Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

Riepilogo

Magnetico modulazione del sistema sensori biologici è utilizzata in modo rapido, con sensibilità e semplicemente rilevare saggi biologici, come le molecole di DNA e proteine.

Abstract

Un sistema di modulazione magnetica sensori biologici (MMB) [1,2] rapidamente e omogeneamente rilevato bersagli biologici a basse concentrazioni, senza lavaggio o fase di separazione. Quando l'IL-8 bersaglio era presente, un 'sandwich' saggio basato su sfere magnetiche attaccato con IL-8 anticorpo di cattura per streptavidina accoppiato proteina fluorescente attraverso l'IL-8 e un obiettivo biotinilato IL-8 anticorpi. Le sfere magnetiche sono manovrati in movimento oscillatorio applicando un gradiente di campo magnetico alternato attraverso due poli elettromagnetici. Le proteine ​​fluorescenti, che sono attaccati ai talloni magnetici sono condensate nella zona di rilevamento e il loro movimento dentro e fuori di un raggio laser ortogonali produce un segnale periodico fluorescente che viene demodulato utilizzando il rilevamento sincrono. Il sistema di sensori biologici di modulazione magnetica è stato precedentemente utilizzato per rilevare le sequenze codificanti della proteina non strutturale del virus Ibaraki 3 (NS3) DNA complementare (cDNA) [2]. Le tecniche che si dimostrano in questo lavoro per la manipolazione esterna e la condensazione delle particelle possono essere utilizzate per altre applicazioni, ad esempio la consegna di farmaci magneticamente accoppiati

Protocollo

IL-8 saggio:

1. La miscela di reazione compresi i seguenti quattro componenti in 100 microlitri di volume finale di tampone nelle loro rispettive concentrazioni. 10 ml di sfere magnetiche con anticorpo di cattura a 100 perline / mL concentrazioni finali, 2 l di biotinilato IL-8 a 1 la concentrazione di anticorpi nano-gram/μl finale, 1 l di streptavidina proteina fluorescente a 20 nano-gram/μl concentrazione finale, e 1 ml di IL-8 target a 0,48 pico-gram/μl. I componenti vengono aggiunti uno ad uno per il tampone e poi agitato per 30 minuti.
2. Una reazione di controllo è preparato allo stesso modo senza l'IL-8 di destinazione.
3. Le reazioni sono poi collocati senza alcuna separazione o lavaggio in cuvette e controllati con il sistema MMB.

MMB sistema:

1. Posizionare la cuvetta nella sua posizione tra i due poli elettromagnetici.
2. Operare la corrente di modulazione ed attendere 30 secondi per consentire l'aggregazione e la condensazione delle perle
3. Misurare il segnale del amplificatore lock-in con un oscilloscopio.

Rappresentante dei risultati:

Ispezione visiva delle perle aggregati presentato una netta differenza tra la reazione con il target e la reazione senza il bersaglio. In tutte le reazioni con il bersaglio, le perle formano un unico aggregato denso che si muoveva dentro e fuori il raggio laser in modo uniscono. Tuttavia, in tutti la reazione senza il bersaglio, le perle erano meno aggregata e il loro movimento è stato meno unire (vedi Figura 1).

Figura 1: ispezione visiva del immunodosaggio a sandwich '(a) senza l'obiettivo di IL-8 (b) con l'obiettivo di IL-8.

L'orologio di modulazione palo (giallo) e il segnale di uscita PMT (magenta), mentre la rilevazione 0,48 pico grammi IL-8 di destinazione sono presentati nella figura 1 (a). La modulazione di frequenza per ogni polo è a 2 Hz. Tuttavia, come è stato previsto teoricamente, quando le perline passare il raggio laser, la PMT rileva la luce fluorescente e non vi è un picco della tensione di uscita PMT. Pertanto, la frequenza di demodulazione è a 4 Hz. Quando il segnale di PMT e il raddoppio-modulazione dell'orologio (a 4 Hz), sono alimentati per il blocco amplificatore, il rilevatore di fase sensibile rileva la sincronizzazione e risultati con alta tensione (vedi Figura 2).

Figura 2: (a) l'orologio di modulazione (giallo) e il segnale di PMT (magenta) quando il rilevamento 0,48 pico grammi di IL-8 di destinazione. (B) Il blocco provocato tensione amplificatore a due diverse scansioni.

Il blocco amplificatore non ha rilevato alcun segnale quando il campione di controllo è stato testato. Questo fatto, insieme con la differenza visiva di aggregazione suggerisce che il sistema MMB può chiaramente identificare la presenza di IL-8 di destinazione.

Discussione

In sintesi, abbiamo dimostrato che il sistema MMB può essere utilizzato per rilevare la presenza di IL-8 bersaglio a basse concentrazioni (0,5 pico grammi è il limite di rilevabilità del Bio-Plex saggi di citochine Precision Pro [3,4]). La capacità del sistema non si limita a IL-8 e può essere utilizzato per rilevare altre proteine. I vantaggi del sistema MMB sono la capacità di individuare il target rapidamente e senza alcuna separazione o fase di lavaggio. Così, facilita il processo di rilevamento e consente al...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set	Bio-Rad	171-B5008M
Recombinant human IL-8 target	Thermo Fisher Scientific, Inc.	R202625
Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8	BD Biosciences	554718
Streptavidin coupled fluorescent protein	Bio-Rad	Streptavidin PE