Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Riepilogo

Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.

Abstract

Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine ​​fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter ^1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti ^8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l'utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l'integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell'utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine ​​con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine ​​di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l'uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine ​​nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine ​​che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.

Introduzione

Mutagenesi inserzionale ha dimostrato di essere un approccio efficace per dissezione funzione genica in diversi sistemi modello da organismi unicellulari come batteri e lieviti per gli organismi multicellulari come topi e piante. Qualsiasi DNA esogeno (virus, trasposone o plasmide) può servire come mutageno interrompendo elementi essenziali di geni come esoni o promotori. L'obiettivo efficace di tali approcci semplici è estremamente piccolo in grandi genomi complessi, poiché esoni comprendono solo 1-3% di un tipico genoma vertebrato. Piccole efficace dimensione di destinazione può essere superato da tassi di integrazione molto elevato vettoriali, come esemplificato dal grande successo di retrovirale mutagenesi inserzionale in zebrafish ^11,12. Al contrario, introni costituiscono circa il 20-30% dei genomi di vertebrati. In zebrafish, a base di trasposoni, vettori di mutagenesi inserzionale che introducono efficacemente gravi mutazioni hypomorphic su integrazione-null o in introni sono stati chiamati "transposo gene di rotturans "(GBTS) ^8-10. Per un'efficace integrazione trappola gene, usano un minimo Tol2 trasposone ^13,14. Mutagenicità delle GBTS si basa su pesce di derivazione splice accettore e trascrizionali sequenze di terminazione / poliadenilazione. Gli elementi responsabili GBT mutagenicità si affiancano da siti loxP diretti di escissione da Cre ricombinasi. Così, l'iniezione di mRNA Cre porta alla reversione efficiente delle mutazioni GBT-indotte, anche se alcune sequenze trasposoni rimangono al locus integrazione ^9,10.

I vettori GBT pubblicati recentemente usano MRFP come la trappola gene reporter ^9,10, portando a due potenziali carenze. In primo luogo, non si sa quale frazione di geni di zebrafish sono espressi ad un livello abbastanza alto da essere rilevato da proteine ​​giornalista di fusione fluorescenti diretti. In secondo luogo, solo un piccolo sottoinsieme di geni, dovrebbe avere funzioni essenziali. E 'stato stimato che ci sono solo 1,400-2,400 geni necessari per svilupp zebrafishnt ^15,16. La maggior parte dei mutanti trappola gene non sono tenuti a visualizzare fenotipi evidenti e quindi avrà un'utilità limitata. Per superare queste due limitazioni, abbiamo modificato GBT-R15 ^9,10 da utilizzare con Gal4-VP16 come giornalista trappola gene primario (Balciuniene et al. In preparazione). Come con AUG-meno MRFP in GBT-R15, il sito di inizio della traduzione è stato rimosso dalla Gal4-VP16. Per il rilevamento diretto di eventi trappola gene, i nostri vettori contengono un reporter eGFP sotto il controllo di 14x Gal4 UAS ^17,18.

Diverse caratteristiche aggiuntive sono state progettate nel nostro bipartito trappola gene vettore. Le scuole universitarie professionali: cassette eGFP è affiancato da un sito scalo FRT (chevrons grigio nella Figura 1). Iniezione di Flp ricombinasi mRNA porta ad escissione delle UAS: cassette eGFP, lasciando la mutazione del gene trappola smarcato da eGFP fluorescenza. Può quindi essere utilizzato in linee transgeniche che segnano specifici tessuti o eventi sviluppo di fluorescenza GFP. Come in altreGBTS, l'intera cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti loxP scalo (pentagoni aperti in Figura 1). Questo rende intercettare eventi gene reversibile mediante espressione di Cre ricombinasi, prontamente accertamento della prova di rapporto di causalità tra una determinata integrazione trappola gene e fenotipo osservato (Figura 2). Infine, la cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti invertiti meganuclease I-SCEI (triangoli neri in Figura 1). In Drosophila, integrazioni trasposoni sono spesso convertiti in delezioni (carenze) per escissione impreciso dell'elemento P. Non ci sono prove che l'escissione del trasposone Tol2 (o qualsiasi altro trasposone attivo nei vertebrati come la Bella Addormentata, PiggyBac o Ac / Ds) può portare ad eliminazioni. Abbiamo quindi incluso siti I-SCEI come un potenziale metodo surrogato per l'induzione di delezioni, anche se non vi è alcuna prova che I-SCEI può indurre delezioni in zebrafish. Va notato che, mentre I-SCEI meganucleasi può essere utilizzato per facilitare transgenesi in zebrafish, taglio del DNA da I-SCEI meganuclease è utilizzata per studiare i meccanismi di riparazione del DNA, tra cui soggetto a errori non omologhe fine giunzione, nel lievito e cellule di mammifero ^19-22.

Integrazione della nostra trappola gene vettore può portare ad espressione eGFP da due meccanismi differenti. Il primo è un vero e proprio evento trap gene (Figura 1C): il vettore integra in un gene (IMG per Insertionally gene mutato), una trascrizione fusione tra il 5 'del trascritto IMG endogeno e la Gal4-VP16 è realizzato e tradotto in un proteina di fusione contenente l'N-terminale della proteina codificata da IMG e GAL4-VP16. Questa proteina di fusione lega ai 14x UAS e attiva la trascrizione di eGFP. Il secondo evento, meno desiderabile è una trappola enhancer (Figura 1D): il promotore minimo davanti eGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, che porta alla produzione di eGFP in abindicationi della produzione Gal4-VP16. Nella nostra stima, il 30-50% degli eventi di espressione eGFP sono dovuti ad una trappola enhancer e il 50-70% sono dovuti a una trappola gene ²³ (Balciuniene et al. In preparazione). Per distinguere tra queste due classi di eventi, abbiamo fatto un 14xUAS: MRFP linea transgenica (Figura 1B), per comodità segnata da specifici lente γCry: (. Balciuniene et al, in preparazione) GFP. Intercettare eventi Gene vengono verificati da co-espressione di GFP e RFP (confrontare C e D in figura 2).

Nel nostro schermo pilota, abbiamo recuperato più di 40 eventi intercettare gene dopo lo screening di 270 F0 pesce iniettato con una miscela di DNA trasposone e transposase mRNA. Due dei nostri integrazioni trappola gene si sono verificati nei geni precedentemente pubblicati con mutanti indotti chimicamente: NSF e FLR. I fenotipi della nostra mutanti inserzionali ^tpl6 NSF e flr ^tpl24 sono superficialmente indistinguibili dal fenotipos dei corrispondenti mutanti indotti chimicamente. Abbiamo anche notato che gli eventi trap gene appaiono polarizzate verso gli introni vicino all'estremità 5 'dei geni, aumentando così la probabilità di alleli nulli. Facciamo osservare un certo grado di UAS silenziamento (variegatura) in tutte le nostre linee di trappola genica, e alcuni loci sono nettamente più sensibili alla variegatura di altri. Noi non crediamo che UAS silenziamento è un problema significativo per la propagazione delle linee trappola gene, come siamo stati in grado di propagare con facilità tutte le nostre linee di trappola genica attraverso almeno cinque generazioni selezionando per l'espressione GFP da sola.

Protocollo

1. La produzione del F0 Generation di microiniezione della Trappola Gene.

Abbiamo scoperto che gli embrioni di diverse origini genetiche mostrano diverse tolleranze di questa procedura, con il tipo selvatico pet-store-based e Tuebingen - Long Fin (TLF) è la più tollerante mentre i ceppi AB e Tuebingen hanno più poveri la sopravvivenza.

1. Preparazione del trasposone DNA. Preparare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. In preparazione) DNA plasmidico utilizzando il kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). È essenziale includere la fase di lavaggio PB (che è opzionale in procedura QIAprep), altrimenti il DNA miniprep sarà contaminato da RNasi A, che porta alla degradazione dell'mRNA transposase. Prima dell'iniezione, diluire il DNA in acqua RNase-free (Ambion AM9937) a 10 ng / ml.
2. Preparazione di transposase mRNA. Linearizzare pT3TS/Tol2 (pDB600) ¹³ utilizzando XbaI e trascrivere il DNA linearizzato utilizzando una macchina T3 mMessage(Ambion AM1348) nel kit di trascrizione in vitro. Abbiamo modificato la reazione di trascrizione in vitro con l'aggiunta di 0,5 ml di inibitore RiboLock RNasi (ThermoFisher Fermentas EO0381). Dopo la fase di trattamento DNasi, purificare mRNA utilizzando un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74.204). Valutare la qualità del mRNA in vitro trascritto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Diluire il mRNA in acqua RNase-free a 40 ng / ml, e negozio come due aliquote microlitri a -80 ° C.
3. Preparazione della miscela microiniezione. Prima dell'iniezione, aggiungere 8 ml di diluito DNA trasposone ad una aliquota 2 microlitri di transposase mRNA.
4. Microiniezione. Iniettare 3 nl di miscela di DNA / RNA nel tuorlo di 1 embrioni di zebrafish cella utilizzando tecniche standard di microiniezione, puntando per l'interfaccia tuorlo / blastomeri. Raccogliere gli embrioni ogni 20 min per assicurare l'iniezione in 1 fase delle cellule. Nella nostra esperienza, una persona abile può facilmente iniettare 1.000 embrioni in 1-1.5 ore.
5. Dopo l'iniezione, eseguire 5 ml di sinistraoltre soluzione iniettabile su un gel di agarosio 1% per il controllo di qualità, per garantire che l'mRNA transposase non è degradata.
6. Cura embrione iniettato. Nel tardo pomeriggio, rimuovere gli embrioni non fecondate e anormali e distribuire gli embrioni di 60-80 per 100 millimetri piatto di Petri. Embrioni anormali e morte vengono rimosse al 1 ° giorno dopo la fecondazione (dpf), 2 dpf e 3 dpf.
7. Screening per l'espressione GFP. Embrioni schermo senza difetti evidenti per GFP fluorescenza a 3 dpf (Figura 3). Lo screening può essere effettuato sia in uno stereomicroscopio dotato di fluorescenza (Nikon usiamo un SMZ1500) o su un microscopio verticale (usiamo un Zeiss AxioImager con un obiettivo 5X Fluar). Bassa espressione GFP indica o iniezione riuscita o degrado della trasposasi RNA a causa della contaminazione RNasi (Figura 3A). Selezionare circa il 30% degli embrioni brillanti che hanno o espressione GFP in diversi tessuti o in una elevata percentuale di cellule di un tessuto specifico (confrontare Figures 3B e 3C). Da una iniezione di 1.000 embrioni, di solito abbiamo fino a 100 evolutivamente-normale, alta-GFP che esprimono embrioni.
8. Sollevare embrioni F0 selezionati con procedure zebrafish allevamento standard. E 'ragionevole aspettarsi che il 20-30% degli embrioni iniettati selezionati per l'allevamento potrà sopravvivere fino all'età adulta.

2. Manutenzione degli UAS: MRFP Tester Line.

Abbiamo generato una 14xUAS: linea MRFP segnata da γCry specifico obiettivo: GFP. Poiché UAS è soggetto a tacere attraverso la metilazione del DNA, è importante selezionare il pesce con bassi livelli di tacere per propagare il brodo.

1. Impostare UAS individuale: omozigoti MRFP per l'accoppiamento con una delle nostre linee più affidabili trappola gene GAL4, ^tpl6 NSF (Balciuniene et al in preparazione.).
2. Il giorno successivo, trasferire i UAS: pesce MRFP che hanno dato gli embrioni a singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccoltie puliti.
3. Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf e 3 dpf.
4. Pesce intercross che ha dato embrioni con elevata espressione MRFP per stabilire la prossima generazione di UAS: linea MRFP.

3. Proiezione del F0 Pesce.

1. Croce F0 individuale con il UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4). Noi di solito iniettiamo nostri GBTS in linee con wild-type o leopardo pigmentazione modelli, e le nostre UAS omozigoti: linea MRFP è in ottone background. Pertanto pesce F0 GBT-iniettato può essere facilmente distinguibili dalle UAS: MRFP pesce, eliminando la necessità di registrare se il F0 essere proiettato era un maschio o una femmina così come potenziali errori derivanti da errori di registrazione e / o determinare il sesso ogni pesce. Il personale con esperienza molto limitata, tali noi studenti universitari, sono quindi in grado di impostare e abbattere accoppiamenti di pesce. Questo approccio ha lo svantaggio che due diversi background genetici sonoin uso, potenzialmente complicando interpretazione di perdita di fenotipi funzionali.
2. Il giorno successivo, restituire le UAS in ottone: MRFP pesce per loro serbatoio. Mettere il pesce F0 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici (usiamo Hagen Exo Terra Faunarium Piccolo, ma ogni piccolo serbatoio può essere utilizzata per questo scopo), mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati.
3. Pulire e trasferimento embrioni raccolti in nuove piastre di Petri (<100 a piatto), nel pomeriggio del giorno 0.
4. Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Tirare embrioni positivi sia per GFP e RFP fuori, ordinarli per GFP / RFP pattern di espressione (se più di un modello si osserva in una frizione) e sollevare loro di stabilire generazione F1.
5. Euthanize il pesce F0 che produceva soltanto embrioni negativi (su un numero totale di 50-100 embrioni).
6. Attraversare il pesce F0 che ha prodotto GFP / RFP progenie positivo di nuovo per ottenere un secondo lotto di positivi.

4.Proiezione del F1 Pesce.

Il pesce F1 sono proiettati per stabilire famiglie F2, per documentare trappola genica pattern di espressione e di congelare partite di embrioni per l'identificazione molecolare di trappola gene loci da 5 'RACE e inversa PCR.

1. Attraversare pesce F1 individuale con l'UAS omozigote: MRFP pesce (Figura 4).
2. Il giorno seguente, posizionare il pesce F1 che ha dato embrioni in singoli serbatoi statici, mentre gli embrioni sono raccolti e proiettati.
3. Embrioni schermo per GFP e RFP fluorescenza a 1 dpf, 2 dpf e 3 dpf. Embrioni separati e fotografare positivi sia per la GFP e RFP ^24.
4. A 5 dpf, congelare lotti di 20 GFP / RFP-positivi e 20 GFP / RFP embrioni-negativo per l'identificazione di geni mutati da insertionally inversa PCR e 5 'RACE ^9,10. Sollevare rimanenti / embrioni RFP-GFP positive per stabilire generazione F2.

Risultati

In una iniezione di successo, almeno il 80% degli embrioni iniettati con la trappola gene DNA / Tol2 transposase mix mRNA visualizzare un certo livello di fluorescenza GFP (Figura 3). Quando i brillanti embrioni GFP-positive (Figura 3C) sono selezionati per stabilire la piscina F0, circa uno su 10 proiettato pesce F0 sarà resa gene trap progenie. Tra il pesce F0 da cui gli eventi trappola genica sono recuperati, più trasmettere un singolo evento trappola gene oltre a diverse integrazioni trasposoni non esprimono. Tuttavia, abbiamo stabilito fino a quattro linee trappola gene da un singolo individuo F0. GFP / RFP pattern di espressione in linee trappola gene vanno da estremamente specifico tessuto (per esempio in bulbi olfattivi) ad alquanto onnipresente.

Figura 1. Tegli GAL4 contenenti trappola gene bipartito vettore GBT-B1 e le sue applicazioni. A. I componenti del Gal4 contenente trappola gene vettore: Tol2 5 'e Tol2 3', minimal Tol2 trasposone finisce ^13, CSA, Carp β-actina splice accettore ^8; ^ Gal4-VP16, agosto-meno Gal4-VP16; ZP ( A), zebrafish β-actina UTR e poli 3 '(A) gli elementi da GBT-R15 ^9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) sono componenti di UAS: eGFP cassetta di espressione ^17,18. La freccia indica l'attivazione di UAS: eGFP da Gal4-VP16 prodotta dalla trappola gene B. Il 14XUAS:. MRFP transgene segnato da un γCry specifico obiettivo: cassette GFP. La freccia indica l'attivazione di UAS: MRFP da Gal4-VP16 in trans caso trappola C. Gene.. Scatole blu sono esoni. Splicing è indicato dalla linea tratteggiata. Evento trap D. Enhancer. L'integrazione del vettore in prossimità di un potenziatore (scatola marrone) può mettere il minimo promotore eGFP sotto il controllo di questo enhancer (freccia marrone). Ciò si tradurrebbe in una espressione tessuto-specifica di eGFP, ma dal momento che Gal4-VP16 non è fatto, espressione MRFP non verrebbe attivata.

Figura 2. Inversione di eventi trappola genica utilizzando Cre ricombinasi. A, B. Schema di una trappola gene mutazione (A) e Cre-ritornato trappola gene allele (B). C, D. Co-espressione di GFP (C) e RFP (D) nel sistema nervoso del gene ^tpl6 nsf linea trappola. E, F. Iniezione di Cre RNA in embrioni NSF ^tpl6 porta alla perdita di GFP (E) e RFP (F) espressione. Si noti che non vi è alcuna riduzione di espressione GFP nella lente, come previsto.

Figura 3. Embrioni iniettati con la trappola gene GBT-B1 (pDB783). . A. embrioni iniettati con pGBT-B1 (pDB783) visualizzazione solo poco fluorescenza GFP nel corpo B, C. embrioni iniettati con pGBT-B1 e Tol2 transposase mRNA: un gruppo casuale di embrioni (B) e high-expressors selezionati per l'allevamento (C).

Figura 4. Schema sperimentale per la creazione di GAL4 linee trappola gene. Strutture rosso / verde in parte coincidenti indicano co-espressione di GFP e RFP, mentre il verde indica solo mosaicismo per intrappolare gene o trappola enhancer eventi.

Discussione

I vettori trappola gene e la metodologia qui descritte sono già in uso in diversi laboratori indipendenti. Nella nostra esperienza, ci sono due fasi critiche del processo. Il primo passo fondamentale è quello di raggiungere elevati tassi di integrazione trappola gene in embrioni iniettati F0. Errore in questa fase può spesso essere attribuita alla contaminazione RNasi dei reagenti di iniezione, soprattutto al DNA miniprep. È inoltre molto importante per iniettare embrioni allo stadio 1 cellula per esperimenti trap gene. Nella nostra esperienza, la transgenesi mediata Tol2 è molto efficiente, che permette di ottenere linee transgeniche anche quando l'iniezione successiva alla fase 1 cella o con il DNA di qualità inferiore. Iniezioni incagliati sono molto più problematico quando svolgimento trappola gene mutagenesi, dal momento che solo una piccola frazione delle integrazioni vettoriali comporta efficaci intercettare gli eventi del gene. Il secondo passo fondamentale è quello di accertare intercettare gli eventi del gene attraversando il nostro UAS: linea MRFP. Assenza di espressione MRFP èquasi sempre indicativo di un evento trappola enhancer. Tuttavia, talvolta la mancanza di espressione MRFP può indicare silenziamento dei 14x UAS. E 'quindi importante mantenere le UAS: linea MRFP in uno stato non silenziato propagando la prossima generazione utilizzando gli individui con alta espressione RFP quando incrociate di ^tpl6 NSF.

Siamo in grado di prevedere facendo diversi miglioramenti per i nostri vettori intrappolare gene e il protocollo. Il primo è quello di utilizzare un UAS meno ripetitivo nel costrutto trappola gene. E 'stato dimostrato che un 5x UAS è sufficiente per raggiungere piena attivazione in esperimenti di coltura cellulare, e che le sequenze UAS meno ripetitive sono meno suscettibili di metilazione e silenziamento ^6,25. Può anche essere possibile progettare vettori trappola gene per mutagenesi pienamente subordinata, in analogia con i vettori utilizzati dal mouse trappola gene consorzio internazionale e recentemente adattate zebrafish ^2,26,27. Un altro miglioramento potrebbe essere quella di utilizzare un diverso tSistema ransposon, per esempio Sleeping Beauty ^28, per generare un UAS: linea giornalista MRFP. Ciò consentirebbe iniezione di trappole gene basati Tol2 direttamente nella linea giornalista e lo screening di F0s da incrossing. Inoltre, verrebbe meno l'utilizzo di due differenti background genetico, rendendo l'interpretazione della perdita di fenotipi funzione più semplice. Anche con questi miglioramenti, il Gal4 protocollo trappola gene generale presentata qui sarebbe ancora pienamente applicabile.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miniprep Kit	Qiagen	27104	Optional PB wash step is a must
XbaI restriction enzyme	ThermoFisher	ER0681
mMessage Machine T3	Ambion	AM1348
RiboLock RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	Has to be non-DEPC treated
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles	World Precision Instruments	1B100F-4
Microcapiliaries for calibration	Drummond Scientific	1-000-0010
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003
Needle puller *	Sutter Instruments	P-87
Stereomicroscope for microinjection *	Nikon	SMZ1500	We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand
Picoinjector *	Harvard Instruments	Pli-90	We also use Pli-100
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Zeiss	Zeiss AxioImager	5X Fluar objective has sufficient working distance
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Nikon	SMZ1500
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.