Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

Resumo

Este protocolo descreve o método de armadilha de genes de mutagénese insercional utilizando Gal4-VP16, como o repórter primário e GFP / RFP como repórteres secundárias em peixes-zebra. Cerca de um em cada dez alta expressar F0 gene rendimento peixe armadilha descendência co-expressando GFP e RFP. O processo de rastreio pode ser facilmente dimensionado para se adaptar ao tamanho do laboratório que realiza o ecrã mutagénese insercional.

Resumo

Tamanho da ninhada grande e desenvolvimento externo de embriões opticamente transparentes fazer zebrafish um sistema modelo de vertebrados excepcional para in vivo mutagênese insercional usando repórteres fluorescentes para marcar expressão de genes mutantes. Vários laboratórios construídos e testados vectores estimuladoras e gene-armadilha no peixe-zebra, utilizando proteínas fluorescentes, activadores da transcrição à base de lexA-Gal4 e como repórteres ^1-7. Estes vetores tinha duas desvantagens potenciais: rigor de qualidade inferior (por exemplo, a falta de capacidade de diferenciar entre os eventos realçador e gene-armadilha) e baixa mutagenicidade (por exemplo, integrações em genes raramente produzidos alelos nulos). Gene Quebrando Transposon (GBTS) foram desenvolvidos para enfrentar essas dificuldades ^8-10. Nós modificamos um dos primeiros vetores GBT, GBT-R15, para uso com Gal4-VP16 como o repórter principal armadilha gene e UAS adicionados: eGFP como o repórter secundário para detecção direta de eventos armadilha gene. APLICAÇÃO de Gal4-VP16 como o principal repórter armadilha gene oferece duas vantagens principais. Primeiro, aumenta a sensibilidade para os genes expressos em baixos níveis de expressão. Em segundo lugar, permite aos pesquisadores usar linhas armadilha de genes como motoristas Gal4 a expressão direta de outros transgenes em tecidos muito específicas. Isto é especialmente pertinente para genes com funções não essenciais ou redundantes, onde a integração armadilha gene pode não resultar em fenótipos evidentes. A desvantagem do uso de Gal4-VP16, como o principal gene repórter armadilha é que os genes que codificam para proteínas com sequências de sinal N-terminais, não são passíveis de aprisionamento, como as proteínas de fusão Gal4-VP16 resultantes são susceptíveis de ser capaz de entrar no núcleo e activar transcrição. Mais importante, o uso de Gal4-VP16 não pré-seleccionar as proteínas nucleares: recuperamos mutações armadilha de genes nos genes que codificam para proteínas que funcionam no núcleo, citoplasma e na membrana plasmática.

Introdução

Mutagénese insercional provou ser uma abordagem poderosa para dissecar a função de genes em vários sistemas de modelo a partir de organismos unicelulares, como bactérias e leveduras para os organismos multicelulares, tais como ratos e plantas. Qualquer DNA exógeno (vírus, transposão ou plasmídeo) pode servir como um agente mutagénico, ao interromper elementos essenciais de genes, tais como os exões ou promotores. O alvo eficaz de tais abordagens simples é extremamente pequeno em grandes genomas complexos, uma vez que compreendem exões apenas 1-3% de um genoma animal vertebrado normal. O tamanho pequeno alvo eficaz pode ser superada pelas taxas de integração muito alto vetoriais, como exemplificado pelo tremendo sucesso de mutagénese insercional retroviral em zebrafish ^11,12. Em contraste, os intrões compreendem cerca de 20-30% dos genomas de vertebrados. No peixe-zebra, vetores mutagénese de inserção à base transposon que efetivamente introduzir mutações hypomorphic graves na integração nulo ou em íntrons foram nomeados "transposo gene quebrarns "(GBTS) ^8-10. Para a integração armadilha gene eficiente, eles usam uma Tol2 transposon mínimo ^13,14. Mutagenicidade de GBTS depende de emenda aceitante derivados de peixe e as sequências de terminação / poliadenilação transcrição. Os elementos responsáveis ​​pela GBT mutagenicidade são acompanhadas por sítios loxP directos para a excisão de recombinase Cre. Assim, a injecção de Cre ARNm conduz à reversão eficaz de mutações induzidas por GBT, embora algumas sequências de transposões permanecer no locus integração ^9,10.

Os vetores GBT recentemente publicados usar MRFP como o repórter ^9,10 armadilha gene, levando a duas possíveis deficiências. Em primeiro lugar, não se sabe qual a fracção de genes de peixe-zebra são expressas a um nível suficientemente elevado para ser detectado por proteínas de fusão repórter fluorescentes directos. Em segundo lugar, apenas um pequeno subconjunto de genes que se espera que tenham funções essenciais. Estima-se que existem apenas 1,400-2,400 genes necessários para developme zebrafishnt ^15,16. A maioria dos mutantes de armadilha de genes não são esperados exibir os fenótipos evidentes e, por conseguinte, têm utilidade limitada. Para superar estas duas limitações, modificamos GBT-R15 ^9,10 para usar com Gal4-VP16, como o gene repórter armadilha primária (Balciuniene et al. Em preparação). Tal como acontece com AGO-menos MRFP em GBT-R15, o local de início da tradução foi removida da Gal4-VP16. Para a detecção directa de eventos de armadilha de genes, os vectores contêm um repórter eGFP sob controlo de 14x Gal4 UAS ^17,18.

Vários recursos adicionais são projetados em nossa bipartido vetor armadilha gene. Os UAS: gaveta eGFP é ladeada por locais DRF diretos (chevrons cinza na Figura 1). A injeção de Flp recombinase mRNA leva a excisão das UAS: gaveta eGFP, deixando a mutação armadilha gene não marcado por eGFP fluorescência. Ele pode então ser utilizado em linhas transgénicas que marcam tecidos específicos ou eventos de desenvolvimento de fluorescência da GFP. Como em outrosGBTS, toda a cassete de armadilha gene é flanqueado por sítios loxP directos (pentágonos abertas na Figura 1). Isso faz com que os eventos de armadilha de genes reversível por expressão de Cre recombinase, prontamente, que estabelece a prova de relação de causalidade entre a integração específica armadilha de genes e observado o fenótipo (Figura 2). Finalmente, a cassete de armadilha de genes é flanqueado por sítios invertidas meganuclease I-Scel (triângulos pretos na Figura 1). Em Drosophila, integrações de transposons são muitas vezes convertidos em deleções (deficiências) por excisão imprecisa do elemento P. Não há evidências de que a excisão de Tol2 transposon (ou qualquer outro transposon ativo em vertebrados, como A Bela Adormecida, PiggyBac ou Ac / Ds) pode levar a exclusões. Por isso, incluímos sites de I-SCEI como um método substituto potencial para indução de deleções, mesmo que não haja nenhuma evidência de que I-SCEI pode induzir eliminações no peixe-zebra. Deve notar-se que, enquanto que Mega-Scelnuclease pode ser utilizado para facilitar a transgénese em peixes-zebra, a clivagem de ADN de I-Scel meganuclease é utilizada para estudar os mecanismos de reparação de ADN, incluindo a extremidade não homóloga juntando propensa a erros, de levedura e células de mamíferos ^19-22.

Integração do nosso vector armadilha de genes pode levar à expressão eGFP por dois mecanismos diferentes. O primeiro é um verdadeiro evento armadilha de genes (Figura 1C): o vector se integra num gene (IMG para Mutante por inserção do gene), um transcrito de fusão entre a 5 'do transcrito IMG endógeno e o Gal4-VP16 é feita e traduzida numa proteína de fusão contendo a extremidade N-terminal da proteína codificada pelo IMG e Gal4-VP16. Esta proteína de fusão se liga ao UAS 14x e activa a transcrição de eGFP. O segundo caso, menos desejável, é uma armadilha de intensificador (Figura 1D): o promotor mínimo na frente de eGFP cai sob o controlo de um intensificador de perto do local de integração, o que leva à produção de eGFP na abNesse aspecto de produção Gal4-VP16. Em nossa estimativa, 30-50% dos eventos de expressão eGFP são devido a uma armadilha enhancer e 50-70% são devido a uma armadilha gene ²³ (Balciuniene et al., Em preparação). Para distinguir entre essas duas classes de eventos, fizemos uma 14xUAS: linhagem transgênica MRFP (Figura 1B), por conveniência marcada pela específico lente γCry: (. Balciuniene et al, em preparação) GFP. Eventos gene trap são verificados por co-expressão da GFP e RFP (comparação C e D na Figura 2).

Em nossa tela piloto, recuperamos mais de 40 eventos de trap gene após triagem 270 F0 peixes injetados com uma mistura de DNA transposon e mRNA transposase. Duas de nossas integrações armadilha gene ter ocorrido em genes com previamente publicados mutantes induzidas quimicamente: NSF e flr. Os fenótipos de nossa Mutantes insercionais ^tpl6 nsf e flr ^tpl24 são superficialmente indistinguível do fenótipos dos correspondentes mutantes induzidas quimicamente. Observamos também que os eventos de armadilha de genes apareça inclinado para os intrões perto da extremidade 5 'de genes, aumentando assim a probabilidade de alelos nulos. Fazemos observar algum grau de silenciamento UAS (variegation), em todas as nossas linhas de armadilha gene, e alguns loci são claramente mais suscetíveis a variegation do que outros. Nós não acreditamos que UAS silenciamento é um problema significativo para a propagação de linhas armadilha gene, como temos sido capazes de se propagar facilmente todas as nossas linhas de armadilha gene através de pelo menos cinco gerações, selecionando para a expressão GFP sozinho.

Protocolo

1. Produção da geração F0 por microinjeção da armadilha Gene.

Nós descobrimos que os embriões de diferentes origens genéticas exibir diferentes tolerâncias a este procedimento, com o tipo selvagem baseada em pet-store e Tuebingen - Long Fin (TLF), sendo o mais tolerante, enquanto cepas AB e Tuebingen têm pior sobrevida.

1. Preparação de DNA transposon. Prepare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. Em preparação) do DNA de plasmídeo utilizando o kit QIAprep miniprep padrão (Qiagen 27106). É indispensável incluir a etapa de lavagem PB (que é opcional no processo QIAprep), caso contrário, o ADN miniprep vai ser contaminado por ARNase A, o que leva à degradação do mRNA da transposase. Antes da injecção, dilui-se o ADN em água isenta de RNase (Ambion AM9937) a 10 ng / mL.
2. Preparação de mRNA de transposase. Linearizar pT3TS/Tol2 (pDB600) ¹³ usando XbaI e transcrever o ADN linearizado usando uma máquina T3 mMessage(Ambion AM1348) no kit de transcrição in vitro. Nós modificamos a reação de transcrição in vitro pela adição de 0,5 mL de inibidor RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). Após o passo de tratamento de DNase, purificar o ARNm utilizando um kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Avaliar a qualidade de o ARNm transcrito in vitro, em por electroforese em gel de agarose. Diluir o mRNA em água RNase a 40 ng / mL, e armazenar como 2 mL alíquotas a -80 ° C.
3. Preparação da mistura de microinjeção. Antes da injecção, adicionar 8 ul de DNA transposon diluída a uma alíquota de 2 ul de ARNm da transposase.
4. Microinjeção. Injectar 3 nl de mistura de ADN / ARN na gema de 1 embriões de peixe-zebra celular usando técnicas de microinjeção padrão, apontando para a interface / gema de blastômeros. Coletar embriões a cada 20 minutos para garantir a injeção em um estágio de célula. Em nossa experiência, uma pessoa hábil pode facilmente injetar 1.000 embriões em 1-1,5 horas.
5. Após a injeção, executar 5 mL de esquerdamais de solução de injecção de um gel de agarose a 1% para o controlo de qualidade, para assegurar que o ARNm da transposase não tenha sido degradada.
6. Cuidado embrião injetado. No final da tarde, retire embriões não fertilizados e anormais e distribuir embriões para 60-80 por 100 milímetros placa de Petri. Embriões anormais e mortas são removidas no pós fecundação um dia (DPF), 2 dpf e 3 dpf.
7. Triagem para a expressão GFP. Embriões tela sem defeitos evidentes de fluorescência da GFP em 3 dpf (Figura 3). O rastreio pode ser feito tanto em um estereomicroscópio equipado com fluorescência (nós usamos uma Nikon SMZ1500) ou em um microscópio vertical (nós usamos uma Zeiss AxioImager com um objetivo 5X Fluar). Baixa expressão da GFP indica um insucesso de injecção ou a degradação de RNA de transposase, devido à contaminação com RNase (Figura 3A). Selecione cerca de 30% dos embriões mais brilhantes que ou tenham expressão GFP em vários tecidos ou em uma alta porcentagem de células de um tecido específico (compare Figures 3B e 3C). A partir de uma injeção de 1.000 embriões, que geralmente têm até 100, de alta GFP-expressando embriões developmentally-normais.
8. Levante embriões F0 selecionados usando os procedimentos de criação de peixe-zebra normais. É razoável esperar que 20-30% dos embriões injetados selecionados para criação vão sobreviver até a idade adulta.

2. Manutenção dos UAS: MRFP Tester Line.

Geramos um 14xUAS: Linha MRFP marcado por γCry específicas de lente: GFP. Desde UAS está sujeita a silenciar por metilação do DNA, é importante para selecionar os peixes com baixos níveis de silenciar para propagar o estoque.

1. Configure UAS individual: homozigotos MRFP para acasalar com um de nossos Gal4 linhas armadilha gene mais confiáveis, ^tpl6 NSF (Balciuniene et al, em preparação.).
2. No dia seguinte, transferir os UAS: MRFP peixe que deram embriões para os tanques estáticos individuais, ao passo que os embriões são recolhidose limpos.
3. Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf e 3 dpf.
4. Peixe intercross que deu embriões com alta expressão MRFP para estabelecer a próxima geração de UAS: Linha MRFP.

3. Triagem da F0 peixe.

1. Atravessar F0 indivíduo com o UAS homozigoto: MRFP peixe (Figura 4). Costumamos injetar nossos GBTS em linhas com padrões do tipo selvagem ou leopardo de pigmentação, e os nossos UAS homozigotos: Linha MRFP está na base bronze. Portanto peixe F0 GBT-injetado pode ser facilmente distinguidas das UAS: MRFP peixe, eliminando a necessidade de registrar se o F0 sendo exibido era um homem ou uma mulher, bem como os erros potenciais resultantes de erros de gravação e / ou que determinam o sexo do cada peixe. Pessoal com experiência muito limitada, tais nós, estudantes de graduação, são, portanto, capaz de criar e quebrar acasalamentos de peixe. Esta abordagem tem a desvantagem de que duas origens genéticas diferentes sãosendo utilizado, potencialmente complicando a interpretação de perda de fenótipos funcionais.
2. No dia seguinte, retornam os UAS bronze: MRFP peixe para seu tanque. Coloque o peixe, o que deu F0 embriões em tanques estáticos individuais (usamos Hagen Exo Terra Faunarium pequeno, mas qualquer pequeno tanque pode ser utilizado para este fim), enquanto que os embriões são colhidos e rastreados.
3. Embriões coletados limpas e transferência para novas placas de Petri (<100 por prato) na tarde do dia 0.
4. Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf, 2 e 3 dpf dpf. Puxe embriões positivos tanto para GFP e RFP para fora, ordená-los por GFP / RFP padrão de expressão (se mais de um padrão é observado em uma embreagem) e criá-los para estabelecer a geração F1.
5. Eutanásia o peixe F0 que produziu apenas os embriões negativos (de um total de 50-100 embriões).
6. Cruze os peixes F0 que produziu GFP / RFP progênie positivo novamente para obter um segundo lote de positivos.

4.Triagem da F1 peixe.

O peixe F1 são selecionados para estabelecer famílias F2, para documentar armadilha gene padrão de expressão e de congelar lotes de embriões para a identificação molecular de armadilha gene loci por 5 'RACE e PCR inversa.

1. Atravesse peixe F1 indivíduo com a UEA homozigoto: MRFP peixe (Figura 4).
2. No dia seguinte, coloque o peixe F1 que deu embriões em tanques estáticos individuais enquanto os embriões são coletados e selecionados.
3. Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf, 2 e 3 dpf dpf. Embriões separados e fotografar positivos tanto para GFP e RFP ^24.
4. Às 5 dpf, congelar lotes de 20 GFP / RFP-positivo e 20 GFP / RFP embriões-negativo para a identificação de genes que sofreram mutação por inserção por PCR inverso e 5 'RACE ^9,10. Levante restantes GFP / RFP embriões positivos para estabelecer a geração F2.

Resultados

Em uma injecção com sucesso, pelo menos 80% dos embriões injectados com a armadilha de genes de DNA / Tol2 mistura ARNm da transposase exibir algum grau de fluorescência de GFP (Figura 3). Quando os embriões mais brilhantes GFP positivas (Figura 3C) são seleccionados para estabelecer a piscina F0, cerca de uma em 10 rastreados peixe F0 produzirá gene armadilha descendência. Entre os peixes F0 a partir do qual os eventos armadilha gene são recuperados, a maioria transmitir um único evento armadilha gene além de várias integrações transposon não expressando. No entanto, nós estabelecemos até quatro linhas armadilha gene de um único indivíduo F0. Padrões de expressão GFP / RFP em linhas de armadilha de genes variam de extremamente específica do tecido (por exemplo, em bulbos olfatórios) para bastante onipresente.

Figura 1. Tele gal4 contendo armadilha gene bipartido vetor GBT-B1 e suas aplicações. A. Componentes da Gal4 contendo vetor armadilha gene: Tol2 5 'e Tol2 3', minimal transposon Tol2 termina ^13; CSA, Carp β-actina emenda aceitante ^8; ^ Gal4-VP16, AUG-menos Gal4-VP16; zp ( A), peixe-zebra β-Actina UTR e poli 3 '(A) elementos do GBT-R15 ^9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) são componentes da UAS: eGFP cassete de expressão ^17,18. A seta indica a ativação do UAS: eGFP por Gal4-VP16 produzido pela armadilha gene B. A 14XUAS:. MRFP transgene marcado por uma lente específica γCry: cassete GFP. A seta indica a ativação do UAS: MRFP por Gal4-VP16 em C. Gene evento trans armadilha.. As caixas azuis são exons. Emenda é indicado pela linha pontilhada D. Enhancer evento armadilha.. A integração do vector de perto de um potenciador (caixa castanho) pode colocar o promotor eGFP mínima sob o controle deste potenciador (seta castanho). Isto resultaria em uma expressão específica de tecido de eGFP, mas uma vez que Gal4-VP16 não é feito, a expressão MRFP não seria activado.

Figura 2. Reversão de eventos armadilha gene utilizando Cre recombinase. A, B. Esquema de uma mutação armadilha de genes (A) e reverteu Cre-armadilha alelo do gene (B). C, D. A co-expressão de GFP (C) e RFP (D) no sistema nervoso do gene ^tpl6 nsf linha de armadilha. E, F. A injeção de Cre RNA em embriões ^tpl6 NSF leva à perda de GFP (E) e RFP (F) expressão. Note-se que não existe uma redução da expressão da GFP na lente, conforme o esperado.

Figura 3. Os embriões injectados com a armadilha de genes GBT-B1 (pDB783). . A. Os embriões injectados com pGBT-B1 (pDB783) sozinho exibição pouco fluorescência da GFP no corpo B, C. Os embriões injectados com pGBT-B1 e Tol2 ARNm da transposase: um grupo aleatório de embriões (B) e alto-expressores seleccionados para a criação (C).

Figura 4. Delineamento experimental para o estabelecimento de linhas Gal4 armadilha gene. Estruturas vermelho / verde parcialmente coincidentes indicam co-expressão de GFP e RFP, enquanto verde por si só indica mosaicismo para interceptar eventos gene ou potenciador armadilha.

Discussão

Os vetores armadilha gene ea metodologia aqui descritas já estão sendo utilizados em vários laboratórios independentes. Em nossa experiência, há duas etapas críticas do processo. O primeiro passo crítico é atingir altos índices de integração armadilha gene em embriões de F0 injetadas. Falha neste passo pode muitas vezes ser atribuída à contaminação com RNase dos reagentes de injecção, especialmente o ADN miniprep. É também muito importante para injectar embriões na fase 1 de células para as experiências de armadilha de genes. Na nossa experiência, transgénese mediada Tol2 é muito eficiente, tornando-se possível obter linhas transgénicas mesmo quando se injecta mais tarde do que a fase 1 da célula ou com o ADN de menor qualidade. Injeções de qualidade inferior são muito mais problemáticas na realização de mutagênese armadilha gene, uma vez que apenas uma pequena fração das integrações vetor resultar em eventos armadilha gene eficazes. O segundo passo fundamental é verificar interceptar eventos de genes através do cruzamento para o nosso UAS: Linha MRFP. Ausência de expressão é MRFPquase sempre indicativo de um evento potenciador armadilha. No entanto, por vezes, a falta de expressão MRFP pode indicar silenciamento dos 14x UAS. Por isso, é importante manter as UAS: Linha MRFP em um estado não-silenciadas pela propagação da próxima geração usando indivíduos com alta expressão de RFP, quando cruzou para ^tpl6 NSF.

Podemos prever fazendo várias melhorias para nossos vetores armadilha gene e protocolo. A primeira é a utilização de uma UAS menos repetitivo na construção armadilha de genes. Tem sido demonstrado que uma 5x UAS é suficiente para alcançar a activação completa em experiências de cultura de células, e que as sequências UAS menos repetitivas são menos sensíveis à metilação e silenciamento ^6,25. Também pode ser possível conceber vectores armadilha de genes para a mutagénese totalmente condicional, em analogia com os vectores usados ​​pelo ratoeira gene consórcio internacional e recentemente adaptados para peixe-zebra ^2,26,27. Outra melhoria seria a utilização de um diferente tsistema ransposon, por exemplo A Bela Adormecida ^28, para gerar um UAS: linha repórter MRFP. Isso permitiria a injeção de armadilhas de genes baseados em Tol2 diretamente na linha de repórter e triagem de F0s por incrossing. Além disso, isto elimina a utilização de dois fundos genéticos diferentes, fazendo a interpretação de perda de fenótipos funcionais mais simples. Mesmo com estas melhorias, o Gal4 protocolo geral armadilha gene apresentado aqui ainda seria plenamente aplicável.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miniprep Kit	Qiagen	27104	Optional PB wash step is a must
XbaI restriction enzyme	ThermoFisher	ER0681
mMessage Machine T3	Ambion	AM1348
RiboLock RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNeasy MinElute	Qiagen	74204	Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	Has to be non-DEPC treated
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles	World Precision Instruments	1B100F-4
Microcapiliaries for calibration	Drummond Scientific	1-000-0010
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003
Needle puller *	Sutter Instruments	P-87
Stereomicroscope for microinjection *	Nikon	SMZ1500	We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand
Picoinjector *	Harvard Instruments	Pli-90	We also use Pli-100
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Zeiss	Zeiss AxioImager	5X Fluar objective has sufficient working distance
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *	Nikon	SMZ1500
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.