Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

Riepilogo

Ricombinante adeno-associato virus (rAAVs) vettori stanno diventando sempre più prezioso per In vivo Gli studi su animali. Ci descrivono come rAAVs possono essere prodotti in laboratorio e come questi vettori possono essere titolati a dare una lettura precisa del numero di particelle infettive prodotte.

Abstract

Negli ultimi anni ricombinante adeno-associato vettori virali (AAV) sono diventati sempre più preziosi per studi in vivo negli animali, e sono anche attualmente testato in studi clinici sull'uomo. Wild-type AAV è un non patogeno membro della famiglia Parvoviridae e intrinsecamente replica-carenti. Il profilo di trasduzione larga, bassa risposta immunitaria e la espressione del transgene forte e persistente ottenuto con questi vettori li ha resi uno strumento popolare e versatile per in vitro e in vivo di consegna del gene. rAAVs possono essere facilmente ea basso costo prodotta in laboratorio e, in base al loro profilo di sicurezza favorevole, sono in genere data una bassa classificazione di sicurezza. Qui, descriviamo un metodo per la produzione e la titolazione di rAAVs chimeriche contenenti le proteine ​​del capside di entrambi AAV1 e AAV2. L'utilizzo di questi vettori chimerici cosiddetti combina i vantaggi di entrambi i sierotipi dei genitori come l'alta scorte titoli (AAV1) e purificazioneda cromatografia di affinità (AAV2). Questi sierotipi di AAV sono i migliori studiato di tutti i sierotipi AAV, e singolarmente hanno un modello ampio infettività. I vettori chimerici qui descritto dovrebbe avere le proprietà infettive del AAV1 e AAV2 e può quindi aspettare che infettare una vasta gamma di tessuti, compresi i neuroni, muscoli scheletrici, pancreas, rene tra gli altri. Il metodo qui descritto usa purificazione eparina colonna, un metodo ritenuto di dare un titolo virale più alta e più pulito preparazione virale rispetto ai metodi di purificazione altre, come la centrifugazione da un gradiente di cloruro di cesio. Inoltre, si descrive come questi vettori possono essere rapidamente e facilmente titolati a dare lettura accurata del numero di particelle infettive prodotte.

Protocollo

Vedere la Figura 1 per un esempio che riassume il seguente protocollo.

Nota di sicurezza: Tutto il materiale che è stato in contatto con particelle virali assemblato deve essere disinfettata con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo.

1. La preparazione delle scorte DNA plasmidico (~ 2 giorni)

1. I plasmidi sono necessari i seguenti ^1:
   • pRV1 - contenenti la Rep AAV2 e sequenze Cap
   • PH21 - contenenti il ​​AAV1 Rep e le sequenze Cap
   • pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmide
   • Plasmide contenente la cassetta AAV ricombinante espressione affiancato da AAV2 segnali imballaggio (ripetizioni terminali invertite, ITRS)
2. Mentre pFdelta6 dovrebbero essere coltivate in Stbl2 cellule competenti per impedire la cancellazione parziale, pRV1 e PH21 può essere coltivata in cellule DH5alpha competenti. Plasmidi AAV può essere coltivata in cellule Stbl2 se delezioni parziali si verificano nelle cellule DH5alpha.
3. DNA plasmidico deve essere di alta qualità e privo di contaminanti RNA. Plasmidi possono essere sottoposti a screening per l'integrità utilizzando i seguenti riassunti:
   • pRV1 - digerire con XbaI per dare bande di 7,5 kb e 3,8 kb
   • PH21 - digestione con EcoRI per dare bande di 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb
   • pFdelta6 - digerire con HindIII per dare bande di 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb e 1,5 kb

2. Preparazione di cellule embrionali umane del rene 293 (HEK293) per trasfezione (2 - 3 giorni)

1. Piastra di due 80% confluenti 150 centimetri ^due fiaschi di cellule HEK293 15 centimetri in cinque piatti del tessuto diametro cultura Nunc. Le cellule devono essere 70 - 80% confluenti prima trasfezione (circa 48 ore dopo placcatura). Cellule in coltura standard di Dulbecco modificato (DMEM) con glucosio contenente il 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillina / 100 mg / ml di streptomicina.
2. 3 ore prima della trasfezione rimuovere e sostituire con DMEM Iscove'Medium s modificato Dulbecco (IMDM) contenente 5% di siero fetale bovino.

3. Trasfezione di plasmidi virali (~ 1 ora per la trasfezione, 3 giorni di incubazione)

1. Preparare la seguente per un singolo lotto (5 x 15 cm piastre di coltura dei tessuti) di virus:
   • 62,5 mcg plasmide AAV
   • 125 mcg pFdelta6
   • 31,25 mg pRV1
   • 31,25 mg PH21
   • 1650 microlitri 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. In un filtro 2 classe cappuccio coltura tissutale sterile la miscela di trasfezione in una provetta da 50 ml.
3. Vortex, mentre la soluzione, aggiungere rapidamente 13 ml di 2 HEPES x salina tamponata (pH 7,05). Sostituire il coperchio del tubo da 50 ml e continuare a vortex per 15 secondi. Lasciare riposare per 1 minuto 45 secondi, un precipitato fine e bianca dovrebbe formare.
4. Delicatamente aggiungere 5 ml di soluzione di trasfezione per ogni piatto 15 colture di tessuti cm. Piastre agitare e tornare alla incubatrice.
5. 16 ore dopo la trasfezione rimuovere media IMDM e sostituirlo con DMEM.

4. Lisi delle cellule e la raccolta di rAAVs (2 ore)

1. 72 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto da piastre di coltura cellulare e scartare. Tutti i rifiuti devono essere trattati con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo.
2. Lavare delicatamente le cellule in caldo 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7,4).
3. Aggiungere 25 ml di PBS caldo a ogni piatto e rimuovere delicatamente le cellule con un raschietto cellula. Raccogliere sospensione in provette da 50 ml.
4. Cellule pellet a 800 xg per 10 minuti.
5. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.0, utilizzare 10 ml per piastra di coltura tissutale. Diviso in due provette da 50 ml.
6. Preparare una soluzione fresca di deossicolato di sodio al 10% in DH ₂ O. Aggiungere 1,25 ml di questo per ogni provetta per una concentrazione finale di 0,5%. Aggiungi benzonasi nucleasi ad una concentrazione finale di 50 unità per ml. Mescolare accuratamente tubo.
7. Incubare a 37 ° C per 1 ora.
8. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3000 xg per 15 minuti. Trasferimento a fresco tubo da 50 ml, garantisce tutti i detriti delle cellule è stata rimossa per evitare il blocco delle colonne eparina (vedi punto 5). In questa fase, i campioni possono essere conservati a -20 ° C prima di continuare. Abbiamo conservato i campioni per diverse settimane a -20 ° C senza una riduzione della infettività.

5. Colonna di purificazione eparina rAAVs (2 - 3 ore)

1. Setup HITRAP colonne eparina utilizzando una pompa peristaltica in modo che le soluzioni di flusso attraverso la colonna a 1 ml per minuto per i passi 5,2-5,4. E 'importante garantire l'assenza di bolle d'aria sono introdotti nella colonna eparina.
2. Equilibrare la colonna con 10 ml di 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
3. Applicare 50 ml di soluzione di virus alla colonna e lasciar fluire.
4. Lavare la colonna con 20 ml di 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
5. Usando una siringa da 5 ml di continuare a lavare la colonna with 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, seguito da 1 ml 300 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gettare il flow-through.
6. Con 5 ml siringhe ed eluire una leggera pressione il virus dalla colonna mediante l'applicazione di:
   • 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • 3,0 ml 450 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0
   • Raccogliere questi in una provetta da centrifuga da 15 ml.

6. Concentrazione e filtrazione sterile di rAAVs (1 ora)

1. Concentrato vettoriale utilizzando Amicon unità centrifughe ultra-4 filtro con un cut-off 100.000 peso molecolare. Carico di 4 ml di eluato della colonna nel concentratore e centrifugare a 2000 xg per 2 minuti (a temperatura ambiente). Eliminare eluato e concentratore ricaricare con la soluzione antivirus rimanente e centrifugazione ripetere. Il volume concentrato dovrebbe essere di circa 250 microlitri. Se il volume è molto concentrato più di questo, scartare il flusso tttraverso e continuano a centrifuga a intervalli di un minuto fino a quando il volume è di circa 250 microlitri.
2. Aggiungere 250 microlitri di PBS al virus per un volume finale di 500 microlitri e togliere dal concentratore.
3. Vettore filtrare da 13 mm di diametro filtro da 0,2 micron siringa. Vettore deve essere aliquotati e conservati a -80 ° C fino al momento.

7. Titolazione degli stock virale (3 giorni)

Ciò richiede un promotore che è attiva in cellule HEK293 guida di un gene reporter o un prodotto del gene immunocytochemically rilevabile. Quando si produce un vettore che non è compatibile con cellule HEK293 altre linee cellulari o colture cellulari primarie possono essere utilizzati.

1. Preparare 18 poli-L-lisina coprioggetto vetro rivestito o 18 pozzi di diapositive camera Nunc da semina HEK293 cellule in modo che siano 40 - 50% confluenti. Per la titolazione di Cre-dipendente rAAVs uso HEK293 cellule che esprimono stabilmente Cre ricombinasi ^2.
2. Infettare ogni pozzetto con serie dilutions del vettore AAV (Fig. 2A). Utilizzare 3 pozzi per diluizione. Noi abitualmente aggiungere virus direttamente a ciascun pozzetto.
3. Dopo 72 ore riparare cellule HEK293 con l'aggiunta di un volume pari al 4% paraformaldeide (PFA) e medie (dando una concentrazione finale del 2% PFA) per dieci minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule per tre volte in PBS, sciacquare in dH ₂ O e coprioggetto.
5. Contare il numero di cellule trasdotte dai tre pozzi che hanno il più alto fattore di diluizione, ma contengono ancora cellule infettate, trovare la media di questi e moltiplicare per il fattore di diluizione per dare il numero di unità infettive per microlitro (Fig. 2B).

8. Risultati attesi

HEK293 cellule trasdotte con una codifica virus sono mostrati maggiore proteina verde fluorescente (eGFP) in Figura 2B. In genere ottenere titoli coerenti di circa 6 x 10 ⁶ particelle infettive per litro micro. Noi abitualmente utilizzano questi vettori per stereotassica injection nel cervello di roditori adulti. Questo fornisce una potente tecnica per la regione specifica espressione genica ^2. Per combinare questa specificità regione con cellule di tipo selettivo l'espressione genica abbiamo iniettare ricombinasi Cre-dipendente rAAVs nelle regioni obiettivo di Cre-topi transgenici ^2. Figura 2C-E mostra esempi di iniezioni stereotassico di Cre-dipendente rAAVs codifica eGFP in differenti regioni del cervello adulto di parvalbumina Cre-topi transgenici ^3.

Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo per la produzione di rAAV. . 1) HEK293 cellule sono placcati e cresciuto fino a 70-80% confluenza. 2.) AAV e plasmidi helper sono preparati e trasfettati in cellule HEK293. 3.) Media viene ripristinata DMEM 16 ore dopo la trasfezione e HEK293 le cellule sono coltivate per un altro 56 ore. 4.) HEK293 cellule vengono raccolte e lisate. rAAV vettori sono separati da detriti cellulari da centrifugation. 5.) Particelle virali sono purificati attraverso colonne di eparina prima la concentrazione e la sterilizzazione. 6.) HEK293 cellule sono coltivate su ben 24 tavole ed infettare con diluizioni seriali del vettore AAV per determinare il numero di unità infettive.

Figura 2. Titolazione e in applicazione in vivo di rAAV1 / 2. (A) installazione di cellule HEK293 per la misurazione titolo virale. HEK293 cellule vengono trasdotte con diluizioni seriali di rAAVs. C, il controllo non infettate, N, 1 ml di diluito magazzino virale. (B) HEK293 cellule infette con rAAVs esprimere eGFP. (CE) espressione eGFP virale è limitato a Cre-esprimere i neuroni in regioni diversi target di parvalbumina Cre-topi transgenici dopo l'iniezione stereotassica di Cre-attivi rAAVs. Immagini esempi mostrano immunoreattività GFP in (C) il pallido reticolare talamo e globus, (D) il giro dentato e (E) la regione CA1 dell'ippocampo. DG, dentate giro, RT, nucleo reticolare del talamo; GP, globo pallido. Bar Scala: B, 500 micron, C, 100 micron, D, 100 micron; E, 500 micron.

Discussione

vettori rAAV stanno diventando sempre più prezioso per studi in vivo su animali. Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice e poco costoso per produrre rAAVs, che possono agevolare l'applicazione diffusa di questo vettore utile evitando l'esternalizzazione dei costi di produzione del virus alle aziende. Il protocollo (sulla base di riferimento 1) descrive la produzione di chimerico rAAV1 / 2 vettori contenenti proteine ​​del capside da entrambi i sierotipi dei genitori con rapporti uguale a ^4. La purificazione dei vettori rAAV legandosi alle colonne eparina si affida l'espressione delle proteine ​​del capside AAV2, ma può essere combinato con altri sierotipi di AAV1 qui esposti. Inoltre, AAV6 è stato riportato che lega l'eparina, anche se con una ridotta affinità, e potrebbe potenzialmente essere purificato con colonne di eparina utilizzando questa procedura ^5,6. Va notato tuttavia, che altri sierotipi richiederà diverse concentrazioni di NaCl per l'eluizione colonna eparina ^5,7.

Packaging genomi rAAV ha dimostrato di essere ottimale tra 4,1 e 4,9 kb con una forte riduzione in termini di efficienza imballaggio fino a 5.2 kb ^8. Questo limite imballaggio può essere considerato il più grande svantaggio del sistema rAAV, dal momento che tipo specifico di cellule regolazione dell'espressione del transgene è di solito realizzato da cis grandi agendo elementi che non possono essere ospitati all'interno della AAV particelle di piccole dimensioni. Per superare i lotti basso titolo, come quelle derivanti dal tentativo di geni pacchetto che sono vicini al limite di imballaggio AAV stiamo combinando separati lotti virale concentrato di 250 microlitri in lotti da 500 microlitri, piuttosto che aggiungere PBS come descritto al punto 6.3. Affidabile di cellule di tipo specifico di trasduzione può essere ottenuto combinando Cre-driver topi e cassette rAAV condizionale (vedi sotto) per evitare che si estende il limite di confezionamento.

Da notare che mentre questo protocollo cerca di fornire facili da seguire le istruzioni sulla produzione di alta titer rAAV, richiede la presenza di frazioni AAV2 proteina del capside di purificazione da eparina cromatografia di affinità. Sierotipi diversi da quelli AAV2 deve essere purificato con procedure alternative ^9. Un vantaggio di purificazione colonna eparina è si ritiene di produrre vettori AAV che hanno tasso di infettività superiori a quelle prodotte mediante gradiente di cesio cloruro di ^10. Tuttavia, ci sono anche alcuni svantaggi di questo metodo. Per esempio, altre proteine ​​che legano l'eparina può essere presente anche il brodo purificato virale. Mentre il tropismo di eparina-purificata vettori possono essere influenzati dal titolo vettore ^10, il nostro approccio per indirizzare specificamente, sia eccitatorio ²⁰ o neuroni inibitori (Fig. 2) impiega Cre-indotto l'attivazione di AAV-mediata ed è espressione del transgene titolo indipendente. Un'alternativa alla purificazione colonna eparina è l'uso di un gradiente di densità Iodixanolo, che produce un più elevato titolo virale e la preparazione più pura l'uso diun gradiente di cloruro di cesio ^10. Questo metodo può anche essere combinato con la purificazione della colonna eparina per produrre un vettore che è superiore al 99% puro ^11. Pertanto, un'attenta valutazione deve essere presa dai singoli gruppi su quale metodo di purificazione virale è meglio per il loro particolare applicazione a valle.

Il problema più comune associato a questo protocollo è basso titolo virale. Nella nostra esperienza questa di solito può essere ricondotti a bassa efficienza di trasfezione, o l'eluizione del virus dalle colonne eparina. Tutti i materiali transfezione devono essere a temperatura ambiente prima di transfezione, e trasfezioni test deve essere eseguito per trovare le condizioni ottimali in ogni laboratorio. Altri metodi di trasfezione, come Lipofectamine, sono altamente efficienti, ma può essere proibitivo. Inoltre, la concentrazione e del pH delle soluzioni di eluizione colonna eparina è un fattore critico per l'eluizione completa dei virioni da eparina se nza preavviso colonneut danni. Un altro punto importante è che le cellule imballaggio deve aderire bene alla superficie dei piatti della cultura del tessuto. Se le cellule staccarsi a un certo punto durante la procedura si consiglia di interrompere l'esperimento e sbrinamento un nuovo flacone di cellule.

Spazio-temporale di controllo di espressione del transgene nei roditori è facilmente ottenibile con targeting anatomico preciso e lo stadio di sviluppo dell'animale. Efficiente AAV-mediato il trasferimento genico ha dimostrato in utero ^12,13. Nel cervello adulto, la zona infetta con particelle rAAV dopo l'iniezione stereotassica può essere regolata da regioni oggetto molto piccolo, ad aree molto più grandi, non solo dai cambiamenti titolo virale, ma anche modificando i parametri di iniezione. Questi includono il volume e la velocità delle iniezioni e l'inclusione del mannitolo poliolo con la sospensione di virus ^14. Mannitolo può essere utilizzato anche per migliorare l'infezione di una varietà di tessuti, dopo l'iniezione sistemica rAAV ^{15 <}/ Sup>.

La capacità di confezionamento di rAAV (circa 4,7 kb) è probabilmente il fattore più limitante in termini di geni che possono essere espressi da questi vettori virali. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che questo può essere in parte superati da geni suddivisione più grandi o più cassette di espressione in vettori separati rAAV e l'introduzione di una sequenza di bridging, di iniziare l'espressione genica quando virioni di infettare la stessa cellula ^16. Livelli di espressione di geni trasportati da vettori rAAV può essere notevolmente migliorata mediante auto-omaggio vettori rAAV ^17. Iniezione stereotassica di vettori rAAV fornisce un metodo rapido, poco costoso e potente per indurre l'espressione genica in una regione specifica maniera. In combinazione con 2 ^° generazione di strategie di RNA interference ¹⁸ rAAVs può essere utilizzato anche per la regione di specifici geni abbattere. rAAVs può essere combinato con Cre-topi transgenici o promotori specifici delle cellule di tipo a commutazione di circuito ea ottenere cellule di tipoSpecifici per l'espressione genica, permettendo manipolazioni genetiche ad alta risoluzione spaziale ^2,19-21, mentre rAAVs raccordo con ad esempio il sistema tet aggiunge il controllo temporale sulla virus-mediata espressione genica ^22,23. Questi esempi illustrano le enormi potenzialità combinatorie di questi vettori e prevedere un rapido aumento rAAV studi basati negli anni a venire.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amicon filtri Ultra centrifuga	Millipore	UFC810024	100.000 MWCO
Benzonasi nucleasi	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco ha modificato (DMEM)	Invitrogen	10567014	Supplemento con il 10% di FCS e 10 unità / ml penicillin/100 mcg / ml di streptomicina
Cellule HEK293	Americano tipo raccolta delle colture	CRL-1573	Uso al passaggio meno di 30
HEPES salina tamponata	Sigma-Aldrich	51558
HITRAP Eparina cartuccia	Sigma-Aldrich	54836
Medio Iscove ha modificato Dulbecco	Invitrogen	12440-053	Supplemento con il 5% FCS
Sodio desossicolato	Sigma-Aldrich	D5670	Fai la soluzione fresca per ogni lotto
15 centimetri di coltura tissutale piatti	Fisher Scientific	157150
Stbl2 cellule competenti	Invitrogen	10268-019
Virkon soluzione	Fisher Scientific	NC9821357	Lascia per disinfettare tutta la notte prima di scartare per drenare