Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Riepilogo

Un versatile tecnica di litografia plasma è stata sviluppata per generare modelli di superficie stabile per guidare l'attaccamento cellulare. Questa tecnica può essere applicata a creare reti di cellule, comprese quelle che imitano i tessuti naturali ed è stato utilizzato per lo studio dei diversi tipi di cellule distinte.

Abstract

Manipolazione sistematica di un microambiente cellulare con risoluzione micro e nanometriche è spesso necessaria per decifrare vari fenomeni cellulare e molecolare. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato una tecnica di litografia plasma per manipolare il microambiente cellulare, creando una superficie modellata con dimensioni caratteristiche che vanno da 100 nm a millimetri. L'obiettivo di questa tecnica è quello di poter studiare, in modo controllato, i comportamenti delle singole cellule e gruppi di cellule e le loro interazioni.

Questo metodo litografia plasma si basa sulla modificazione selettiva della chimica di superficie su un substrato tramite il contatto di schermatura a bassa temperatura al plasma con uno stampo fisico. Questa schermatura selettiva lascia un modello chimico che può guidare l'attaccamento delle cellule e del movimento. Questo modello, o un modello di superficie, può essere utilizzato per creare reti di cellule la cui struttura in grado di simulare quella che si trova in natura e produce un ambiente controllabile per le indagini sperimentali. La tecnica è particolarmente adatto a studiare come fenomeno biologico che produce modelli di superficie stabile su substrati polimerici trasparenti in maniera biocompatibile. I modelli di superficie durare per settimane o mesi e può così guidare l'interazione con le cellule per lunghi periodi di tempo che facilita lo studio dei processi cellulari a lungo termine, quali la differenziazione e adattamento. La modifica alla superficie è principalmente di natura chimica, e quindi non introduce interferenze topografica o fisica per l'interpretazione dei risultati. Inoltre non comporta alcun sostanze dure o tossiche per raggiungere patterning ed è compatibile per la coltura di tessuti. Inoltre, può essere applicato a modificare i vari tipi di substrati polimerici, che per la possibilità di regolare le loro proprietà sono ideali e sono ampiamente usati in applicazioni biologiche. La risoluzione ottenibile è anche utile, come l'isolamento dei processi specifici come la migrazione, adesione, o vincolante permette discrete, le osservazioni chiaro al singolo livello multicella.

Questo metodo è stato impiegato per formare reti diverse di tipi cellulari diversi per le indagini che coinvolgono la migrazione, di segnalazione, formazione di tessuto, e il comportamento e le interazioni dei neuroni chiamati in giudizio in una rete.

Protocollo

1. Creazione di stampi utilizzati per patterning

1. Progettazione concettuale di modelli. I modelli sono creati che servono a formare reti di cellule, cellule contatto di controllo, isolare le cellule, imitare strutture naturali, o comunque guida adesione cellulare e di collocamento.
2. Computer-aided design o la creazione del modello CAD base e la creazione di fotomaschere. Il modello desiderato è stato progettato in software CAD, come AutoCAD, e viene quindi inviato ad una società esterna per produrre un fotomaschere.
3. Fotolitografia per la produzione di modello master. Vetrini sono modellati sia con un sottile resistere positivo o negativo di spessore resistere a seconda delle dimensioni della struttura creata. Vetrini sono utilizzati per la loro vantaggi di essere a basso costo, più forte di wafer di silicio e non producono polveri tanto quando rotto. In alternativa, altre strutture utili come reticoli di diffrazione può essere utilizzato come il modello master.
4. La slitta fantasia è collegato a una pila di diapositive che non sono stati fantasia. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa a flusso pulito per ridurre al minimo la polvere.
5. Creazione di stampi master. Un contenitore di leggermente più grande della pila di diapositive stagnola è stato creato per tenere la 30 g di Polidimetilsilossano (PDMS) che viene poi versato sulla superficie photolithographically fantasia per creare uno stampo iniziale. Il PDMS è degassificati e lasciato asciugare per 1-2 giorni.
6. Una volta indurito il PDMS è staccata del modello maestro e forma uno stampo per il prossimo passo.
7. 6 g di 2 epossidica parte (Devcon # 14310 (6 g) viene miscelato per 1 minuto e poi versato nello stampo master, degassata e ha permesso di curare. Degasaggio la resina epossidica si deve fare in fretta (<8 min) con bolla molti cicli di rottura e utilizzando soltanto un sottile strato prima che il set di resina epossidica e la rimozione bolla diventa impossibile rimuovere le bolle. Il 6 g usato produce uno strato sottile che facilita la rimozione rapida bolla.
8. Dopo un'ora, i 2 epossidica parte sarà curata in parte e più epossidica possono essere aggiunti in cima senza degassamento per produrre una struttura più spessa che è più facile da gestire nelle fasi successive. La resina epossidica viene poi lasciato asciugare per 1-2 giorni.
9. Una volta indurito, la resina viene rimosso dallo stampo maestro PDMS e nastro viene avvolto intorno allo stampo epossidica per formare un contenitore. Uno stampo di lavoro è poi creato versando PDMS sullo stampo epossidica, degasaggio il PDMS, e curando per uno o due giorni.
10. Una volta indurito, lo stampo di lavoro è staccata della resina epossidica e conservato per mantenere la pulizia.

2. Patterning di superfici con stampi per l'orientamento delle cellule

1. Piccole sezioni dello stampo di lavoro sono tagliati fuori e messi su una piastra di Petri in polistirolo. Le posizioni di queste sezioni muffa sono etichettati.
2. Un treppiede è formato da piccole sezioni e ponderati per assicurare il contatto conformazionale tra lo stampo di lavoro e la superficie piastra di Petri. Buon piazzamento può essere osservato, cercando sul fondo del piatto.
3. L'assemblea è posizionato nella camera di plasma. Trattamento al plasma è iniziato e continuato a 150 Pa a 29,6 W (potenza massima) per 10 minuti, con aria plasma.
4. Dopo il trattamento al plasma, lo stampo e contestazione peso vengono rimossi.
5. La piastra di Petri è posto sotto la luce UV per 10 minuti di sterilizzazione all'interno del cabinet biosicurezza e memorizzate fino a quando seminati con cellule.

3. Semina delle superfici con le cellule

1. SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastoma umano o di altre cellule sono coltivate utilizzando protocolli standard per il tipo di cellula.
2. La confluenza del SH-SY5Y CRL-2266 cellule di neuroblastoma umano è misurato visivamente prima della semina sulla superficie modellata.
3. Divisione cellulare standard è effettuato per rimuovere le cellule dalla superficie della loro capsula di Petri.
4. Le cellule, galleggiante, una volta liberi, sono seminati sulla superficie del piatto modellato Petri dopo essere stato diluito per ottenere la confluenza desiderata quando posizionati sulla superficie modellata.
5. Le cellule sono ammessi ad insediarsi e attaccarsi alla superficie.
6. Il piatto modellato Petri viene incubata per diverse ore a diversi giorni, mentre le cellule montare sul modello creato dal plasma.
7. Quando la coltura delle cellule di neuroblastoma, l'acido retinoico (10 mM) si aggiunge ogni giorno al fine di indurre le cellule a differenziarsi in un neurone stato simile. L'aggiunta di acido retinoico è fatta al buio.
8. L'acido retinoico è aggiunto al giorno per diversi giorni, dopo di che la differenziazione sarà osservabile.
9. Media è sostituita ogni 3-4 giorni.

4. Osservazione e analisi

1. Immagini periodico delle cellule vive o video sono tratte in modo da osservare il comportamento di cellule nel tempo. Per le immagini dal vivo, le cellule sono poste in un microscopio fase incubatore superiore che mantiene le cellule di CO a 37 ° C, 100% di umidità, e il 5% _2. Le cellule possono anche essere fissate e colorate per l'osservazione in fluorescenza
2. Le immagini o video delle celle che sono stati catturati vengono importati in un sistema di analisi delle immagini e misurazioni sono effettuate tra il tasso di crescita, le dimensioni delle cellule, la velocità di migrazione, la differenziazione, l'allineamento, la posizione di specifiche proteine, e altri.

5. Rappresentante dei risultati:

Un risultato tipico di attuare la tecnica litografica plasma è la formazione di un modello di cellule che assomiglia a una struttura arbitraria o naturale. Questo si vede nella figura 1a-b dove le linee e le reti di neuroni sono stati creati. Altri tipi di cellule possono essere usate così come visto in Figura 1c-d, che mostra le cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) e C2C12 cellule del muscolo scheletrico formando griglie. Materiali come il poli-L-lisina può anche essere modellato, Figura 1e per facilitare l'attaccamento di certi tipi di cellule e per altri usi. Nel caso dei neuroni mostrato, ciò che è stato creato sono reti di cellule che hanno le connessioni tra di loro. Questo riproduce ciò che avviene naturalmente nel cervello dove i neuroni hanno connessioni discrete tra cellule vicine che influenza il funzionamento del cervello. Con la creazione di una tale struttura in laboratorio, il numero, posizione, frequenza e altri fattori di connessioni possono essere sistematicamente controllata. Il risultato di queste arraignments può essere misurato visivamente e ingressi supplementari come chimico o la stimolazione elettrica può essere implementato per sondare il comportamento della rete.

Un risultato negativo sarebbe un modello di invaso o incompleti o un campione contaminato. Un modello incomplete o ricoperte deriverebbe da semina il substrato sia con celle troppo pochi o troppi, che non avrebbe fornito il modello con una quantità ideale di cellule. Inoltre, se il motivo non è progettato correttamente (ad esempio, linee troppo stretta) le cellule non sarà in grado di attaccare e crescere con successo su di esso. Nel caso di un campione contaminato, pulizia adeguata non sarebbe stato mantenuto durante uno dei passaggi anche se questo è raro quando si segue proprio protocollo di coltura delle cellule a causa del fatto che il modello al plasma sterilizza anche il substrato.

Figura 1. Patterning di cellule e proteine.

Discussione

Il metodo di indagine cellulare presentato qui permette la creazione di modelli complessi di reti pluricellulari che mimano le strutture biologiche e fornisce un metodo per produrre stimoli che sono subcellulare in natura che facilita poi le indagini sia di comportamento delle cellule e le risposte raggruppate singola cellula a fattori ambientali. L'utilizzo di questo metodo è semplice ma robusto come può essere rapidamente eseguita con apparecchiature a basso costo in laboratorio come la coltura cellulare. E 'anche fortemente cellulari sensibili, consente di osservare facilmente il comportamento risultante ed è per sua natura stabile per lunghi periodi di tempo, che permette di indagine il comportamento delle cellule lungo termine. Permette inoltre di una vasta gamma di esperimenti da eseguire in quanto è compatibile con molti tipi di cellule e possono creare modelli di arbitrario. La stabilità a lungo termine della tecnica deriva dal fatto che la funzionalizzazione della superficie impartita dal plasma è parte della superficie e non è un rivestimento o di altro livello che può essere rimosso o degradati. Se tenute sotto liquido, questo tipo di modifica può mantenere la sua capacità delle cellule di guida per mesi.

La parte più critica della sperimentazione necessaria per garantire risultati significativi è quello di creare il modello maestro che alla fine sarà utilizzato per l'orientamento delle cellule. Se questo modello non è progettato correttamente, le cellule non rispecchia in modo appropriato il modello e non possono produrre comportamenti utili. Parametri quali spessore della linea, la spaziatura modello, e altri possono influenzare notevolmente la compatibilità delle cellule con un motivo particolare, e in genere una serie di parametri quali possono essere creati sul fotomaschera iniziale allo schermo per il disegno più appropriato.

Altri importanti parametri relativi alla realizzazione di patterning includono la creazione dello stampo, il mantenimento di un ambiente privo di polvere, la semina delle cellule e sterilità generale di colture cellulari. Creazione dello stampo può essere effettuato mediante le fasi di trasferimento vari che sono impegnati a consentire ripetute PDMS mollare gli ormeggi uno stampo epossidica. Lo stampo epossidica è creato, perché non si degradano nello stesso modo come resistere alla muffa con le piccole, le strutture di alta proporzioni sotto getto ripetuto. Se lo stampaggio di trasferimento è fatto correttamente, le dimensioni e la resa non sarà influenzato, ma se fatto in modo errato, come da poco degasaggio, curando incomplete, o riscaldamento eccessivo, bolle, rugosità e deformazione di un pattern può verificarsi che influenza il risultato finale. In relazione a mantenere un ambiente privo di polvere, gli stampi devono essere tenuti il ​​più pulito possibile, come la polvere può interferire con il corretto contatto tra lo stampo di lavoro PDMS e la superficie, e quindi adeguato al plasma schermatura e patterning chimico. La densità di semina delle cellule inoltre deve essere ottimizzata per garantire che né le cellule troppo pochi o troppi abitano la zona pattern e sterilità deve essere mantenuto per evitare la contaminazione batterica e di altri delle cellule in uso.

La tecnica può anche essere integrato con altri elementi come microfluidica, microelettrodi, e sonde meccaniche. Questo fornisce stimoli alle cellule per replicare meglio varie condizioni fisiologiche durante la sperimentazione e le future attività è focalizzata sullo studio degli effetti di queste combinazioni

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Plasma e della Camera Vacuum Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Fluorescenza invertito e microscopio a contrasto di fase	Nikon	TE2000-U
Microscopio stadio superiore incubatore	AmScope	Modello TCS-100	Modificato per includere un contenitore che fornisce un ambiente appropriato
Piatto polistirolo Petri	VWR	25384-090
Polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Epossidica	Devcon	2 epossidica tonnellata chiaro # 14310
Cellula cultura dei media	Vari		Mezzi di comunicazione segue formulazioni standard per tipo di cellula
L'acido retinoico	Sigma	R2625