogenica le cellule sono state incubate nei media differenziazione, cioè RPMI con desametasone (10 ^-6 M), l'insulina (5 mg / ml) e prolattina (5 mg / ml) di cui il DIP.
4. A volte affermato post-DIP Inoltre, mammospheres sono stati fotografati ed enumerate mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un microscopio Olympus IX71 con fotocamera digitale.

Rappresentante dei risultati:

Ingrandimento di bassa potenza normale monostrati di cellule epiteliali mammarie e mammospheres multiple, così come ingrandimento ad alta potenza di una singola mammosphere sono mostrati in figura 1, rispettivamente.


Figura 1. Mammospheres. (A) normale monostrati di cellule epiteliali mammarie deve essere visualizzato come uno strato piatto di cellule confluenti. (B) Dopo 3-5 giorni di stimolazione DIP mammospheres più apparire. Fotografia scattata 5 giorni dopo DIP aggiunta. (C) ingrandimento superiore di un singolo campo contenente mammospheres a 5 giorni dopo DIP aggiunta.

Discussione

Affinché questa tecnica per avere successo e di ottima qualità, le cellule epiteliali deve essere mantenuta a confluenza prima di essere indotto con gli ormoni lattogenica. Ci possono essere situazioni in cui ci sono mammospheres numerosi, il che rende difficile la quantificazione. Così, ai fini quantitativa è meglio fotografare la mammospheres in un punto momento in cui il numero di mammospheres è in grado di essere contati.

Mentre ci sono diversi marcatori molecolari per determinare i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Invitrogen	21870076
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
L-Glutamine	GIBCO, by Life Technologies	25030
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
Hepes	Quality Biological, Inc.	118089060
EGF	Sigma-Aldrich	E9644
Insulin	GIBCO, by Life Technologies	12585-014
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Microscope	Olympus Corporation	IX71
Digital Camera	QImaging	Retiga 2000RV Fast 1394