Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

Riepilogo

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Abstract

CD4 + cellule T regolatorie (Treg) sono potenti modulatori immunitari e servono una funzione importante nella omeostasi immunitaria umana. L'esaurimento delle Tregs ha determinato aumenti misurabili in antigene-specifiche risposte delle cellule T nelle impostazioni del vaccino per il cancro e gli agenti patogeni infettivi. Tuttavia, il loro ruolo in HIV-1 immuno-patogenesi rimane controversa, in quanto potrebbero servire sia per sopprimere deleteria attivazione immunitaria HIV-1-associata e quindi rallentare la progressione della malattia da HIV-1 o in alternativa sopprimere l'immunità HIV-1-specifica e, quindi, promuovere virus diffondersi. La comprensione e la funzione Treg modulando nel contesto di HIV-1 potrebbero portare a potenziali nuove strategie di immunoterapia o vaccini contro l'HIV. Tuttavia, importanti questioni aperte rimangono sul loro ruolo nel contesto di HIV-1, che deve essere studiato con attenzione.

Rappresentando circa il 5% di CD4 + cellule T nel sangue periferico, studiando la popolazione Treg è dimostrato difficile, esspecialmente in HIV-1 individui infetti in cui l'HIV-1-associati delle cellule T CD4 e si verifica che la deplezione Treg. La caratterizzazione delle cellule T regolatorie in individui con HIV in fase avanzata-1 malattia o campioni di tessuto, per cui solo molto piccoli campioni biologici possono essere ottenuti, è quindi estremamente impegnativo. Noi proponiamo una soluzione tecnica per superare queste limitazioni utilizzando l'isolamento e l'espansione delle Treg da individui HIV-1-positivi.

Qui si descrive un metodo semplice e affidabile per espandere con successo Treg isolate da individui HIV-1-infetti in vitro. Flow-sorted CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^partire Tregs state stimolate con anti-CD3/anti-CD28 perline rivestite e coltivate in presenza di IL-2. L'espanso Treg espresso alti livelli di FOXP3, CTLA4 e HELIOS rispetto alle cellule T convenzionali e risultano essere molto soppressiva. Più facile l'accesso a un gran numero di Treg permetterà ai ricercatori di affrontare importante domande riguardanti il ​​loro ruolo in HIV-1 immunopatogenesi. Crediamo rispondere a queste domande può fornire indicazioni utili per lo sviluppo di un efficace vaccino HIV-1.

Introduzione

Con più di 34 milioni di persone che vivono con l'HIV / AIDS in tutto il mondo e si stima che 2,5 milioni di persone recentemente infettate nel 2011, la necessità di un efficace vaccino HIV per frenare l'epidemia di HIV in tutto il mondo rimane fondamentale. Tuttavia, nonostante tre decenni di intensi sforzi di ricerca, gli HIV-1 vaccino prove di efficacia fino ad oggi hanno portato solo una protezione modesta ^1-3 ed i correlati di protezione immunitaria sono ancora limitate. Delucidare la natura della risposta immunitaria necessaria per la protezione è essenziale per la progettazione strategica di un efficace vaccino HIV-1 e di altre strategie immunoterapeutiche di targeting HIV-1.

CD4 Naturali + cellule T regolatorie (Treg) sono fondamentali per il mantenimento dell'omeostasi delle cellule immunitarie attraverso il controllo attivazione immunitaria eccessiva, limitando così i danni ai tessuti immuno-mediata. Tuttavia, possono anche sopprimere le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni e prevenire la loro liquidazione. Cancro e Hepatitis studi vaccino B hanno dimostrato che diminuendo l'attività di Treg può migliorare la risposta al vaccino e antigene-specifica immunità contro i virus ^4-7. Tuttavia, nel contesto di infezione da HIV-1, l'esatto impatto delle cellule T regolatorie rimane completamente compresa. Tregs hanno mostrato di diminuire la replicazione virale in cellule T attivate ⁸ ed eventualmente urtare attivazione immunitaria ^9. Sono stati anche dimostrato di sopprimere le risposte immunitarie HIV-1-specifiche, che potrebbe avere conseguenze negative per la progressione della malattia ^10,11. Così, prima di poter modulare l'attività Treg per migliorare l'efficacia di un vaccino di HIV-1, è importante ottenere una visione più la loro funzione in questo contesto malattia.

CD4 + umane cellule T regolatorie sono una popolazione di cellule relativamente scarsa, che rappresentano circa il 5% delle cellule T CD4 + nel sangue periferico, e il loro numero assoluto ulteriore diminuzione con CD4 HIV-associati + T deplezione delle cellule ^{12 <}/ Sup>. Saggi attuali per valutare la funzione Treg, come ad esempio T saggi di proliferazione delle cellule Treg con co-coltura, utilizzare il numero di cellule relativamente grandi ^12. Pertanto, la funzione e la specificità delle cellule T regolatorie che caratterizza in persone con HIV in stadio avanzato 1 malattia è stato impegnativo, nonostante la loro importanza per la patogenesi dell'HIV.

L'isolamento e l'espansione ex vivo di Treg da HIV-1 i pazienti potrebbero rappresentare una soluzione per superare alcune di queste limitazioni. Qui si descrive un protocollo semplice e robusto per espandere Treg funzionale derivato da HIV-1 individui infettati in vitro, abbiamo ulteriormente spieghiamo come loro fenotipo e testare la loro funzione soppressiva utilizzando saggi di citometria a flusso. Crediamo che questo protocollo faciliterà l'accesso al Treg e di aiuto per capire il loro ruolo in HIV-1 la progressione della malattia.

Protocollo

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood

1. Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube.
2. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature.
3. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical tube for 20 min at 1,200 x g with a slow start and no brakes.
4. Transfer the CD4⁺ T cell enriched PBMC layer in a new 50 ml conical tube, wash the cells by adding PBS/2% FBS and spin them down for 10 min at 1,200 x g. Then count the cells, wash again and resuspend the cells at about 20 x 10⁶/200 μl.
5. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-Phycoerythrin-Cyanine 7 (PE-Cy7) (1/100)
   anti-CD4-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (1/40)
   anti-CD25-Allophycocyanin (APC) (1/40)
   anti-CD127-Phycoerythrin (PE) (1/20)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
6. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells at 20 x 10⁶/ml in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
7. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg in X-VIVO 15 media (see gating strategy in Figure 1). Conventional T cells (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺) can be isolated and expanded as negative controls.

2. Cell Culture

1. After isolation, wash the Treg with X-VIVO 15 media.
2. Resuspend the cells at 250 x 10³/ml in X-VIVO 15 media complemented with 10% Human Serum and Penicillin-Streptomycin (50 U/ml).
3. Wash Human T-Activator CD3/CD28 beads according to manufacturer's protocol. Add beads to isolated Tregs at a ratio of 1:1 bead per cell.
4. After two days of culture, double the media volume and add IL-2 (300 U/ml).
5. Culture the Tregs for 2 weeks. Change media (X-VIVO 15/Human serum/P/S/IL-2) at days 5, 7, 9, 12. Add beads at a 1:1 ratio at day 9. When changing media, keep cells at 250 x 10³/ml.

3. Phenotyping

At the end of the expansion culture, expanded CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg can be phenotyped by flow cytometry and compared to expanded CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺ conventional T cells as a control.

1. Harvest expanded Tregs/Tconvs and wash them in PBS. Label dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
2. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-Qdot-655 (1/200)
   anti-CD25-PECy5 (1/100)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
3. Wash the cells and perform the intracellular staining using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set according to manufacturer's protocol and the following antibodies:
   anti-FOXP3-PE (1/50)
   anti-HELIOS-FITC (1/40)
   anti-CTLA4-APC (1/20)
   Acquire the data on a flow cytometer.

4. Suppression Assay

At the end of the expansion culture, the suppressive function i.e. the capacity of the expanded Treg isolated from HIV-1 positive individuals to suppress the proliferation of activated T cells can be assessed in vitro.

1. Thaw autologous cryopreserved ex vivo PBMCs. Leave them for about 3 hr in a 37 °C incubator in RPMI 1640 medium containing penicillin/streptomycin, L-glutamine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (=R+ media), and 10% FBS (=R10 media).
2. Label the dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to the manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
3. Incubate the cells with anti-CD3-PECy7 for 30 min in the dark at 4 °C. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
4. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the viable CD3+ T cells in R10 media.
5. Label the T cells with a cell tracing reagent such as CellTrace Violet or Vybrant CFDA SE Cell Tracer at 5 μM diluted in PBS for 7 min at 37 °C according to the manufacturer's protocol. Resuspend cells in R+ media supplemented with 10% human serum (=hR10 media) at 1 x 10⁶/ml.
6. Harvest the expanded Tregs, resuspend the cells at 0.5 x 10⁶/ml in hR10 and prepare dilutions at 0.25 x 10⁶/ml and 0.125 x 10⁶/ml.
7. Prepare anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28 microbeads according to the manufacturer's protocol, resuspend the microbeads at 0.75 x 10⁶/ml and prepare dilutions at 0.625, 0.562, 0.5 x 10⁶/ml in hR10 media.
8. In a 96 wells round bottom plate, transfer cells and beads according to the following plan:

T cells:Treg ratio	1:0	1:1/2	1:1/4	1:1/8
T cells (50 μl)	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml
Tregs (50 μl)	no	0.5 x 106/ml	0.25 x 106/ml	0.125 x 106/ml
Beads (100 μl)	0.5 x 106/ml	0.75 x 106/ml	0.625 x 106/ml	0.562 x 106/ml
hR10 (50 μl)	yes	no	no	no
i.e.
T cells	50 x 103	50 x 103	50 x 103	50 x 103
Tregs	0	25 x 103	12.5 x 103	6.25 x 103
Beads	50 x 103	75 x 103	62.5 x 103	56.25 x 103

9. After 4 days of culture, wash the cells and incubate them for 30 min at 4 °C with the following antibodies:
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-APC (1/100)
   anti-CD8-AF700 (1/100)

Acquire the data on a flow cytometer. Use the FlowJo proliferation platform to calculate the percentage of divided cells.

Risultati

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations ¹³ and have been shown to correlate with CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Tregs ^9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti...

Discussione

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) ¹⁵, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	Stemcells technologies	15062
PBS	Sigma	D8537
FBS	Sigma	F4135
Histopaque	Sigma	H8889
Anti-CD3-PECy7	BD Pharmingen	557851
Anti-CD4-FITC	eBioscience	11-0049-42
Anti-CD25-APC	eBioscience	17-0259-42
Anti-CD127-PE	BD Pharmingen	557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh	BD Falcon	352235
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30-001-Cl
Human Serum	Gemini Bio-Products	100-512
Human T-activator CD3/CD28	Life Technologies	111.31D
IL-2	NIH Aids Research Reference Reagent Program	136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Life technologies	L34955
Anti-CD4-qdot-655	Life Technologies	Q10007
Anti-CD25-PECy5	eBiosciences	15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	eBiosciences	00-5523-00
Anti-FOXP3-PE	eBiosciences	12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC	Biolegend	137204
Anti-CTLA4-APC	BD Pharmingen	555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Life Technologies	V12883
HEPES	Mediatech	25-060-Cl
Treg Suppression inspector	Miltenyi Biotec	130-092-909
Anti-CD4-APC	BD Pharmingen	340443
Anti-CD8-AF700	BD Pharmingen	557945
RPMI 1640	Sigma	R0883
Glutamine	Mediatech	25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD)	Becton, Dickinson and Company (BD)	364606
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences	-
LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences	-
FlowJo	Tree Star	v887