Piccole e Wide Angle X-Ray Scattering Studi di macromolecole biologiche in soluzione

Riepilogo

La dimostrazione dell'angolo piccolo e grande X-ray scattering (SWAXS) procedura è diventato determinante per lo studio delle macromolecole biologiche. Attraverso l'uso della strumentazione e procedure di metodi angolari specifici e preparazione, i dati sperimentali dei SWAXS visualizza la caratterizzazione atomica e nano-scala di macromolecole.

Abstract

In questo lavoro, piccole e Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analisi delle macromolecole è dimostrata attraverso la sperimentazione. SWAXS è una tecnica in cui i raggi X sono elasticamente sparsi da un campione disomogeneo nel nm-gamma a piccoli angoli (tipicamente 0.1 - 5 °) e angoli di larghezza (in genere> 5 °). Questa tecnica fornisce informazioni circa la forma, le dimensioni e la distribuzione di macromolecole, distanze caratteristici di materiali parzialmente ordinati, dimensioni dei pori, e superficie-volume di rapporto. Piccolo angolo X-ray Scattering (SAXS) è in grado di fornire informazioni strutturali di macromolecole tra 1 e 200 nm, mentre Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) può risolvere ancora minore spaziatura Bragg di campioni tra 0,33 e 0,49 nm nm basata sulla configurazione del sistema specifico e rivelatore. La distanza è determinata dalla legge di Bragg e dipende dalla lunghezza d'onda e angolo incidente.

In un esperimento SWAXS, i materiali possono essere solidio liquido e può contenere solidi, liquidi o gassosi domini (cosiddette particelle) dello stesso materiale o di un altro in qualsiasi combinazione. Applicazioni SWAXS sono molto ampie e comprendono colloidi di tutti i tipi: metalli, materiali compositi, cemento, olio, polimeri, materie plastiche, proteine, alimenti e prodotti farmaceutici. Per campioni solidi, lo spessore è limitata a circa 5 mm.

L'utilizzo di un laboratorio strumento basato SWAXS è dettagliata in questo articolo. Con il software a disposizione (ad esempio, GNOM-ATSAS 2,3 pacchetto D. Svergun EMBL-Amburgo e software EasySWAXS) per il sistema SWAXS, un esperimento può essere condotto per determinare alcuni parametri di interesse per il campione dato. Un esempio di un esperimento macromolecola biologica è l'analisi del 2% in peso di lisozima in una base di acqua tampone acquoso che possono essere scelti e preparati con numerosi metodi. La preparazione del campione segue le istruzioni riportate nella sezione Preparazione dei campioni. Attraverso la sperimentazione SWAXS,importanti parametri strutturali di lisozima, ad esempio, il raggio di girazione, possono essere analizzati.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Utilizzare un ago per rimuovere una porzione del campione dal contenitore. *
2. Utilizzare l'ago per riempire il capillare (diametro massimo di 2,2 mm) con il campione. Il capillare deve essere riempito tra 2 e 3 cm dal fondo.
3. Chiudere il capillare di fusione della cera sulla punta.
4. Svitare il supporto del campione vuoto dal sistema.
5. Prendere la capillare entro la fine fuso (fine cera) e inserire il non-fuso estremità nel supporto del campione.
6. Posizionare il supporto nel sistema e avvitare.

* Campioni solidi (compresi campioni di polvere) può essere direttamente collocato nel supporto del campione (non necessario capillare), mentre campioni liquidi deve essere posto in un capillare.

Start-Up della Macchina SWAXS

2. Fonte procedura di avvio a freddo

1. Chiudere l'otturatore premendo il pulsante di scatto di sicurezza.
2. Spegnere l'interruttore principale"ON", premendo il tasto verde.
3. Verificare che il pulsante di emergenza "Shut-Off" è in posizione estesa.
4. Accendere l'alimentazione principale premendo il tasto verde.
5. Verificare che la spia di blocco LED è verde e indica tutti gli interblocchi sono ok.
6. Attendere che il touch screen da caricare. Una volta caricato, premere il tasto "R6" nel menu.
7. Ruotare il tasto Standby sulla posizione "ON".
8. Ruotare la radiografia chiave in posizione "ON". La radiografia luce rossa deve accendersi.
9. Attendere che il touch screen per leggere i livelli di standby (30 kV e 0,4 mA).
10. Girare la chiave di standby di sicurezza nella posizione "OFF". Premere il tasto "Cycle Start" pulsante nella parte inferiore del touch screen.
11. Attendere che il touch screen per leggere la potenza nominale (50 kV e 1 mA). Se un livello di potenza diversa si desidera, accedere alla schermata di configurazione premendo "R4" sul touch screen e inserendo le impostazioni desiderate.

3. Chiller Procedura

1. Ruotare la swi alimentazionetch in posizione "ON" sul pannello di controllo della temperatura. Una luce di controllo e il display della temperatura a LED si accende.
2. Portare l'interruttore di alimentazione in posizione "ON" sul refrigeratore.
3. Attendere fino a quando il display della temperatura indica "OFF". Questa è la modalità di standby.
4. Premere e tenere premuto il pulsante di invio (simbolo di ritorno) per circa 4 secondi o fino a quando il display della temperatura indica una temperatura effettiva.
5. Per modificare la temperatura, premere la freccia su o freccia giù. Il valore impostato viene visualizzato sul display della temperatura per circa 8 secondi prima che possa ritornare al valore effettivo.
6. Premere il tasto ENTER una volta il valore di riferimento desiderato. Questo salverà il valore.
7. Attendere fino a quando la temperatura effettiva raggiunge il valore impostato desiderato.

NOTA: Se in qualsiasi momento l'errore "E 01" compare sul display della temperatura, seguire le istruzioni refrigeratore arresto, l'unità di ricarica bagno versando acqua purificata nel fil serbatoiol, e quindi eseguire la procedura di avvio di nuovo refrigeratore.

4. Arresto di Chiller

1. Premere "enter" per circa 4 secondi.
2. Portare l'interruttore di alimentazione in posizione "OFF".

5. Accensione del vuoto

1. Assicurare la porta vuoto è fissato in posizione.
2. Girare il vuoto 1 e 2 manopole per i posizioni "ON".
3. Attendere che il VAP5 vacuometro legge un livello di vuoto inferiore a 1,5 mbar.

6. Rivelatore di impostazione del sistema

1. Per impostare la pressione del gas, verificare che il manometro principale della valvola di riduzione è di almeno 10 bar.
2. Aprire la valvola principale.
3. Aprire lentamente la valvola di pressione di esercizio fino a quando la pressione raggiunge 8 bar sul manometro di esercizio.
4. Aprire la seconda valvola principale
5. Per regolare la portata del gas, aprire la valvola principale della pressione ruotando la manopola in posizione verticale sul pannello di controllo del gas.
6. Regolare il flussotariffa con la valvola a spillo fino a quando l'indicatore di legge circa 8 bar.
7. Portare l'interruttore di alimentazione principale in posizione "ON". La luce LED si illumina.
8. Per regolare l'alta tensione, attivare l'alta tensione portando l'interruttore in posizione "ON". La luce LED si illumina.
9. Ruotare lentamente la manopola di tensione di controllo fino a circa 3.5kV viene raggiunto sul manometro. NON SUPERARE 4kV.

7. Taratura

1. Le fasi sperimentali sopra vengono eseguite con un campione di picchi noti.
2. ASA 3.3 è utilizzato per ottenere il grafico di intensità vs canale con 5 picchi.
3. Passare a Menu → Opzioni → Inserisci canali e intensità corrispondenti.
4. Vai a ASA3, scheda "TPF" prima.
5. Sostituire il filtro, in alto a sinistra 1 millimetro Nichel (fascio di filtro).
6. Imposta la posizione 32.000 (intervallo 28.000 a 32.000, regione critica circa 28.000) → vai a posizione, creare il vuoto che è inferiore a 5 mbar, assicurarsi che il rilevatore è ragioneding tra 1k-10K.
7. Eseguire per 10 secondi per circa 52 impulsi al secondo.
8. Cambiare le finestre di energia, (o misurare la finestra di energia con l'unico campione, non compreso il caso del filtro). Impostare la corsa finale per 10 sec.
9. Individuare la posizione del fascio primario (233 canale per esempio).
10. Per le altre piste, sostituzione del filtro di nuovo a 2 Tungsten mm (W, fascio tappo), a partire da 30.000.
11. Trovare la posizione di tutti gli altri picchi dei campioni.
12. Utilizzare ImageJ-macro software per calibrare SAXS - loro transizione da intensità vs canale di intensità vs q (o spaziatura d) (Figura 1).
13. Utilizzare ImageJ-macro software per calibrare WAXS - loro transizione da intensità vs canale di intensità vs q (o spaziatura d) (Figura 2).

8. Software Procedura

1. Utilizzare il software ASA 3.3, per la raccolta dei dati in tempo reale: dati in diretta → TPF scheda → Salva file.
2. Per EasySWAXS, fare clic sulla scheda Impostazioni periferica.
3. Immettere la "a", lambda, e valori d, così come il centro di gravità.
4. Selezionare Punto di collimazione.
5. Selezionare il tipo di particella globulare (a meno che non si tratta di un noto per essere una canna di appartamento a forma di particelle).
6. Fare clic sulla scheda Guinier-Plot. Un I vs q ² grafico verrà visualizzato.
7. Trascinare le linee verticali per circondare un tratto di pendenza pressoché lineare.
8. Nella parte inferiore della schermata, un valore di R viene visualizzato. Accanto a questo vi è un requisito di convalida.
9. Continuare a trascinare le linee verticali avvicinare finché il valore di convalida è tra 1 e 2. Questo è soggettiva. Il valore di R, o raggio della rotazione, che si ottiene è una stima.

9. Fonte Procedura di arresto

1. Verificare la sicurezza e persiane veloci sono chiuse.
2. Ruotare il tasto Standby sulla posizione "ON".
3. Attendere che il touchscreen per leggere i livelli di standby.
4. Premere R5 sulla touchscreen.
5. Ridurre la corrente a 0 A.
6. Ridurre la tensione a 0 A.
7. Ruotare la radiografia a chiave in posizione "OFF".
8. Spegnere l'alimentazione principale su "OFF" premendo il pulsante rosso spento.

Risultati

SAXS e WAXS complessivamente possono fornire informazioni strutturali del campione attraverso i seguenti parametri: il raggio di girazione, dimensione delle particelle e la forma, la struttura fattore soluzione, specifica superficie interna e la dimensione dei pori, tipo lattice e dimensione e densità elettronica ^1. SAXS e WAXS può essere applicato anche allo studio della dinamica delle proteine ^​​2.

L'informazione strutturale di esperimenti SWAXS viene ottenu...

Discussione

La procedura comparativa del sistema SWAXS consente numerose variabili che devono essere determinati da analisi sperimentale. I parametri che vengono raggiunti dalla analisi può essere utilizzato per scopi diversi a seconda del campione e la configurazione sperimentale. SAXS fornisce informazioni su scala nanometrica dimensioni e la forma dell'oggetto, mentre WAXS si concentra sulla struttura atomica e micro-scala (ad esempio reticolo molecolare, cellulare simmetria unità di misura). Più specificamente, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome dei prodotti	Azienda
Il System3 piccole e Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera	Hecus XRS e IBN, Graz, Austria
GNOM	ATSAS 2,3 pacchetto D. Svergun EMBL-Amburgo