Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

Riepilogo

Questo protocollo descrive una procedura generale per lo studio ricombinante del recettore dominio di legame (RBD) a base di vaccini a subunità contro la SARS. Esso include metodi per la trasfezione ed espressione di proteine ​​nelle cellule 293T RBD, l'immunizzazione di topi con RBD e la rilevazione di attività di neutralizzazione del mouse utilizzando un siero stabilito pseudovirus SARS saggio di neutralizzazione.

Abstract

Sulla base del loro profilo di sicurezza e la capacità di indurre potenti risposte immunitarie contro le infezioni, vaccini a subunità sono stati usati come candidati per una vasta gamma di agenti patogeni ^1-3. Dato che il sistema delle cellule di mammifero è in grado di modificazioni post-traduzionali, in modo da formare le proteine ​​accuratamente piegati e glicosilata, proteine ​​ricombinanti espresse in cellule di mammifero hanno dimostrato il potenziale maggiore per mantenere alta l'antigenicità e immunogenicità ^4-6.

Sebbene non nuovi casi di SARS sono stati segnalati dal 2004, future epidemie sono una minaccia costante, quindi, lo sviluppo di vaccini contro la SARS-CoV è un passo prudente preventiva e deve essere effettuata. L'RBD di proteine ​​SARS-CoV S svolge un ruolo importante nel legame recettore e induzione di specifici anticorpi neutralizzanti contro l'infezione da virus ^7-9. Pertanto, in questo protocollo, si descrivono nuovi metodi per lo sviluppo di un vaccino basato RBD subunità contro la SARS. In breve, la proteina ricombinante RBD (rRBD) è stato espresso in supernatante della coltura di cellule di mammifero 293T per ottenere una proteina correttamente ripiegata con conformazione corretta e l'immunogenicità di alta ^6. La transfezione della codifica RBD plasmide ricombinante per le cellule è stata poi effettuata utilizzando un metodo di fosfato di calcio trasfezione ^6,10 con alcune modifiche. Rispetto al metodo di trasfezione lipidi ^11,12, questo metodo modificato fosfato di calcio transfezione è più conveniente, più facile da gestire, e ha il potenziale per raggiungere elevata efficacia una volta un complesso di transfezione con dimensioni adatte e la forma è formata ^13,14. Infine, un saggio di neutralizzazione pseudovirus SARS è stato introdotto nel protocollo e utilizzati per rilevare l'attività neutralizzante di sieri di topi vaccinati con proteine ​​rRBD. Questo test è relativamente sicuro, non comporta alcuna infettive SARS-CoV, e può essere eseguito senza la necessità di un laboratorio di biosicurezza-3 ^15.

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato anche per la progettazione e lo studio vaccini a subunità ricombinanti contro altri virus con classe I proteine ​​di fusione, per esempio, l'HIV, il virus respiratorio sinciziale (RSV), virus Ebola, virus dell'influenza, così come virus Nipah e Handra. Inoltre, i metodi per generare un pseudovirus e, successivamente, che istituisce un saggio di neutralizzazione pseudovirus può essere applicato a tutti questi virus.

Protocollo

1. Ricombinante SARS-CoV RBD proteine ​​preparazione

1. Preparare fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione
   1. 2X preparazione tampone HBS: Mescolare 16 g di NaCl, 0,4 g di Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O e 13,0 g di HEPES. Regolare il pH a 7,00 e portare il volume totale di 1000 ml di acqua distillata. Dopo il filtraggio la soluzione per la sterilizzazione, aliquota e conservarlo a -20 ° C.
      Suggerimento: Ogni variazione del valore di pH potrebbe influenzare i risultati di trasfezione. Quindi, si consiglia di testare diversi valori di pH intorno a 7,00 (per esempio, 6,99, 7,00 o 7,01) e trovare la migliore per la trasfezione con il metodo introdotto di seguito.
   2. 2,5 M CaCl ₂ Preparazione: Aggiungere 73,5 g di CaCl ₂ * 2H ₂ O in acqua distillata in un volume finale di 200 mL. Filtrare la soluzione e conservare a -20 ° C.
2. Trasfezione plasmide ricombinante e purificazione di proteine
   1. Dividere le celle 293T al 50-70% confluenza 24 ore prima di trasfezione. Crescere le cellule di T-175 palloni tessuto cm ² cultura in 40 ml di DMEM contenente 10% di siero (HI) FBS e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in 5% di CO _2.
   2. Tutti i reagenti di trasfezione deve essere portato a temperatura ambiente prima di trasfezione. Questi reagenti sono HBS 2X, 2.5M CaCl _2, DIH ₂ O, e rRBD plasmide ^6.
      Suggerimento: Il plasmide ricombinante finale costrutto usato per l'espressione delle proteine ​​dovrebbe contenere un peptide segnale per garantire la secrezione di proteine ​​ricombinanti espresse al supernatante della coltura. Un 6x suoi tag possono essere aggiunti al C-terminale della proteina espressa per la purificazione facile.
   3. Preparare un 50 ml (A) e uno da 15 ml (B) BD tubo Falcon, e aggiungere i reagenti per i tubi, come indicato nella tabella 1. Aggiungi 2X tampone HBS ad A. Tubo in tubo B, aggiungere 2,5 M CaCl ₂ e rRBD plasmide, e portare il volume al requisito in DIH ₂ O.
      

      A. Un T-175 cm 2 cultura fiasco tessuti (4000 microlitri / cilindro): prepararsi per l'espressione rRBD
      Un tubo		Tubo B
      HBS 2X	2000 microlitri	2,5 M CaCl 2	200 l
      		rRBD DNA plasmidico	40 mcg
      		DIH 2 O a	2000 microlitri
      B. One 100 mm scatola di Petri (1000 ml / piatto): prepararsi per la produzione di pseudovirus SARS
      Un tubo		Tubo B
      HBS 2X	500 microlitri	2,5 M CaCl 2	50 microlitri
      		DNA plasmidico SARS-CoV S	5 mcg
      		HIV-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE)	5 mcg
      		DIH 2 O a	500 microlitri

      Tabella 1. Miscela di preparazione Transfection e volumi
      I volumi elencati nella Tabella 1 sono per una unità di trasfezione. Se più fiaschi o piatti vengono utilizzati per la transfezione, regolare i volumi di conseguenza.
   4. Aggiungere il DNA di calcio soluzione in B tubo nel tubo A in maniera goccia a goccia, pur mantenendo costante e dolce mescolando in un vortice. Lasciate il composto a temperatura ambiente per 20-30 min. La chiave per il successo di trasfezione fosfato di calcio dipende dalle dimensioni e la forma del precipitato formato. Così, la miscela deve essere costantemente in agitazione e lentamente per soddisfare questo requisito e, di conseguenza, migliorare l'efficacia di trasfezione.
   5. Aggiungete il composto in maniera goccia a goccia e anche in cellule 293T (4000 microlitri / fiasco). Cellule cultura in incubatore a 37 ° C in 5% di CO _2.
   6. Sostituire il terreno di coltura fresca senza siero OPTI-MEM ho ridotto-siero Media (50 mL / beuta) 8-10 ore dopo la trasfezione. Continuare a celle di coltura per due giorni nelle stesse condizioni.
   7. Raccogliere il supernatante contenente proteine ​​espresse rRBD 72 h post-trasfezione. Centrifugare a 6000 rpm per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Aggiungi cocktail inibitore della proteasi per il supernatante raccolto e conservare a 4 ° C durante la notte.
   8. Il giorno dopo, purificare rRBD proteina ricombinante dal supernatante della coltura utilizzando le istruzioni Ni-NTA produttore Superflow successivo.
   9. Concentrato di proteine ​​purificate utilizzando Amicon Ultra tubi concentrazione -15. Dopo la concentrazione di proteine,aggiungere PBS ai tubi concentrazione e centrifugare di nuovo per rimuovere imidazolo in tampone di eluizione. Calcolare la concentrazione di proteine ​​e conservare le proteine ​​purificate a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Immunizzazione del mouse e Prelievo dei campioni

1. Preriscaldare Sigma sistema adiuvante (SAS) a 40-45 ° C secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 1 ml di PBS per flacone e mescolare accuratamente.
2. Preparare proteina-adiuvante emulsione secondo il protocollo nella tabella 2. Pipetta calcolato proteina rRBD in un tubo di 1,5 ml. Aggiungere uguale volume di SAS adiuvante per il tubo e agitare vigorosamente per 2-3 minuti per formare emulsione.
   Suggerimento: I volumi elencati nella tabella 2 sono per un mouse. Regolare i volumi secondo i numeri del mouse effettivamente utilizzato. Per ogni gruppo, si mescolano le proteine ​​e adiuvante necessari per ogni vaccino. Sempre preparare un campione in più per la vaccinazione per garantire l'accuratezza.
   

   Gruppo	1 ° vaccino (200 l / mouse)	2 ° vaccino (200 l / mouse)	3 ° vaccino (200 l / mouse)
   rRBD proteina	20 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS	10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS	10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS
   PBS controllo	100 ul PBS + 100 ul SAS	100 ul PBS + 100 ul SAS	100 ul PBS + 100 ul SAS

   Tabella 2. Mouse immunizzazione protocollo
3. Per via sottocutanea in prima serata immunizzare femminile topi BALB / c (4-6 settimane, 5 topi / gruppo), e aumentare due volte con rRBD e SAS, come indicato nella tabella 2. Usa PBS gruppo come il controllo. Il sito per iniezioni sottocutanee di solito scelto è la pelle flaccida tra le scapole. In alternativa, l'addome ventrale è comunemente usato, perché è più facile da iniettare, e può osservare eventuali perdite dai siti di iniezione. Quando dosi ripetute di vaccini vengono utilizzati, è facile selezionare i siti di iniezione diversi, evitando potenziali reazioni cutanee locali.
4. Bleed topi via retro-orbitale con anestetico prima vaccinazione e 10 giorni dopo ogni vaccinazione, e il calore siero a 56 ° C per 30 minuti per inattivare il complemento. Conservare il mouse siero a -20 ° C fino al momento dell'uso.

3. Neutralizzazione di rilevamento utilizzando neutralizzazione saggio Pseudovirus

1. Preparare pseudovirus SARS
   1. Dividere le celle 293T in 100 piatti della cultura millimetro di tessuto di Petri (2x10 ⁶ cellule / piatto) 16 h prima di trasfezione, le cellule e far crescere come sopra.
   2. Preparare i reagenti di trasfezione, come indicato nella tabella 1. Proteine ​​co-trasfezione una codifica plasmide SARS-CoV S e una codifica plasmide Env-difettoso, luciferasi che esprimono genoma dell'HIV-1 (pNL4-3.luc.RE) con fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione.
   3. Sostituire media con 10 ml fresca DMEM contenente 10% FBS e 1% P / S 8-10 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il supernatante contenente pseudovirus SARS 72 h post-trasfezione.
   4. Pseudovirus filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
2. SARS pseudovirus test di neutralizzazione
   1. Dividere le celle 293T esprimono SARS-CoV recettore ACE2 (ACE2/293T) a 10 ⁴ cells/100 microlitri / pozzetto in piastre da 96 pozzetti tessuto cultura 16 h prima dell'infezione.
   2. Diluire pseudovirus SARS da 2 volte a rilevare il titolo del virus nelle cellule ACE2/293T.
   3. Serialmente diluire i sieri del mouse in lastre di tessuto da 96 pozzetti cultura, e aggiungere uguale volume di titolato pseudovirus SARS. Preincubare le piastre a 37 ° C per 1 h.
   4. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri della Sera-pseudovirus miscela di cellule ACE2/293T, e continuano a crescere le cellule a 37 ° C in 5% di CO _2. Aggiungi fresca DMEM 24 ore più tardi.
   5. Rimuovere completamente sovranatanti dalle piastre 72 ore dopo l'infezione. Aggiungi 1X luciferasi cultura reagente di lisi cellulare (60 microlitri / pozzetto), e promuovere la lisi cellulare con costante agitazione di piastre per 1-2 ore a temperatura ambiente.
   6. Trasferimento lisati cellulari (50 ml / pozzetto) in piastre luminometro (Microfluor piastre a 96 pozzetti). Aggiungere substrato luciferasi (50 ml / pozzetto) inclusi nel sistema di analisi luciferasi, e di rilevare l'attività relativa luciferasi in Ultra 384 luminometro.
   7. Calcolare titolo pseudovirus SARS neutralizzazione e presente come il 50% titolo di anticorpi neutralizzanti (NT ₅₀₎ ^6.

Discussione

Densità delle cellule è un fattore importante per l'efficacia di fosfato di calcio a base di trasfezione. Nella nostra esperienza, meno del 70% confluenza delle cellule porta i migliori risultati. Pertanto, al fine di migliorare l'efficienza di trasfezione, si raccomanda che la densità delle cellule mantenuto a circa 50-70% di confluenza. Il fosfato di calcio metodo di trasfezione è generalmente ritenuto meno efficiente rispetto ai metodi di transfezione altri, come la transfezione lipidi ^16. Tuttavia, in questo protocollo, abbiamo usato una versione modificata del metodo di fosfato di calcio trasfezione cui costante e lenta miscelazione della soluzione di trasfezione in un vortice assicura la formazione di un precipitato con la dimensione appropriata e la forma, migliorando così l'efficienza di trasfezione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Na2HPO4*7H2O	Sigma-Aldrich	S2429
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2*2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
DMEM	Invitrogen	12430
HI FBS	Invitrogen	10438
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
OPTI-MEM I Medium	Invitrogen	31985
Protease inhibitor cocktail	Roche Group	11836170001
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30450
Sigma adjuvant system	Sigma-Aldrich	S6322
Luciferase assay system	Promega Corp.	E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X)	Promega Corp.	E1531
Amicon Ultra - 15	EMD Millipore	UFC901024
Microfluor 96-well plates	Thermo Fisher Scientific, Inc.	7905
Ultra 384 luminometer	Tecan Group Ltd.