Cultura organotipica di Retina Coniglio adulti

Riepilogo

Questo articolo dimostra la dissezione e l'incubazione di retina di coniglio e di particelle-mediato trasferimento genico di plasmidi codifica GFP o una varietà di marcatori subcellulari in cellule gangliari della retina.

Abstract

Sistemi di coltura organotipica funzionale di tessuti neurali sono strumenti importanti nel campo della ricerca neurobiologica. Idealmente, un tale sistema dovrebbe essere compatibile con tecniche di imaging, la manipolazione genetica, e la registrazione elettrofisiologica. Qui vi presentiamo un semplice tessuto del sistema interfase cultura per la retina di coniglio adulto che non richiede attrezzature specializzate e di pochissima manutenzione. Dimostriamo la dissezione e l'incubazione di retina di coniglio e di particelle-mediato trasferimento genico di plasmidi codifica GFP o una varietà di marcatori subcellulari in cellule gangliari della retina. Retine di coniglio colto questo modo può essere mantenuto in vita per un massimo di 6 giorni con molto piccoli cambiamenti della struttura anatomica generale o la morfologia delle singole cellule gangliari e amacrine.

Protocollo

Fare gene proiettili pistola (GOLD)

1. Fai 100X PVP (0.5mg/ml) in 100% EtOH.
2. Pesare 30 mg di BioRad 1,6 oro Micron microcarrier e metterla in una provetta eppendorf da 1,5 ml.
3. Calcolare la quantità di plasmide necessaria per ottenere una concentrazione di 0,5-3 mg oro plasmide / mg, e posizionare il plasmide nel tubo con il microcarriers oro. Combinare plasmidi diversi, se necessario.
4. Portare il volume del plasmide di 100 l con acqua distillata.
5. Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m nel tubo. Tubi vortex 30 secondi.
6. Vortex 1 minuto a piena velocità. Ultrasuoni per 3-5 minuti ..
7. Secco un congruo spazio di tubi Tefzel in un apparato PDS-1000/He Biorad per 15 minuti.
8. Dopo sonicazione, vortex per 1-2 minuti alla massima velocità. Ridurre la velocità lentamente per permettere al tubo di essere aperto mentre vortex.
9. Aggiungere 100 ml di 1 M CaCl ₂ lentamente la goccia tubo saggio mentre vortex.
10. Lascia tubo a temperatura ambiente per 10 minuti.
11. Fare 5 filtro Micron.
    1. Prendete due siringhe da 5 ml senza aghi.
    2. Rimuovere il pistone, e staccare la berretti neri. Prendendo piccole forbici, tagliare una parte del cappuccio nero per dare un anello. Ripetere lo stantuffo altra rete due anelli.
    3. Panino a 5 Micron (parti piccole, Inc. filtro nylon, ½ pollici di diametro) filtro tra i due anelli, e spingere il panino nella punta della siringa.
    4. Siringa dondolare sopra un pallone da 50 ml conica.
12. Dopo 10 minuti, il tubo vortex per 30 secondi.
13. Centrifugare la provetta per 30 secondi e salvare il pellet.
14. Aggiungere 1 ml di EtOH 100% a pellet. Usa punta della pipetta per rompere il pellet, e vortex 30 secondi. Spin 30 secondi e rimuovere EtOH. Ripetere altre 2 volte.
15. Aggiungere 1 ml di EtOH 100% per il pellet (rottura con punta). Inserire questo in Micron filtro 5 e lasciarla fluire attraverso per gravità nel tubo da 50 ml conica. Utilizzare più EtOH come necessario per lavare via tubo o aiutare con flusso attraverso.
16. Gira la 50ml tubo a 2000 giri in centrifuga per 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante, salvare pellet.
17. A seconda della densità desiderata microcarriers necessario, aggiungere 800μl-1,5 ml EtOH 100% e corrispondenti 8 microlitri-15 ul di soluzione PVP.
18. Turbolenza e subito andare l'apparato PDS-1000/He Biorad.
19. Biorad PDS-1000/He apparato
    1. Scollegare il tubo di collegamento del serbatoio del gas N2 al tubo di essiccazione
    2. Estrarre asciugatura tubi Tefzel dalla macchina
    3. Inserire un'estremità del tubo da 50 ml conica, e allegare una siringa all'altra estremità del tubo. Succhiare liquame marrone nel mezzo del tubo.
    4. Inserire di nuovo tubo nella macchina.
    5. Aspettare (senza rotazione) per 4 minuti
    6. Dopo 4 minuti, succhiano EtOH lentamente e con attenzione, facendo attenzione a non disturbare microcarriers.
    7. Ruotare il tubo per 1 minuto.
    8. Dopo 1 minuto, collegare il tubo di collegamento del serbatoio del gas N ₂ al tubo di essiccazione e lasciare asciugare tubi per 15 minuti.
20. Dopo 15 minuti, tagliare il tubo per le dimensioni dei punti da utilizzare immediatamente o conservato a 4 ° C in exsiccator. Proiettili possono essere memorizzati fino a 3 mesi.

Preparazione del gene-gun

1. Proiettili posto in una cartuccia. Ogni pezzo di retina può essere sparato con proiettili 1-3.
2. Inserire la cartuccia nel gene-gun e allegare la pistola ad una fonte di elio. Impostare la pressione a 110 Psi.

Preparazione dei terreni

1. Dissezione di media
   
   

   1 bottiglia Ames soluzione (Sigma, 8.8g)

   1,9 g di sodio bicarbonato

   10 penna ml 1% / strep / L-Glutammina (1:100) (Gibco / Invitrogen)

   990 ml di acqua distillata per 1L

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   1 litro

   
   
   
2. Filtrare il medium dissezione utilizzando un filtro di 0,22 micron.
   
3. L'incubazione media (500ml)
   
   

   485 ml di media dissezione filtrata

   5 ml di supplemento N2 1% (Gibco / Invitrogen)

   10ml 1% siero di cavallo (Sigma)

   500 microlitri di rosso fenolo

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   0.5 L

   
   
   
4. Filtrare il mezzo di incubazione utilizzando un filtro di 0,22 micron.
5. Bubble O ₂ nel mezzo dissezione per 15 minuti prima di iniziare la procedura di raccolta retina.

Preparazione delle camere di incubazione retina

1. Sotto una cappa, riempire 60 piatti diversi mm di profondità (camere di incubazione, Nunc) con 25 ml di mezzo di incubazione. Il numero di piatti dipende dal numero di retINAS necessario.
2. Posizionare un supporto filtro in ogni piatto profondo. Solo le punte molto dello stand non devono essere sommerse.
3. Mettere tutti i piatti in profondità nel incubatrice fino a quando la retina sono pronti.
4. 100 millimetri riempire due scatole Petri e portare in panchina dissezione.

Preparazione della retina di coniglio

1. Sacrificare un coniglio secondo i protocolli stabiliti. Quanto segue non deve essere effettuata sotto una cappa.
2. Con le forbici angolate, inserirlo dietro l'occhio nella cavità oculare del coniglio, tagliare le membrane e il nervo ottico che sono attaccati alla vista.
3. Sollevare delicatamente l'occhio e lavarlo con i media dissezione ossigenato.
4. Posto dell'occhio (cornea verso l'alto) nel pozzo di una affettatrice occhi e chiudere il coperchio.
5. Posizionare la lama orizzontalmente a destra sotto il coperchio. In un movimento fluido, disegnare la lama attraverso l'occhio a tagliare la cornea, lasciando un oculare.
6. Utilizzando pinze, rimuovere la retina dalla affettatrice occhi bene e posizionarlo su una carta da filtro.
7. Rimuovere il vitreo e la lente di bloccaggio un'area vicino reciso il nervo ottico e tirando all'indietro su una carta da filtro. Ripetere più volte fino a quando quasi tutto il vitreo viene rimosso e la coppa occhio guarda sgonfiato.
8. Luogo oculare in una capsula di Petri con i media dissezione da lavare.
9. Tagliare l'oculare nel numero desiderato di pezzi (5 al massimo pezzi).
10. Prendete un pezzo di oculare e mettetelo sotto il microscopio.
11. Fissare la sclera e coroide leggermente insieme sul bordo della retina mediante pinze. Con l'altra mano, uso un pennello fine a pennello proprio tra la coroide e la retina.
12. Utilizzando breve, movimenti dolci, stuzzicare la retina al largo della coroide fino a quando non si stacca.
13. 1 pollice tagliato fuori una pipetta di trasferimento sterile. Usare questo per aspirare la retina e il luogo in una scatola Petri del mezzo di incubazione da lavare.
14. Utilizzando un altro pipetta sterile di trasferimento con 1 pollice tagliato, trasferire accuratamente la retina su un 0,4 micron Millicell filtro (Millipore, Cat No: PICMORG50).
15. Usare un pennello per orientare la retina con il lato rivolto verso l'alto delle cellule gangliari.
16. Appiattiscono la retina mediante spazzolatura leggera sui bordi della retina. Ridurre al minimo contatto con lo strato di cellule gangliari con il pennello il più possibile.
17. Rimuovere l'eccesso di media sul filtro con una pipetta di trasferimento.
18. Utilizzando pinze, trasferire il filtro su un suctioner modificato. Disegnare sulla suctioner 2-3 volte per rimuovere tutti i mezzo di incubazione dal filtro.

Gene Gunning e di incubazione di retina

1. Sotto una cappa, ogni luogo della retina contenenti filtri sul filtro si trova nel 60 piatti mm di profondità (camere di incubazione).
2. Assicurarsi che il mezzo è in contatto con la parte inferiore del filtro e che il mezzo non versare sopra i lati del filtro sulla retina. Il filtro deve agire da interfaccia tra la retina e medie imprese.
3. Spara ogni pezzo di retina con due proiettili. Luogo pistola gene direttamente al di sopra dei tessuti, a circa 3-4 cm di distanza.
4. Mettere tutte le camere di incubazione su uno shaker nei 35 - 37 ° C incubatore.
5. Sostituire con mezzo di incubazione ogni giorno. La retina può essere incubate per un massimo di 6 giorni.

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Discussione

1. Cosa posso fare con questo metodo?

• Vedi morfologia cellulare in modo chiaro.
• Cellule etichetta per registrare da loro.
• Iperespressione di proteine, come PSD95, ma anche altre proteine ​​che modulano la risposta della cellula, canali ionici ad esempio, recettori.
• Esprimere RNA inibitori.

2. Per quanto tempo posso tenere retina per adulti?

• 4 giorni non è un problema per i conigli adulti. Dopo sei giorni le cellule aspetto "malato", cioè gli assoni ritratt...

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