Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

Riepilogo

Descriviamo un Flippase indotta intersezionale Gal80/Gal4 repressione (FINGR) metodo, che consente tessuto-specifici FLP per determinare Gal80 pattern di espressione. Ovunque GAL4 e si sovrappongono FLP, GAL4 espressione è attivata (Gal80 lanciato verso l'esterno) o disattivare (Gal80 capovolte). Il metodo FINGR è versatile per l'analisi clonale e la mappatura del circuito neurale.

Abstract

Il GAL4 / SUP metodo binario è potente per la manipolazione dei geni e circuiti neurali in Drosophila. Per la maggior parte degli studi neurobiologici, tuttavia, è raramente GAL4 espressione tessuto-specifica da consentire di correlazione precisa del circuito con letture comportamentali. Per superare questo grande ostacolo, abbiamo recentemente sviluppato il metodo FINGR per ottenere una più restrittiva GAL4 espressione nel tessuto di interesse. Il metodo FINGR ha tre componenti: 1) il sistema tradizionale Gal4/UAS, 2) una serie di FLP / FRT-mediata Gal80 strumenti di conversione e 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). GAL4 viene utilizzato per definire i circuiti neurali primarie di interesse. Confrontando i GAL4 con un UAS-effector, come UAS-MJD78Q o UAS-Shi ^ts, regola l'attività neuronale, che a sua volta si manifesta con alterazioni del comportamento volare. Con un ulteriore UAS-reporter come UAS-GFP, il circuito neurale coinvolta nel comportamento specifico può essere contemporaneamente mappati per l'analisi morfologica. Per GAL4 linee con espressione ampia, GAL4 espressione può essere limitato utilizzando due complementari Gal80 strumenti di conversione: vasca ^P> Gal80> ('flip out') e vasca ^P> fermare> Gal80 ('flip'). Infine, gli investigatori Gal80 possibile attivare o disattivare, rispettivamente, con l'aiuto di tessuto-specifici ET-FLP. Nel flip-in modalità, Gal80 sarà reprimere GAL4 espressione ovunque GAL4 e ET-FLP si intersecano. Nel flip-out modalità Gal80 allevia GAL4 repressione nelle cellule in cui si sovrappongono GAL4 e FLP. Entrambi gli approcci consentono la limitazione del numero di cellule nel GAL4 definiti circuiti, ma in un modello inverso. Il metodo FINGR è compatibile con la vasta collezione di GAL4 linee nella comunità mosca e altamente versatile per le tradizionali analisi clonale e per la mappatura dei circuiti neurali. In questo protocollo, dimostriamo la mappatura dei pattern di espressione FLP di selezionare ET-FLPx2 linee e l'efficacia del metodo FINGR in cellule visive. Il principio del metodo FINGR dovrebbe essere applicabile anche ad altri organismi modello genetico in cui vengono utilizzate Gal4/UAS, Gal80, e FLP / FRT.

Protocollo

1. Ceppi di Drosophila

1. GAL4 driver:
   GMR-GAL4, che esprime GAL4 in cellule visive.
2. UAS linee
   SUP-MJD78Q (o UAS-polyQ), che causa la degenerazione neurale in GAL4 cellule che esprimono.
   UAS-GFP, che esprime GFP in GAL4 cellule che esprimono.
3. FLP linee
   Ey-FLP, che esprime FLP di fotorecettori e in sottogruppi di regioni del cervello.
   ET-FLPx2 linee, che sono enhancer-trap righe che contengono due copie della FLP (FLP-IRES-FLP). Abbiamo generato ~ 1.000 ET-FLP linee (Bohm et al., 2010), la cui espressione modelli devono ancora essere caratterizzati. Qui, descriviamo la caratterizzazione del pattern di espressione di selezionare ET-FLPx2 nel larvale e adulto volare sistema nervoso centrale (SNC).
4. FLP giornalista
   yw, actina ^P> CD2> GAL4; SUP-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), che riporta il pattern di espressione di ET-FLPx2 attraverso actina ^P> GAL4; UAS-GFP su FLP-mediata escissione ricombinazione di> CD2.
5. Due complementari Gal80 di conversione strumenti
   Vasca ^P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), il flip-out costruire, che esprime costitutivamente Gal80 in tutti i tessuti guidata da un promotore forte tubulina. Su FLP-mediata ricombinazione,> Gal80 viene girato fuori e Gal80 espressione è risolto solo in ET-FLPx2 che esprimono tessuti.
   Vasca ^P> fermare> Gal80 (Bohm et al., 2010), il flip-in costruzione, che non esprime Gal80 in condizioni normali. Gal80 espressione è attivato dal promotore tubulina solo in ET-FLPx2 che esprimono i tessuti in cui FLP ribalta fuori fermare> e lanci in Gal80.
6. Vola per testare l'attività FLP in un occhio composto
   GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> fermare> Gal80 (Bohm et al, 2010.), Che è degenerata e gli occhi depigmentati. In FLP cellule che esprimono fotorecettori, espressione polyQ è spento dopo Gal80 flip-in.
   GMR-GAL4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) vasca ^P> Gal80>, che ha occhi normali. In FLP cellule che esprimono fotorecettori, espressione polyQ è attivato a seguito Gal80 flip-out.

2. Reagenti

PBS (PBS, 1X), pH 7,4.
4% paraformaldeide (PFA), diluito in PBS dal 16% PFA, EM grado (Cat # 15710, Scienze Microscopia Elettronica, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS contenente 0,1% Triton X-100 (Sigma)
Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Ibridoma Banca, Università di Iowa), macchie di tutti i neuroni in Drosophila.
Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Ibridoma Banca, Università di Iowa), macchie di cellule gliali in Drosophila.
Alexa 594 pollo contro anticorpo secondario del mouse (Invitrogen)

3. Mappatura del pattern di espressione di enhancer-trap linee FLPx2 (* passaggi critici)

1. Raccogliere le femmine vergini dal yw, actina ^P> CD2> GAL4; UAS GFP-line e croce per i maschi di singoli ET-FLPx2 linee. La prima serve come reporter GFP per l'espressione del tessuto di ET-FLP.
2. * Dissect vagare 3 _° instar larve F1, mantenere il sistema nervoso centrale (cioè il cervello e il cordone nervoso ventrale, VNC) e la parete del corpo, fissare per 1 ora nel 4% PFA su ghiaccio, lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio seguito da lava 3X con PBT.
   Dissezione
   1. Rimuovere vagare 3 ^° instar larve F1 e metterli in un piatto pulito Sylgard (35 mm x 10 mm piastra di Petri riempita con 2 grammi di Sylgard - misti secondo per la produzione di istruzioni).
      1. Rimuovere residui di cibo con pennello
   2. Riempire il piatto con gelida 1XPBS e posto sul ghiaccio per anestetizzare le larve
   3. Tenere la bocca ganci di una larva con un paio di pinze e prendete la cuticola vicino lo spiraglio estensione anteriore con un altro paio di pinze e sbucciate le cuticole verso la fine posteriore. La CNS sarà allegata alla bocca ganci con le ghiandole salivari, intestino, e dischi immaginale.
   4. Rimuovere il tessuto in eccesso e dischi immaginale che circondano il sistema nervoso centrale.
   5. Trasferire il sistema nervoso centrale in un PBS pieno di ben 3 pirofila.
      1. Un siliconato P200 punta della pipetta può essere utilizzata per evitare l'essiccamento dei tessuti.
   6. Fix per 1 ora in 200 ml di PFA 4% su ghiaccio.
      1. Assicurarsi che il sistema nervoso centrale è completamente immersa nel PFA.
         1. Se il sistema nervoso centrale galleggianti, questo suggerisce in genere che il CNS non è adeguatamente puliti dal tessuto circostante.
   7. Lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio seguito da lavaggi 3X con PBT.
3. * Dissect del sistema nervoso centrale di mosche F1 adulti.
   1. Anestetizzare le mosche con la CO ₂ o posto le mosche contenute all'interno di una fiala vuota in ghiaccio per 10 minuti.
   2. Adulto luogo vola in un 95% EtOH pieno di piatto di vetro in ghiaccio per 30 sec.
   3. Trasferire la mosche adulte in un piatto di vetro riempito 1XPBS sul ghiaccio.
      1. Lavare 3X con ghiacciata 1X PBS per rimuovere residui di EtOH
   4. Mettere una mosca in una Sylga 35 millimetri° piatto pieno di ghiaccio, freddo PBS 1X
   5. Posizionare il lato ventrale rivolto verso l'alto e inserire una penna piccolo insetto (pin minutiens 0,1 mm) a metà strada attraverso l'addome.
      1. Usando un paio di pinze tenere la base delle gambe e rimuovere le gambe con un altro paio di pinze.
   6. Rimuovere la cuticola testa
      1. Mentre afferra la proboscide con un paio di pinze, un altro luogo sotto l'occhio e la buccia la cuticola verso la linea mediana dorsale della testa volare.
      2. Prendete l'altro occhio e togliere la cuticola rimanente dall'altra parte.
      3. Uso di pinze taglienti e / o l'ago di tungsteno affilato, rimuovere il tessuto tracheale che circonda il cervello
         1. Pulizia impropria della trachea si tradurrà in una forte auto-fluorescenza, ostruendo espressione GFP, e permettere al cervello di galleggiare durante fissaggio
   7. VNC Dissection
      1. Rimuovere la cuticola toracica
         1. A partire dalla fine posteriore del torace, posto due pinze su ogni lato della preepisternum 3 ^° (cioè, afferrando la base delle zampe posteriori).
         2. Separare delicatamente la cuticola dalla linea mediana ventrale, ripetere questo fino a raggiungere la base del collo.
         3. Allargare delicatamente le due metà della cuticola toracica esporre il VNC
      2. Avanti rimuovere l'addome dal torace. Durante l'utilizzo di una pinza per tenere il torace alla base seconda tappa, utilizzare un altro paio di pinze per afferrare l'addome in prossimità del primo sternite addominale e tirare fuori l'addome.
      3. Per rimuovere il VNC dal tessuto circostante toracica. Tenere la zona omerale con un paio di pinze e con un altro paio di pinze dolce lacrima di distanza la maggior parte della carcassa toracica.
      4. A questo punto ci dovrebbe essere un anello di tessuto connettivo che circonda il connettivo cervicale (collo). Utilizzando due pinze strappare l'anello a parte.
      5. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso toracica che circonda il VNC
   8. Trasferire il cervello e VNC per ben 9-pirofila contenente PBS 1X sul ghiaccio
      1. Un siliconato P200 punta della pipetta può essere utilizzata per evitare l'essiccamento del tessuto
4. * Fissare il sistema nervoso centrale adulto per 1 ora nel 4% PFA su ghiaccio e lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio e 3 volte con PBT.
5. Incubare la preparazione adulti SNC o del sistema nervoso centrale larvale e la parete del corpo a 4 ° C per una notte con gli anticorpi di entrambi i neuroni (anti-Elav, 1:10) o glia (anti-Repo. 1:10). Lavare la preparazione 5X con PBT.
6. Incubare con una preparazione adulto o larvale con Alexa 594 pollo contro anticorpo secondario del mouse (1:100) a temperatura ambiente per 2 ore, e lavare la preparazione con PBS.
7. Montare il sistema nervoso centrale larvale o adulto in una diapositiva. Per conservare la forma naturale del sistema nervoso centrale, utilizzare un a forma di O anello di plastica (Label Rinforzo chiaro, Avery Dennison Office Products, Brea, CA) sulla diapositiva come un mini-ponte di sospendere la polizza di copertura.
8. Esaminare la preparazione di pattern di espressione GFP e Elav (o pronti contro termine) sotto un microscopio a fluorescenza.

4. L'applicazione di due complementari Gal80 di conversione strumenti di repressione GAL4 in fotorecettori

1. Flipping Gal80 per il tramite di vasca ^P> Gal80> (Figura 5A).
   1. Raccogliere i maschi dalla GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> Gal80 line>. Si noti che gli occhi composti sono normali in queste mosche.
   2. Accoppiarsi con Ey-FLP vergini.
   3. Raccogliere le mosche F1 e esaminare il fenotipo occhi.
2. Flipping Gal80 in via vasca ^P> fermare> Gal80 (Figura 5B).
   1. Raccogliere GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> fermare> Gal80 mosche maschio e esaminare il fenotipo occhi. Nota il degenerato e gli occhi depigmentati in queste mosche rispetto ai ceppi wild-type (Canton-S)
   2. Accoppiarsi con Ey-FLP vergini;
   3. Raccogliere le mosche F1 e esaminare il fenotipo occhi.
3. Seleziona ET-FLPx2 linee con espressione nelle cellule dei fotorecettori

Passi 4.1 e 4.2 può essere ripetuta con ET-FLPx2 linee che esprimono FLP in un sottogruppo di cellule visive. In alternativa, o il GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> fermare> Gal80 mosche o la GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> Gal80> vola può essere attraversato a singoli ET-FLPx2 linee a schermo per le linee che esprimono FLP di cellule visive. Prezioso ET-FLPx2 linee sono quelle che solo FLP esprimere in un sottoinsieme o fotorecettori singola (Figura 6).

5. Rappresentante risultati

Il pattern di espressione di uno specifico ET-FLPx2 linea può essere prontamente esaminati e documentati nelle larve F1 o adulto vola derivato dalla croce tra yw, actina ^P> CD2> GAL4; UAS-GFP vergini e ET-FLPx2 maschi (Figura 1) . Tipicamente, 04:57 replica degli animali sezionati e F1 sono esaminati per determinare la riproducibilità del pattern di espressione FLP (Bohm et al., 2010). La figura 2 mostra il pattern di espressione di FLP di ET-173A FLPx2 linea nel SNC larvale e adulto. Il modello FLP può essere ulteriormente analizzati utilizzando un marker neuronale o gliale (Figura 3 e 4).

I risultati mostrati nella Figura 7 illustrare l'efficacia del Gal80 flip-in e flip-out dei sistemi di repressione intersezionale di GAL4 seguenti FLP-mediata ricombinazione. La vasca ^P> fermare> Gal80 costruire non sembra avere alcuna espressione che perde di Gal80 (in base alla degenerazione uniforme e depigmentazione dei fotorecettori), e tuttavia è efficace al 100% in flipping Gal80 con l'aiuto di eyFLP per reprimere GMR- GAL4 e ripristinare l'occhio alle apparenze normali (Fig. 7A). Al contrario, vasca ^P> Gal80> completamente reprime GMR-GAL4 prima dell'introduzione di eyFLP. A seguito di Gal80 flip-out, GMR-GAL4 unità UAS-polyQ espressione, portando a degenerare e gli occhi depigmentati (Fig. 7B). In questo esempio abbiamo usato un pan-photorecetor FLP per mappare 'circuiti' il fotorecettore, ma non esaminare le conseguenze comportamentali. Utilizzando approcci simili con comportamentale rilevante GAL4 linee, abbiamo mappato parte del CCAP-GAL4 circuito che regolano l'espansione alare nei moscerini adulti (Bohm et al., 2010). Crediamo che il metodo FINGR saranno utili per aiutare la nostra comprensione delle basi neuronali del comportamento.

Figura 1. . Esaminato il pattern di espressione di una linea-FLPx2 ET Il modello di espressione FLP (ovali blu) da un ET-FLPx2 linea può essere determinata attraversando un ET-FLPx2 maschio (in alto a sinistra) con un actina ^P> CD2> GAL4; UAS- GFP vergine (in alto a destra). Ubiquitous Actina ^P> GAL4 espressione nella femmina genitori è ostacolato da l'inserimento del (triangoli grigi) sequenza FRT affiancato CD2. Nella progenie F1, FLP sarà accise la sequenza CD2, permettendo actina ^P> GAL4 di guidare UAS-GFP espressione.

Figura 2. Pattern di espressione di un ET-FLPx2 linea nel larvale e adulto sistema nervoso centrale. Queste immagini ritraggono il sistema nervoso centrale (cervello e dei nervi del midollo ventrale, VNC) sezionato dalla prole prodotta da accoppiamento yw, actina ^P> CD2> GAL4; UAS-GFP genitori di ET-173A FLPx2 linea. Ricombinando il> CD2 cassetta>, FLP attiva actina ^P> GAL4 espressione (l'espressione conseguente della SUP-GFP). Quindi, il modello GFP rapporti FLP cellule che esprimono. Un pannello mostra il pattern di espressione larvale FLP che, pannello B mostra il modello di adulto espressione in linea 173A.

Figura 3. Caratterizzazione di tipi di cellule che esprimono flippase a ET-FLPx2 Linea # 688A. A, A immagine composita di una larva fisso F1 3 ^° instar colorati con anti-REPO da un incrocio tra ET-FLPx2 linea # 688A e un reporting GFP Flippase linea. BD, un alto ingrandimento (Plan-Apochromat Zeiss 63x olio) tesi a partire dalla fine posteriore di un VNC da una larve di 3 ^° stadio.

Figura 4. Caratterizzazione di tipi di cellule all'interno del corpo fungo di ET-FLPx2 Linea # 150. AC, A ad alto ingrandimento dell'immagine (63x immersione olio) del corpo dei funghi da un fisso larva F1 3 instar colorati con anti-REPO.

Figura 5. Illustrazione di Gal80 Strategie Flip-in e flip-out. R. Nel flip-out strategia, tubulina promotore-driven Gal80 (Vasca ^P> Gal80>) è costitutivamente attivo, con la conseguente repressione di GMR-GAL4 e una wild-type fenotipo occhi (occhi rossi). Questa repressione è stato rimosso con l'introduzione di FLP (viola), che si capovolgerà Gal80 fuori (al centro, rosso) e permettere GMR-GAL4 a guidare UAS-polyQ espressione. Ciò si traduce in degenerazione cellulare dei fotorecettori (illustrato da puntini bianchi negli occhi). B. Nel reciproco del precedente strategia, tubulina promotore-driven Gal80 espressione è interrotto da FRT (grigio triangolo) affiancato codone di "stop". In assenza di Gal80, GMR-GAL4 lega alla UAS-polyQ che causano la degenerazione neuronale in fotorecettori (illustrato da puntini bianchi negli occhi). Attraversando il GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> fermare> GAL80 maschi con femmine vergini che esprimono FLP nelle cellule dei fotorecettori, FLP (viola) catalizzerà ricombinazione nei siti FRT, ablazione del codone "stop" (al centro, rosso), consentendo così Gal80 espressione e la repressione di GMR-GAL4. Questa riserva il neurodegenerazione nelle cellule dei fotorecettori (illustrato dalla mancanza di wpunti Hite negli occhi).

Figura 6. L'applicazione del metodo FINGR in flipping Gal80 con l'ausilio di ET-FLPx2 Linea # 688A progenie F1 da un incrocio tra ET-FLPx2 linea # 688A vergine di GMR-GAL4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 maschile. La mancanza di pigmento al centro della ommatidi dell'occhio rappresenta l'espressione FLP in linea # 688A. In questa zona Gal80 soppressione della GMR-GAL4 è stato sollevato permettendo al GAL4 di guidare UAS-polyQ.

Figura 7. L'applicazione del metodo FINGR in flipping Gal80 dentro o fuori da intersecare GAL4 in fotorecettori. A. La vasca ^P> fermare> Gal80 flip-nel sistema limita GAL4 espressione in una FLP-dipendente. In GMR-GAL4, UAS-polyQ; vasca ^P> fermare> GAL80 le mosche, le cellule sono fotorecettori degenerano e depigmentati (mosca a sinistra). Dopo l'introduzione di eyFLP, Gal80 è espressa nelle cellule dei fotorecettori, con conseguente repressione pieno di GMR-GAL4, che a sua volta si spegne il polyQ espressione e produce le mosche con occhi normali (volare a destra). B. La vasca ^P> Gal80> capovolgere Partenza sistema funziona in modo opposto, come la vasca ^P> fermare> Gal80 flip-nel sistema. Vasca ^P> Gal80> costitutivamente GAL4 reprime e sopprime l'espressione di polyQ (a sinistra volare, con occhi normali). Dopo l'introduzione di eyFLP, Gal80 è lanciato verso l'esterno a partire da cellule dei fotorecettori, alleviando la soppressione della GMR-GAL4 e accendere il polyQ espressione. Questo porta a degenerare e mosche con occhi depigmentati (volare a destra).

Discussione

Il sistema Gal4/UAS è stata ampiamente e usato con successo da Drosophilists per vari studi biologici (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Ad oggi, la comunità mosca ha generato migliaia di promotore-driven e enhancer-trap GAL4 linee. Un punto di forza del metodo FINGR è che è compatibile con il sistema Gal4/UAS, che consente di ampliare significativamente il potere di GAL4 negli studi di Drosophila.

Una importante applicazione del metodo FINGR è quello di ottimizzare i circuiti neurali alla base del comportamento attraverso Gal4/Gal80 incrocio. Questi comportamenti possono includere, ma non sono limitati a, apprendimento e memoria, corteggiamento, il sonno, e il ritmo circadiano. Il metodo FINGR può anche essere utilizzato per mappare i neuroni critiche che tendono a neurodegenerazione nella modellazione umana malattie neurodegenerative come l'Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e di Parkinson. Allo stesso modo, foci di neuroni o circuiti neurali che mediano cruciale per la cocaina, l'alcol e dipendenza da altre sostanze possono essere mappati con il metodo FINGR. Va notato che Gal4s condizionale (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) potrebbero essere utilizzati con il metodo FINGR al fine di ottenere il controllo temporale dei circuiti neurali e comportamenti. Modifica del Gal80 strumenti di conversione tramite un sensibile alla temperatura Gal80 (Gal80 ^ts, McGuire et al., 2003) in grado di produrre vasca ^P> fermare> Gal80 ^ts o vasca ^P> Gal80 ^ts>, aggiungendo un'ulteriore flessibilità temporale nella manipolazione circuito. Al di là del sistema nervoso, il metodo FINGR è ugualmente applicabile a limitare GAL4 espressione in sottoinsiemi di cellule se è l'ala o la gamba.

L'ET-FLPx2 linee saranno una risorsa preziosa per tutti i biologi Drosophila interessati FRT / FLP a base di analisi clonale (Xu & Rubin, 1993), tra cui MARCM (Lee & Luo, 1999). Si prevede inoltre che alcuni-FLPx2 ET linee può sostituire heatshock-FLP per la produzione di cloni riproducibile e per ripetute analisi morfologiche e comportamentali. Come enhancer-trap GAL4 linee, la maggior parte ET-FLPx2 linee è improbabile che siano espresse specificamente nelle cellule del proprio interesse. La maggior parte delle linee esprimerà FLP nelle cellule di interesse e in altre cellule o tessuti pure. Tuttavia, la mancanza di 'specificità del tessuto' di entrambi i GAL4 e ET-FLPx2 non sarà una grande preoccupazione per il metodo FINGR finché la loro regione di sovrapposizione è auspicabile per un particolare esperimento. FINGR è progettato per girare due 'grandi' sistemi in un raffinato.

I metodi illustrati in questi protocolli sono piuttosto standard e dovrebbe essere riproducibile. I passi principali cautelativa, che richiedono l'attenzione sono la scelta e l'utilizzo del fissativo. Fissativi diversi PFA dovrebbero essere evitati in quanto spegnerà il segnale GFP. Abbiamo anche notato che il piatto dissezione non deve essere utilizzato per il fissaggio in PFA per evitare la possibilità che l'espressione FLP non sarà affidabile riportato da GFP.