Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

Riepilogo

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata da CCR7-memoria T effettrici (TEM) linfociti. Qui mostriamo come attivare antigene-specifiche cellule TEM, inducono DTH adottivi nei ratti Lewis e monitorare la risposta infiammatoria.

Abstract

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici che si infiltrano nel sito di iniezione di un antigene contro il quale il sistema immunitario è stato innescato. La reazione infiammatoria è caratterizzata da arrossamento e gonfiore nel sito di uno stimolo antigenico. Si tratta di un modello pratico per determinare l'efficacia in vivo di immunosoppressori. DTH cutanea può essere indotta in seguito a trasferimenti adottivo di antigene-specifica dei linfociti T o per l'immunizzazione attiva con un antigene, e la successiva sfida intradermica con l'antigene per indurre la reazione infiammatoria della pelle in una zona determinata. Risposte DTH può essere indotto a vari antigeni, per l'ovoalbumina esempio, tubercolina, tossoide tetanico, o hemocyanin patelle buco della serratura. Tali reazioni possono anche essere indotta contro autoantigene, ad esempio per proteina basica della mielina (MBP) nei ratti con encefalomielite autoimmune sperimentale indotta con MBP, un modello animale di sclerosi multipla (1). Qui mostriamo come per indurre una risposta adottiva DTH nei ratti Lewis. Per prima cosa stimolare ovalbumina specifiche cellule T in vitro e iniettare queste cellule attivate via intraperitoneale a ratti ingenuo. Dopo che permette alle cellule di equilibrare in vivo per 2 giorni, ci sarà una sfida per i topi con ovalbumina nel padiglione di un orecchio, mentre l'altro orecchio wil ricevono soluzione salina. La reazione infiammatoria sarà visibile 3-72 ore dopo l'orecchio e lo spessore sarà misurato come indice di gravità DTH.

Protocollo

1. La stimolazione del ovalbumina specifici dei linfociti T

Riposo ovalbumina specifiche cellule T vengono stimolati con ovalbumina in presenza del combustibile irraggiato timociti di ratto Lewis (30 Gy) come cellule presentanti l'antigene (APC), in media stimolazione (Preparare in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamine + + 2ME Rat Siero + ovoalbumina, alle concentrazioni finale indicato nella lista dei materiali.)

Rat preparazione del siero

1. Prendiamo siero dai topi ci sacrifichiamo come donatori di timo.
2. I ratti sono profondamente anestetizzati per inalazione alotano e il sangue il più possibile è tratto da perfusione cardiaca (5-10 ml per topo) con siringhe da 10 ml e 23 G 1 "aghi, dopo di che i ratti sono immediatamente decapitati per assicurare la morte.
3. Il sangue viene lasciato coagulare per 10 minuti a 37 ° C seguita da 10 minuti sul ghiaccio.
4. Il coagulo viene rimosso e il liquido rimasto filate.
5. Il siero viene raccolto, sterile, filtrata e conservati a -20 ° C.

Preparazione delle cellule presentanti l'antigene

1. Prendete il timo di un topo decapitato con strumenti sterili e collocarlo in PBS contenente penicillina e streptomicina (PBS-PS), sul ghiaccio.
2. Prendete il timo ad un cappuccio colture di tessuti, pulirlo da coaguli di sangue e altri tessuti contaminare e tagliarlo a piccoli pezzi in un colino cella (Fisher # 08-771-2) posto in una capsula di Petri di 10 cm contenente 10 ml di PBS- PS.
3. Ogni pezzo viene premuto attraverso il filtro delle cellule utilizzando il retro di una sterile uno stantuffo della siringa ml. Raccogliere la sospensione singola cella in una provetta da 50 ml su ghiaccio.
4. Sciacquare il filtro cella con 20-40 ml di più di PBS-PS. Centrifugare la sospensione a 1250g e risospendere il pellet in PBS-PS, 5 ml / timo, sul ghiaccio.
5. Irradiare questa sospensione (30 Gy) in un irradiatore gamma e immediatamente lavare due volte con 50 ml di PBS-PS.
   
   Nota: I migliori donatori timo sono ratti adulti giovani, 5-7 settimane di età. Ratti fino a 10 settimane può essere utilizzato, ma il numero delle cellule diminuisce con il tempo. Genere non è importante, anche se alcune persone dicono che i maschi sono meglio i donatori timo. Usiamo sempre le femmine, perché tutti i nostri animali sono alloggiati nella stessa stanza e non vogliamo che maschi e femmine nella stessa stanza.
   

Stimolazione

1. Lavare i linfociti T, una volta e contarli.
2. Contare le cellule presentanti l'antigene.
3. Mescolare 3 x 10 ⁶ ovalbumina specifiche cellule T con 150 x 10 ⁶ APC in un piatto da 10 cm di Petri contenente 10 ml di terreno stimolazione.
4. Incubare per 48 ore a 37 ° C.

2. Trasferimento adottivo del ovalbumina specifici linfociti T

1. I ratti che usiamo come destinatari sono femmine 7-10 settimane di vita.
2. Contare i linfociti T, dovrebbero essere grandi e rotondi. Le cellule presentanti l'antigene sarà morto.
3. Centrifugare i linfociti T e risospendere loro a 10 x 10 ⁶ cellule / ml in PBS.
4. Iniettare 1 ml per via intraperitoneale con siringhe da 3 ml e 23 G 1 "aghi.

3. Sfida con l'antigene nell'orecchio

1. Due giorni dopo il trasferimento adottivo, iniettare 20 ml di un 1 mg / ml soluzione ovalbumina (antigene = necessario) da un orecchio e salino (o antigene irrilevante) a l'altro orecchio. Non filtrare la soluzione antigene come è possibile perdere aggregati che aumentare la reazione infiammatoria.
   
   Nota: I ratti devono essere anestetizzati per evitare movimenti. Se siete di mano destra, tenere l'orecchio tra il pollice sinistro e l'indice, l'indice è dentro l'orecchio e il topo rivolto verso l'alto.
   
   
2. Iniettare la soluzione nel padiglione dell'orecchio con 27G ½ "aghi. Prova a iniettare tutti i topi esattamente nello stesso luogo.

4. Misura della DTH

1. L'orecchio inizierà a girare rossa e gonfia come un segno di infiammazione. Misurare lo spessore di ciascun orecchio con una molla micrometro (per esempio il modello PK-0505 da Mitutoyo).
2. Prendere 5-6 misurazioni per ciascun orecchio ad ogni time-point e calcolare la media.
3. Il gonfiore massimo dovrebbe avvenire tra il 24 e 72 ore.

Discussione

La sfida antigenico può essere eseguita anche in altri siti, ad esempio nella pelle della schiena (2). Noi però scoprire che impegnativo. Utilizzando il padiglione dell'orecchio, come mostrato in questo video, permette per la misurazione più precisa della reazione DTH.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	12430-062	500ml
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine	Cambrex/BioWhittaker	17-718R	100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids	Sigma-Aldrich	R7131	NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins	Sigma-Aldrich	R7256	1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250	2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum			1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503	10 μg/ml final, in Stimulation Medium.