Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Riepilogo

Abbiamo dimostrato come utilizzare la tecnica di alimentazione RNAi per abbattere i geni bersaglio e corpo fenotipo punteggio dimensione in C. elegans. Questo metodo può essere utilizzato per uno schermo grande scala per identificare potenziali componenti genetiche di interesse, come quelli coinvolti nella regolazione dimensioni del corpo tramite segnalazione DBL-1/TGF-β.

Abstract

Doppio filamento di RNA-mediata interferenza (RNAi) è una strategia efficace per abbattere l'espressione del gene bersaglio ^1-3. Esso è stato applicato a sistemi modello molti tra piante, invertebrati e vertebrati. Ci sono vari metodi per raggiungere RNAi in vivo ^4,5. Ad esempio, il gene bersaglio può essere trasformato in un vettore RNAi, e quindi permanentemente o transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per ottenere effetti atterramento gene; alternativamente sintetizzati oligonucleotidi a doppio filamento da geni specifici (oligo RNAi) può essere transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per mettere a tacere i geni bersaglio, o di sintesi del doppio filamento molecole di RNA possono essere microiniettato in un organismo. Poiché il nematode C. elegans utilizza batteri come fonte di cibo, nutrire gli animali con i batteri che esprime a doppio filamento di RNA contro geni bersaglio fornisce una strategia sostenibile ^6. Qui vi presentiamo una alimentazione RNAimetodo per segnare dimensioni fenotipo corpo. Taglia corpo in C. elegans è regolato principalmente dal TGF-β - come ligando DBL-1, quindi questo saggio è appropriato per l'identificazione dei componenti di segnalazione TGF-β ^7. Abbiamo usato diversi ceppi tra due ceppi ipersensibili RNAi per ripetere gli esperimenti di alimentazione RNAi. I nostri risultati hanno dimostrato che RRF-3 ceppo ci ha dato il miglior fenotipo atteso RNAi. Il metodo è di facile esecuzione, riproducibile e facilmente quantificato. Inoltre, il nostro protocollo minimizza l'uso di attrezzature specializzate, quindi è adatto per piccoli laboratori o quelli a istituzioni prevalentemente universitari.

Protocollo

1. Preparazione di piastre di alimentazione RNAi trasporto Gene sequenza bersaglio

1. Se si utilizzano le librerie disponibili in commercio (ad esempio da RNAi LifeSciences Fonte BioScience), passare al punto 1.4. In alternativa, clonare sequenze di geni bersaglio in vettoriale L4440, un worm comunemente usato RNAi plasmide ^8, dal protocollo standard di clonazione.
2. Trasformare il plasmide ricombinante in ceppo batterico HT115 (DE3), cultura loro su piastre di agar LB con 25 ug / ml carbenicillina e 12,5 ug / ml di tetraciclina, e scegliere un singolo clone per uso futuro.
3. Nel frattempo, trasformare la L4440 vettore vuoto nel ceppo batterico HT115 usare come controllo per gli esperimenti.
4. Cultura sia ricombinanti e vuoto L4440-trasportano batteri in 1 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina notte a 37 ° C. Tetraciclina non viene aggiunto a causa del fatto che essa diminuisce l'efficienza RNAi.
5. Aggiungere un altro 5 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina nella notte culre, incubare per un altro 4-6 ore a 37 ° C.
6. Seed 0,5 ml ricombinante o vuoto L4440 porta-coltura batterica su piastre a vite senza fine le RNAi. Etichettare tutti i piatti con il nome del clone.
7. Contrassegnare le piastre ed incubare una notte a 37 ° C per crescere prato batterica, queste sono le piastre RNAi con o senza sequenza target gene. Almeno 2 piastre devono essere preparati per ogni condizione.

2. Worms cultura sui piatti che alimentano il RNAi

1. Fiamma sterilizzare la punta di un pick verme filo di platino. Utilizzare il worm sceglie di prendere 6-10 quarto stadio larvale (L4) ermafrodite a ciascuna piastra micro-RNA che contiene o ricombinante o vuota L4440, gli animali si utilizzano i batteri come fonte di cibo.
2. Lasciate ermafroditi crescere a 20 ° C (condizione standard per la cultura C. elegans) durante la notte, diventeranno giovani adulti il giorno successivo.
3. Trasferimento 6-10 giovani adulti in una nuova piastra corrispondente etichettati e pronti RNAi.
4. Lasciate che iladulti depongono le uova per 4-6 ore, quindi rimuovere tutti gli adulti dalla piastra, questa fase è quello di sincronizzare la progenie. Una volta che le madri vengono rimossi, inizia il conteggio del tempo. Questo è il tempo zero.
5. Incubare le piastre a 20 ° C per far crescere gli animali a specifico stadio di sviluppo, in questo protocollo, abbiamo scelto i giovani adulti per l'analisi fenotipica. Per abbattimenti che si sviluppano ad un ritmo normale, 72 ore di incubazione è sufficiente per gli animali di diventare giovani adulti. Tuttavia, vari geni influenzano sviluppo animale diverso. Se RNAi induce gli animali a crescere ad un ritmo diverso, i giovani adulti possono essere identificati come quelli che ora più di 24 passato L4 con completato lo sviluppo vulvare e 2-6 embrioni in utero (se fertile). Per identificare gli altri stadi di sviluppo, lo sperimentatore deve usare lo sviluppo delle gonadi e vulvare come guida.

3. Risultato Fenotipi Corpo di ampiezza degli RNAi trattati Worms

1. Posizionare due strati di nastri etichette colorate su un vetrino. Rendono due deivetrini sé. Quindi, posizionare una nuova diapositiva di vetro tra le due slitte con nastro. Melt agarosio al 2% in acqua, applicare una goccia al centro del vetrino nuovo, premere la seconda slitta di vetro sopra per fare un sottile strato di agarosio al 2% come precedentemente descritto ^9.
2. Una volta agarosio è solidificato, rimuovere la slitta superiore in vetro, il vetrino con agarosio pad è pronto a caricare i vermi. Diapositiva Etichetta con nome clone.
3. Aggiungere 10 microlitri 25 mM NaN ₃ al pad agarosio; raccogliere animali 30-40 nella soluzione ₃ NaN fermarli, poi mettere coprioggetto sulla parte superiore, sia per la ripetizione ricombinante e vuoto L4440-contabile RNAi animali trattati.
4. Immagine i vermi sotto microscopio da dissezione con lente 2.5x obiettivo; qui usiamo Leica fotocamera digitale con supporto Qcapture software.
5. Per la calibrazione, prima di catturare l'immagine di un sovrano micrometro standard. Quindi aprire l'immagine in Image-Pro, cliccare su "misura" e scegliere "calibrazione" e poi scegliere"Wizard calibrazione spaziale". Con "calibrare l'immagine attiva" selezionato, fare clic su "Avanti". Immettere il nome per la calibrazione e garantire che le unità spaziali di riferimento sono impostate micrometro. Quindi, selezionare la casella "creare una calibrazione di riferimento" e fare clic su "Avanti". Clicca su "Linea di pareggio". Una barra di scala di riferimento verrà visualizzata. Riposizionare la barra di scala per unire le due estremità del micrometro, quindi indicare che il riferimento indica 1.000 unità. Fare clic su "OK", "Avanti" e "Fine".
6. Una volta che il software è stato calibrato, aprire un'immagine verme. Quindi, selezionare nel menu "misura", selezionare "Calibrazione" quindi cliccare su "select spaziale". Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione micrometro. Poi, sotto il menu "misura", selezionare "misure". Nella finestra che si apre, selezionare la free-disegnare strumento e tracciare una linea attraverso il centro del corpo animale dalla testa alla coda con il mouse del computer (Figura 1). La lunghezza sarà riportato nella finestra. Oraci sono due gruppi di dati: lunghezza corpo di animali trattati con gene target RNAi e animali di controllo trattati con vuoto L4440 vettore.
7. Esportare le misure di lunghezza di un file di Microsoft Excel o altri software statistico adeguato. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Quindi confrontare i campioni utilizzando Student t-test.

Risultati

Nella nostra ricerca, ci concentriamo sulla regolamentazione dimensioni del corpo attraverso la via DBL-1/TGF-β. La perdita di funzione delle DBL-1 risultati della via in dimensioni contenute, tra cui una lunghezza del corpo più breve rispetto a wild-type animali ^7,10,11. Così, protezioni per C. elegans mutanti dimensioni del corpo sono in grado di identificare TGF-β componenti di segnalazione e modificatori. DBL-1 segnalazione è mediata da una conservata TGF-β pathway di trasduzione del segnal...

Discussione

In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l'identificazione di mutanti difettosi delle dimensioni del corpo C. elegans di alimentazione RNAi. Questo metodo è applicabile alla identificazione di TGF-β componenti segnalazione. Dal momento che tali componenti sono altamente conservati nel corso dell'evoluzione ¹⁵ schermi che abbiano una connessione a chiarire i meccanismi molecolari di TGF-β segnalazione in tutti i metazoi. Una considerazione importante nel progettare tale scherm...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			RNAi vermi piatti 17,7 g Worm Mix Media 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Aggiungere 3 ml 1M IPTG (sterile) e 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (sterile), poi versare in piastre di Petri da 60 mm. Worm piastre 17,7 g Worm Mix Media 0,6 g streptomicina solfato 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Versare in piastre Petri da 60 mm. Worm Media Mix 55 g di Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto peptone 800 mg Colesterolo 200 g NaCl Agitare bene e essere sicuri di evitare blocchi, questa miscela in polvere può essere conservato per molti mesi prima dell'uso. 2% agarosio 0,5 g di agarosio Annunciod 25 ml dH 2 O. Il calore nel forno a microonde fino a completa dissoluzione. 1M isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) 2 g IPTG Sciogliere IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml Caenorhabditis elegans di Caenorhabditis Genetica Centro L4440 plasmide (porta ampicillina gene per la resistenza) Batteri ceppo HT115 (DE3) (contiene IPTG inducibile T7 polimerasi, carente per RNAsi III gene (a dsRNAse) che porta anche tetraciclina gene per la resistenza) 16 60 millimetri Petri piatti 100 millimetri Petri piatti 14 ml a fondo tondo Falcon cultura tubi diapositive di vetro vetro coprioggetti 1-20 microlitri pipetta 20-200 microlitri pipetta 200-1000 microlitripipetta 1-200 puntali ul 200-1000 puntali ul 1,5 ml provette Eppendorf filo di platino scelta vite senza fine