Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

Riepilogo

I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi

Abstract

Negli ultimi anni, l'analisi rapida di singole cellule è comunemente eseguita utilizzando citometria di flusso e anticorpi marcati in fluorescenza. Tuttavia, la questione della sovrapposizione spettrale delle emissioni di fluorofori ha limitato il numero di sonde simultanee. In contrasto, la nuova massa citometro CyTOF da DVS coppie Scienze un liquido a cella singola introduzione di un sistema ICP-MS. ¹ Invece di fluorofori, polimeri chelanti contenenti isotopi metallici altamente arricchito sono accoppiati ad anticorpi o altre sonde specifiche. ^2-5 A causa della purezza del metallo e la risoluzione di massa del citometro massa, non vi è alcuna "sovrapposizione spettrale" di isotopi vicini, e quindi senza necessità di matrici di compensazione. Inoltre, grazie all'utilizzo di metalli lantanidi, non c'è sfondo biologico e quindi non equivalente di autofluorescenza. Con una finestra massa estende massa atomica 103-203, teoricamente fino a 100 etichette possono essere distinti contemporaneamente. Attualmente, Più di 35 canali sono disponibili utilizzando i reagenti chelante disponibile da DVS Sciences, che consente la dissezione senza precedenti del profilo immunologico dei campioni. ^6-7

Svantaggi citometria massa includono il requisito rigido per un isotopo metallico separato per sonda (non equivalente di dispersione in avanti o laterale), e il fatto che si tratta di una tecnica distruttiva (senza possibilità di recupero cernita). L'attuale configurazione del citometro massa ha anche una velocità di trasmissione di cella solo ~ 25%, richiedendo così un numero di ingresso maggiore di cellule.

Ottima performance giornaliera del citometro massa richiede diversi passaggi. L'obiettivo fondamentale della ottimizzazione è quello di massimizzare l'intensità di segnale misurata degli isotopi metallici desiderati (M), riducendo al minimo la formazione di ossidi (M 16) che diminuisce l'intensità del segnale e M interferire con qualsiasi segnale desiderato a M 16. Il primo passo è di riscaldare la macchina in un caldo, stabile ICP plasma è stato stabilito. In secondo luogo, le impostazioni per la frequenza del gas corrente e il make-up di flusso deve essere ottimizzata su base giornaliera. Durante il prelievo, il massimo tasso di eventi cella è limitato dal rilevatore efficienza e velocità di elaborazione a 1000 cellule / secondo. Tuttavia, a seconda della qualità di esempio, un più lento tasso di eventi cella (300-500 cellule / secondo) è generalmente auspicabile consentire una migliore risoluzione tra eventi cellule e quindi massimizzare singlets intatte nel doppietti e detriti. Infine, adeguata pulizia della macchina alla fine della giornata aiuta a minimizzare il segnale di fondo per metallo libero.

Protocollo

Tutti i campioni di cellule per la CyTOF devono essere fissate e permeabilizzate. Questo consente una maggiore entrata del iridio contenente DNA intercalante, e impedisce anche lisi cellulare durante il lavaggio con acqua MilliQ e gradini risospensione immediatamente prima di iniettare nel citometro massa.

1. Start-up del citometro Messa

1. Aprire il programma CyTOF software. Selezionare Impostazione dello strumento. Nella scheda Cage Card, andate nell'angolo in basso a destra e fare clic su Riscaldatore "ON". Accendere il riscaldatore almeno 15 minuti prima del tempo desiderato per dare il tempo sufficiente per il mantello della camera spray per raggiungere i 200 ° C.
2. Sostituire il bianco Norm-Ject siringa da 3 ml nella pompa siringa con una siringa piena d'acqua fresca MilliQ.
3. Pulizia nebulizzatore. Backflush il nebulizzatore, utilizzando la siringa e il tubo per tirare 5% citranox 2-3 volte sia attraverso la porta più piccola introduzione liquido e più grande è la porta di introduzione di gas. Ripetere il risciacquo con acqua MilliQ to rimuovere citranox residuo.
4. Controllo per confermare che le luci sul pannello frontale del CyTOF sono accesi come in figura 1.

Figura 1. Spie del pannello CyTOF prima della messa in servizio.

5. Aprire la valvola del serbatoio di gas argon. Questo dovrebbe causare la luce "ARGON" sulla parte anteriore per accendere.
6. Collegare il nebulizzatore per il make-up di ingresso del gas. Svitare il make-up tubo connettore del gas e togliere la gomma nera o-ring e il bianco pezzo conico di plastica. Nota ampio "nocche" sul gambo porta di introduzione di gas del nebulizzatore. Posizionare il connettore sulla porta di introduzione di gas. Posizionare il nero o-ring sull'estremità del porto gas e forzare l'o-ring oltre la parte più larga dello stelo porta. Posizionare il pezzo bianco conico in plastica sulla parte superiore con l'estremità più stretta ha sottolineato, e avvitarla al make-up tubo del gas.
7. Collegare il nebulizzatore al tubo introduzione liquido. Inserire con cautela la tubazione piccola nell'apertura all'estremità del nebulizzatore. Ci saranno due fermate, simili nel sentire alle fermate su una micropipetta. Prima premere fino ad incontrare resistenza luce, la fine del tubo piccolo dovrebbe essere alla fine del tratto rettilineo del vetro. Secondo, premere di più per forzare la fine del tratto rettilineo del vetro ulteriormente nel raccordo e serrare la vite di fissaggio per sigillare. Inserire l'estremità del nebulizzatore nell'apertura bianco nel mantello riscaldante.
8. Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, premere il tasto "Avvio Plasma". Dal momento che il nebulizzatore è già inserito, premere il tasto "OK". Il software si accende il refrigeratore, avviare il flusso di gas, e accendere un plasma. Il rilevatore di tensione salirà. Ci sarà una finestra pop-up che dice "plasma sequenza di avvio è stato completato correttamente" quando hai finito, premere il tasto "OK". Nuove luci dovrebbe essere nel pannello frontale (figura 2 >).

Figura 2. Spie del pannello CyTOF dopo plasma acceso e start-up completato con successo.

9. Accensione pompa a siringa. Nell'angolo in alto a destra, premere il pulsante verde "play" per avviare la pompa a siringa e iniziare a liquido che scorre attraverso il tubo e schizzi fuori del nebulizzatore. Le impostazioni di default per siringhe sono 3 ml di acqua. Affinché campione da fluisce attraverso il loop del campione, la pompa a siringa deve essere periodicamente cambiato quando si esaurisce di acqua. Nella parte superiore dello schermo, vi è un contatore che indica quanto liquido è fluito dalla pompa a siringa. La pompa a siringa si arresta quando il contatore raggiunge "3,000" o lo stantuffo raggiunge la fine della siringa. Quando si riempie la siringa, è necessario premere "stop", piuttosto che il pulsante blu "pausa" per azzerare il contatore.

e "> 2. Taratura giornaliera della Messa citometro

1. Il citometro massa avrà bisogno di circa 20 minuti per ottenere un caldo, plasma stabile prima della calibrazione. Lo scopo dei passi di sintonia è quello di massimizzare il segnale desiderato di Tm169 o Tb159 mantenendo "Gd155" (ossido; La139 + O16) segnale sotto il 3% del valore più elevato. Fare clic sul pulsante di acquisizione Impostazioni per aprire la finestra Impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti, fare clic sulla tabella periodica per aprire il pannello di selezione isotopo. Selezionare gli isotopi in sintonia soluzione DVS Sciences indicato nel manuale, quindi fare clic su "salva".
2. Fare clic sul Isotopi Per Lettura pulsante per aprire la Massa () Per la finestra di lettura. Selezionare "Impulsi Conte", e ridimensionare l'asse y inserendo un nuovo numero e premendo il tasto "enter".
3. Riempire una verde 1 ml Norm-Ject siringa con la soluzione messa a punto. Ruotare il selettore di porta di campionamento per "caricare", iniettare 450 ml di soluzione messa a punto, quindi ruotare il selettore su "iniettare". Nella scheda massa di calibrazione del Acquisit dati ione finestra delle impostazioni, premere il tasto "Esegui" per monitorare quali sono le masse che scorre. Il lato sinistro della finestra è minore massa, mentre il lato destro è maggiore massa. Nota: ci sarà già segnali nella regione 9400-9800 TOF, a causa di isotopi xenon nel gas argon (Figura 3). Attendere fino a quando la soluzione messa a punto isotopi iniziano ad apparire come strisce in questa schermata (Figura 4).

Figura 3. Messa scheda della finestra di calibrazione, mostrando livelli di fondo per vari isotopi dopo la soluzione di lavaggio e risciacquo con acqua. La regione intorno a TOF 9400-9800 corrisponde allo xeno isotopi del gas argon, e deve essere sempre presente. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. Calibrazione finestra scheda di massa, mostrando strisce verticali per i vari isotopi in soluzione messa a punto DVS. Clicca qui per ingrandire la figura .

4. Torna alle Massa () Per la lettura finestra e premere il tasto verde "Play" in alto a sinistra. Ogni isotopo selezionata al passo 2.1 è rappresentata da una linea di colore diverso. Il valore predefinito asse X è "Time", in sec. Monitorare i livelli dei diversi isotopi fino a quando non sono stabili.
5. Regolazione della corrente. Nella scheda Parametri della Acquisizione Dati finestra Impostazioni, selezionare "Current" dal menu a discesa. Sia start = 0, finitura = 10, valore step = 0.5, tempo di assestamento = 200, e premere il tasto "Salva". Fare clic su Indietro Messa (i) Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L'asse x è ora "corrente". Nota in cui i segnali del picco isotopi (Figura 5), e r ecord. Nella scheda DAC Setup Canali della finestra di configurazione dello strumento, scorrere verso il basso su "Current" e digitare il nuovo valore. Premere il tasto "Imposta valore reale attuale", poi "salva".

Figura 5. Profilo di sintonizzazione corrente.

6. Regolazione del gas di reintegro. Cambia menu a discesa di "Make-up di gas." Sia start = 0.55, fine = 0,95, valore step = 0.05, tempo di assestamento = 200. Premere salvare. Tornare alla Massa () Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L'asse x è ora "Make-up gas" portata. Registrare in cui i segnali del picco isotopi. Osservare il rapido aumento del segnale "Gd155" verso la fine (Figura 6). Tornare alla configurazione DAC Canali scheda, scorrere fino a "Make-up gas", e immettere il nuovo valore. Premere il tasto "Imposta valore reale attuale", poi "salva".

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Figura 6. Make-up profilo regolazione gas.

7. Registrazione del rapporto desiderato isotopo ossido vs. Fare una seconda iniezione di 450 ml di soluzione di messa a punto. Nella scheda Parametri, selezionare "Time" dal menu a discesa, per non start = 0, end = 10, valore step = 1, tempo di assestamento = 200. Premere il tasto "salva". Clicca su "play" a Massa () Per la lettura finestra. Dopo le linee di stabilizzazione (figura 7), usare il cursore per leggere il valore nelle caselle in alto a sinistra per Tm169 o Tb159 (valore maggiore) e anche il valore "Gd155" (<3% del valore più elevato). Questi valori possono anche essere salvati in un file di messa a punto per riferimento futuro.

Figura 7. Misura di intensità di soluzione di ottimizzazione del segnale dopo l'ottimizzazione del gas corrente e Make-up.

8. Pulizia di samloop di PLE. Iniettare 3 ml di acqua MilliQ attraverso il loop del campione, seguita da 500 microlitri di soluzione di lavaggio DVS. Monitorare lo stato di avanzamento della pulizia premendo il tasto "run" nella scheda Calibrazione Messa. Lavare fino l'intensità delle striature (Figura 4) inizia a diminuire, quindi seguire da 3 ml di acqua MilliQ e monitor fino a livelli di sfondo (Figura 3).

3. Esempi di lavoro

1. Aprire la finestra di acquisizione. Impostazioni predefinite: fare analisi = On-The-Fly, segnale per l'analisi = Doppio, calibrazione del doppio conteggio dei dati =. Riduzione del rumore è stato selezionato. Qualsiasi di questi può essere cambiato se desiderato. Immettere il nome del file. Tutti i file devono essere salvati nella :/ E / unità.
2. Impostazione dei ritardi di acquisizione. Ci sarà un leggero ritardo nella registrazione eventi cellulari di circa 30 secondi a causa della lunghezza del tubo tra il loop campione e il nebulizzatore. Pertanto, la somma totale di "ritardo Acquisition" e "Detector stritardo capacità "deve essere di almeno 30 secondi. stabilità ritardo rilevatore deve essere di almeno 20 secondi.
3. Impostazione tempo di raccolta dei dati. "Il tempo di acquisizione" è il numero di secondi che si desidera eseguire il vostro campione. Riempire l'intero ciclo di 450 microlitri del campione richiede 600 secondi per il completamento. Si suggerisce che 50-100 sec essere aggiunto alla fine del tempo di funzionamento per minimizzare campione riporto.
4. Risospensione del campione. Per ridurre al minimo l'accumulo di sali in macchina, si suggerisce che almeno due lavaggi in acqua MilliQ essere fatto al termine della colorazione cellulare, seguita da una risospensione finale in acqua MilliQ. Il volume di acqua MilliQ usato per risospendere il pellet cellulare varia a seconda del numero di celle e iniziato con il recupero delle cellule dopo la procedura di colorazione intera. Un buon punto di partenza è 10 ⁶ (partenza) cellule / ml. Dopo la risospensione, filtrare attraverso un colino per eliminare cella aggregati.
5. Campione di partenza correre. Immettere un nuovo nome di file per il campione corrente. Spegnere la valvola loop del campione per "caricare", iniettare il campione, tornare a "iniettare", poi clicca su "Esegui" nella finestra di acquisizione.
6. Registrazione di eventi cellulari. Le cellule saranno rappresentati nella finestra istantanea come le collezioni di marchi orizzontali in ogni verticale isotopo / marcatore canale (Figura 8). Mentre il citometro massa può registrare 1000 cellule / sec, una migliore risoluzione tra gli eventi cellulari di solito si ottiene a 300-500 cellule / sec. Ciò corrisponde ad una media di ~ 1 cellula / aggiornamento dello schermo. Si può richiedere fino a 30 secondi prima che il contatore di eventi cellula inizia a salire. Ciò è dovuto al "On-the-fly" trattamento dei dati, senza le informazioni sugli eventi della cella viene persa.

Figura 8. Finestra Acquisizione durante esempio eseguibile, mostrando righe orizzontali di punti corrispondenti agli elementi associati tre eventi cellulari distinti.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

7. Qualità degli eventi cellulari. Nota uno sfondo striature in ciascun canale isotopo, così come il tasso di eventi cella. Il citometro massa riconosce un "evento cella" come un certo aumento del segnale di sopra del fondo, così il segnale di fondo in metallo libera o non legata anticorpi possono alterare l '"evento cella" count. Inoltre, l'esecuzione cellule ad una concentrazione troppo elevata può causare un aumento del numero di eventi doppietto. Sfondo può essere diminuito da lavaggi supplementari o diluizione della cella. Doppietti può essere minimizzata diluizione cellulare maggiore, a costo di tempo di esecuzione maggiore.
8. Finitura di acquisizione dati. Quando il tempo di acquisizione è stato raggiunto, la raccolta dei dati finirà. Ci sarà un po 'di ritardo prima di una finestra pop-up con un "OK" appare, ancora una volta, ciò è dovuto a "On-the-Fly", l'elaborazione dei dati. Acquisizione del campione può anche essere fermato Prematurely premendo il pulsante "Stop". In questo caso, tutti gli eventi cellulari già registrati saranno contati e trasformati in file di output.
9. Iniezione di almeno 500 ml di acqua MilliQ tra ciascun campione minimizza il carryover campione.

4. Pulizia della macchina dopo l'uso

1. Soluzione di lavaggio. Dopo che il campione finale è gestito e il loop del campione lavato con acqua, iniettare 450 ml di soluzione di lavaggio nel loop del campione. Monitorare il rilascio di metallo libero nella scheda massa di calibrazione della finestra di acquisizione dei dati delle impostazioni come indicato al punto 2.8 (Figura 9). Quando il segnale di metallo libero comincia a diminuire, lavare con 3 ml di acqua MilliQ e monitorare fino livelli di fondo sono raggiunti.

Figura 9. Messa scheda della finestra di calibrazione, durante la post-ciclo di pulizia con la soluzione di lavaggio DVS. Le strisce verticali in regione TOF 9800-11000 sono anticorpi del marchio di isotopi viene rimossa dalla macchina. Le strisce verticali intorno TOF 11500 corrispondono ai due isotopi intercalatore Ir. Clicca qui per ingrandire la figura .

5. Spegnimento della macchina

1. Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, selezionare "Stop Plasma". Quando la procedura è completa, ci sarà una finestra pop-up che chiede di rimuovere il nebulizzatore. Premere il tasto "OK". Nella scheda Cage Card, spegnere il riscaldatore. Chiudere la valvola sulla fornitura di argon.
2. Rimozione del nebulizzatore. Rimuovere il nebulizzatore dalla camera di spruzzo con attenzione tirando indietro. Svitare il tubo di introduzione del campione da 1,6 Step e mettere da parte. Svitare il make-up di introduzione di gas per allentare un po ', quindi tirare fuori il nebulizzatore. Lasciando il raccordo avvitato insieme ridurrà le possibilità di losing il nero in gomma o-ring e nero pezzo conico di plastica.
3. Pulizia nebulizzatore. Backflush entrambe le porte del nebulizzatore con il 5% citranox utilizzando la siringa e il tubo come indicato al punto 1.3. Store, coperto, nel 5% citranox fino all'utilizzo successivo.

Risultati

Dopo il protocollo di cui sopra dovrebbe realizzare quattro cose. In primo luogo, consentendo un adeguato tempo di riscaldamento per il citometro massa produrrà un caldo, plasma stabile necessario per il segnale ottimale e minima formazione di ossido. Secondo, lavaggio adeguato del citometro massa con acqua e soluzione di lavaggio MilliQ DVS (Figura 9) contribuirà a ridurre i livelli di metallo assorbimento nella tubazione e altre parti della macchina, contribuendo a ridurre fondo durante l'acquis...

Discussione

Per questi ultimi decenni, la citometria a flusso di fluorescenza è stato un metodo cavallo di lavoro per analizzare cellule singole, sia in termini di espressione di superficie e in saggi funzionali. Tuttavia, i problemi di sovrapposizione spettrale dei coloranti fluorescenti ha limitato il numero di marcatori simultanei. Mentre gli esperimenti che utilizzano più di 12 marcatori simultanei sono stati riportati, l'importo della compensazione necessaria rende tecnicamente difficile.

Inv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CyTOF TM massa citometro	DVS Sciences
Soluzione di lavaggio	DVS Sciences	201071	0,05% di acido fluoridrico in acqua
Sintonizzazione soluzione	DVS Sciences	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, acido nitrico traccia
Eu contenenti perline di polistirene	DVS Sciences	201073	Contiene naturale abbondanza isotopi Eu; perline in dotazione a circa 1 milioni / mL
Multi-contenenti lantanidi (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistirolo perle	DVS Sciences	Non ancora disponibile in commercio	Contiene naturale abbondanza isotopi di lantanidi quotate
Acido nitrico (concentrato)	Fisher Scientific	A467-500	Optima traccia-metallo puro ICP-MS di qualità
Polistirene fondo rotondo tubo con cellule-filtro cap-5 ml	BD	352235	utilizzato per filtrare campioni di cellule prima dell'iniezione
Norm-Ject tuberkulin siringa 1 ml	Henke Sass Lupo	4010-200V0	senza silicone, latex-free
Norm-Ject siringa 3 ml	Henke Sass Lupo	4010.000V0	senza silicone, latex-free
MilliQ acqua			18 MW di acqua pura, non deve essere conservato in bottiglie di vetro o di plastica che sono stati lavati con detersivo commerciale (a causa della loro elevati livelli di bario presenti).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	detergente acido
Gas argon	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% Ultra-alta purezza