I radicali liberi in Chemical Biology: da comportamento chimico a sviluppo Biomarker

Riepilogo

Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.

Abstract

Il coinvolgimento dei radicali liberi nelle scienze della vita è costantemente aumentato con il tempo ed è stato collegato a numerosi processi fisiologici e patologici. Questo tema abbraccia diverse aree scientifiche, che vanno dalla fisica, chimica biologica e bioorganica alla biologia e la medicina, con applicazioni al miglioramento della qualità della vita, la salute e l'invecchiamento. Competenze multidisciplinari sono necessari per la completa indagine delle molteplici sfaccettature dei processi radicali in ambito biologico e chimico conoscenza svolge un ruolo cruciale nello svelare i processi ei meccanismi di base. Abbiamo sviluppato un approccio di biologia chimica in grado di connettersi gratuitamente reattività radicale chimica con i processi biologici, fornendo informazioni sui percorsi meccanici e prodotti. Il nucleo di questo approccio è la progettazione di modelli biomimetici per studiare il comportamento biomolecola (lipidi, acidi nucleici e proteine) in sistemi acquosi, ottenendo intuizioni della reazione percorsi nonché unas costruire librerie molecolari dei prodotti di reazione radicali liberi. Questo contesto può essere usato con successo per il rilevamento e biomarker esempi sono forniti con due classi di composti: mono-trans isomeri di esteri del colesterolo, che sono sintetizzati e utilizzati come riferimenti per il rilevamento in plasma umano, e purine 5 ',8-ciclo-2 '-deoxyribonucleosides, preparati e utilizzati come riferimento nel protocollo per il rilevamento di tali lesioni in campioni di DNA, dopo radiazioni ionizzanti o ottenuti da diverse condizioni di salute.

Introduzione

La reattività dei radicali liberi rivelato la sua enorme importanza per molti eventi biologici, inclusi anziani e l'infiammazione. Oggigiorno è sempre più evidente che la chiarificazione di ogni fase chimici coinvolti in questa reattività è necessario, al fine di comprendere i meccanismi e le strategie prevedono efficaci per il controllo dei radicali liberi e di riparazione del danno. Il contributo studi chimici è fondamentale, ma lo studio diretto nell'ambiente biologico può essere difficile, in quanto la sovrapposizione di diversi processi complica e perturba l'esame dei risultati e delle relative conclusioni. Di conseguenza, la strategia di modellare reazioni dei radicali liberi in condizioni biologicamente connessi è diventato un passo fondamentale nella ricerca di meccanismi chimici in biologia.

Negli ultimi dieci anni il nostro gruppo ha sviluppato modelli di processi senza radicali in condizioni biomimetiche. In particolare endal viso trasformazioni biologicamente rilevanti di acidi grassi insaturi, nucleosidi, e aminoacidi contenenti zolfo e metterli in pista per essere valutati e validati come biomarker dello stato di salute. ^1-4

Il nostro approccio generale si compone di tre moduli:

• Sintesi organica, che fornisce l'accesso a biomolecole opportunamente modificati. Il piano sintetico può essere anche progettato per simulare i processi radicali liberi presenti nell'ambiente biologico, applicando così condizioni in grado di simulare il processo biologico di interesse, che è il principio della chimica biomimetica radicale. In modelli biomimetici mezzo di reazione è acqua o un mezzo eterogeneo per la coesistenza di compartimenti idrofili e idrofobi. Il vantaggio di lavorare con modelli biomimetici è quello di avere un ambiente semplificato con i partner di reazione note, dove la reattività e prodotti possono essere esaminati più in dettaglio, eventualmente scoprirenuovi percorsi chimici. Da questo punto informazioni sui meccanismi e cinetiche possono essere raccolti;
• Purificazione, analisi e caratterizzazione dei prodotti, fornendo informazioni strutturali e chimiche delle biomolecole modificate per organizzare librerie molecolari e facilitare recognition.in l'ambiente più complesso biologico. Protocolli sono stabiliti anche in vista di risolvere miscele complesse di composti come quelli derivati ​​da campioni biologici;
• Biomarker di sviluppo utilizzando campioni biologici, derivanti sia da esperimenti in vitro su colture cellulari e studi in vivo da animali ed esseri umani. I protocolli sviluppati in modelli biomimetici sono poi applicato all'analisi di campioni complessi, per prevedere le trasformazioni radicali liberi in condizioni diverse. Librerie molecolari sviluppati da sintesi sono di enorme aiuto alle scoperte delle scienze della vita. Le informazioni raccolte sul trasformazioni radicali liberi give la possibilità di capire le strategie di riparazione e prevenzione. Database dei risultati possono essere utilizzati per un'attenta valutazione mediante analisi multivariata del significato biomarker nonché possibili fattori associati.

Abbiamo scelto due classi di biomarcatori rilevanti per accreditare questo approccio: esteri del colesterolo e purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides.

Protocollo

1. Sintesi di Mono-trans isomeri di esteri del colesterolo

1. Sciogliere esteri del colesterolo (linoleato o arachidonato cholesteryl estere) in 2-propanolo (15 mm). Per una migliore solubilizzazione, i campioni sono stati sonicati per 15 min sotto argon.
2. Trasferire la soluzione in un reattore fotochimico quarzo, aggiungere 2-mercaptoetanolo in 2-propanolo (7 per raggiungere la concentrazione mM, da una soluzione 2 M magazzino del tiolo). Lavare la miscela di reazione con argon per 20 minuti al fine di eliminare la presenza di ossigeno nella soluzione.
3. Irradiare la miscela di reazione con luce UV utilizzando un 5.5W bassa pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 4 min. Monitor analitica Ag-TLC (cromatografia argento sottile strato) in evidenza la formazione di mono-trans esteri del colesterolo (vedi Figura 1 per le formule chimiche). La colorazione TLC viene effettuata versando la piastra nella cerio ammonio molibdato (CAM) soluzione, e le macchie appaiono sul riscaldamentola piastra. Estinguere la reazione in una fase iniziale, al fine di recuperare il materiale di partenza, che può essere riutilizzato per eseguire altre fasi di isomerizzazione, ottenendo un aumento del rendimento complessivo.
4. Raccogliere la miscela di reazione in un pallone, lavare l'apparecchiatura con pochi ml di 2-propanolo. Rimuovere il solvente e purificare i mono-trans isomeri di esteri del colesterolo di Ag-TLC come descritto in letteratura. ⁵ Utilizzare esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente per mono-trans isomeri colesteril linoleato, mentre esano uso -dietil etere-acetico (9:1:0,1 v / v) di mono-trans isomeri arachidonato colesterolo.

2. Isolamento di Cholesteryl Frazione Esteri da siero umano

1. Diluire 1 ml di siero umano (ottenuto per centrifugazione del sangue) con 1 ml di salamoia e versare la soluzione in un imbuto separatore sotto flusso di argon per evitare artefatti (es. addotti di ossidazione). Aggiungere 10 ml di cloroformio-metanolo (2: 1 v / v) tre volte. Agitare l'imbuto di separazione molto lentamente per limitare la formazione dell'emulsione dovuta alla presenza di albumina.
2. Lavare gli strati organici volta con salamoia (10 ml), poi raccogliere in una beuta sotto un flusso di argon, secca su sodio solfato anidro. Rimuovere volatili da evaporatore rotante per dare un olio giallo (totale frazione lipidica plasma).
3. Raccogliere il grezzo con 1 ml di cloroformio-metanolo (2:1 v / v), il carico su una TLC preparativa sotto flusso di argon e usare una miscela di esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente . Raschiare la parte di silice contenente la frazione colesterolo estere e versare in una fiala. Quindi, estrarre silice (3 × 5 ml) con cloroformio-metanolo (2:1 v / v), gli strati organici raccogliere e rimuovere il solvente dopo evaporazione ottenendo la frazione pura di esteri del colesterolo (solitamente ~ 1,5 mg).
4. Tenere esteri del colesterolo in un flaconcino scuro coperto da un foglio di alluminio sotto Argon e conservare a -20 ° C. Del colesterolo ester sono sensibili alla luce e ossigeno.

3. Caratterizzazione di esteri del colesterolo Mono-trans di Spettroscopia Raman

1. Estratto esteri del colesterolo da siero umano (≥ 0,7 mg), come descritto nella sezione 2, sciogliere in una piccola quantità di tetracloruro di carbonio (≤ 10 pl) e mettere in un flaconcino. CCl ₄ è selezionato come solvente perché il suo segnale Raman non si sovrappone alla regione di interesse di analisi degli esteri del colesterolo.
2. Trasferire la soluzione di supporto del campione attraverso una pipetta di vetro monouso, poi rimuovere il solvente da un lento flusso di argon. Una volta che una pellicola uniforme oleosa è formata sulla parete interna del supporto del campione, inserire quest'ultima nello strumento di misurazione.
3. Trasformata di Fourier spettro Raman di esteri del colesterolo si ottiene direttamente sugli estratti lipidici senza alcuna reazione di derivatizzazione. La potenza del laser sul campione è <100 mW per evitare danni campione. Il numero totale di scansioniper ogni spettro è ≥ 800 per minimizzare il rumore di fondo.
4. La gamma 1,700-1,630 cm ^-1 dello spettro Raman è analizzato poiché riflette il contributo dei C = C doppi legami presenti nella molecola (C = C stiramento mode). Un'analisi di adattamento della curva viene eseguita su questa regione, consentendo la distinzione dei contributi sovrapposti di cis e trans doppi legami nella catena grassa alchile e doppio legame nell'anello B anello di colesterolo (vedi Figura 2).
5. Per montare correttamente le bande vibrazionali, alcuni parametri devono essere fissati o vincolata entro limiti ragionevoli. I profili di picco del componente sono descritti come una combinazione lineare di Lorentzian e funzioni gaussiane, mentre le larghezze di banda a metà altezza sono meglio determinato dalla routine di ottimizzazione del computer. Il numero e la posizione dei picchi di componenti sono ottenuti utilizzando gli spettri quarto derivato, che consentono di rilevare anche alcune bande componenti deboli. Poiché il segnaleal rumore che deteriora sulla differenziazione del segnale può preclude l'uso del derivato quarto, lisciato derivati ​​quarto con tredici punti Savitsky-Golay funzione, sono di vantaggio, quindi un giusto compromesso tra risoluzione e rapporto segnale-rumore è ottenuto . Migliore adattamento curva sono disponibili presso i più bassi possibili c ² valori.
6. La presenza di trans isomeri è rivelata dal componente a 1671 ± 1 cm ^-1, in aggiunta, almeno, le due componenti, leggermente spostata verso frequenze più basse, a causa della catena di acido grasso e colesterolo legami C = C doppi. Rappresentante spettro Raman di plasma colesteril estere è mostrato in Figura 9. Nel riquadro confronto di una regione specifica di colesteril linoleato e mono-trans isomeri colesteril linoleico è mostrato.

4. Derivatizzazione di esteri metilici degli acidi grassi (FAME) e analisi mediante gascromatografia

1. Sciogliereesteri del colesterolo (~ 1,5 mg) con 0,5 ml di una soluzione 1 M di idrossido di sodio in benzene-metanolo (2:3 v / v) e posto in un flacone scuro coperto da un foglio di alluminio sotto argon.
2. Lascia la miscela sotto agitazione a temperatura ambiente e monitor mediante TLC usando una miscela di esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente. Tempo di reazione è di solito 30 min ma un attento monitoraggio reazione è richiesto. Infatti, una volta che i corrispondenti esteri metilici si formano, la reazione deve essere raffreddato per evitare la formazione di prodotti di degradazione e di lato. TLC ha mostrato la formazione di esteri metilici quantitativa.
3. Estinguere la miscela di reazione con l'aggiunta di 1 ml di salamoia ed estrarre gli esteri metilici con n-esano (3 x 2 ml). Raccogliere gli strati organici in una fiala e rimuovere il solvente mediante evaporazione rotante per dare la frazione metil estere, che viene quindi utilizzato per analisi GC senza ulteriore purificazione.
4. Sciogliere gli esteri metilici nel quantitativo minimo di n-esano (solitamente 1 mg a 50 microlitri) e iniettare nel gascromatografo dotato di 60 m × 0,25 mm × 0,25 micron (50%-cianopropile)-metilpolisilossano colonna. Utilizzare un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) con il seguente programma di forno: inizio temperatura a 165 ° C, mantenuta per 3 min, seguito da aumento di 1 ° C / min fino a 195 ° C, mantenuta per 40 minuti, seguita da una seconda aumento di 10 ° C / min fino a 240 ° C, e mantenere per 10 min. Una modalità pressione costante (29 psi) viene scelto. Elio o idrogeno può essere utilizzato come gas di trasporto. Esteri metilici vengono identificati per confronto con i tempi di ritenzione dei campioni autentici. Figura 10 mostra l'analisi GC rappresentativo di FAME ottenuta da plasma esteri del colesterolo.

5. Sintesi di (5'R) - e (5'S) -5 ',8-ciclo-2'-deossiadenosina

1. Sciogliere 33 mg di 8-bromo-2'-deossiadenosina (8-Br-Dado) in acetonitrile (100 ml) in modo da raggiungere una concentrazione di 1 mM. Regolare il flusso di gas (Ar o N2) nel fotoreattore e riempire l'appaRatus con la soluzione di 8-Br-Dado.
2. Preparare un setto con la dimensione appropriata per l'ingresso del fotoreattore e passare un ago connesso alla linea di gas inerte attraverso il centro di esso. Chiudere il sistema con il setto. Lavare il gas inerte per 30 min.
3. Irradiate dalla luce UV utilizzando un 125W media pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 15 min, raccogliere la soluzione in 250 ml pallone. Lavare il fotoreattore con 10 ml di acetonitrile e raccogliere lavaggio nel matraccio stesso.
4. Estinguere la miscela grezza di reazione con 1 M NH ₄ OH soluzione e si evapora il solvente nel evaporatore rotante.
5. Eseguire l'analisi cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC-UV) con la colonna analitica (vedi sezione strumenti) in condizioni note, e confrontare il profilo con composti di riferimento.
6. Eseguire liquida ad alte prestazioni analisi cromatografica (HPLC-UV) con una colonna analitica (vedere sezione strumentazione) utilizzando la seguente solsfiati e gradienti: 2 mM ammonio formiato come solvente A e acetonitrile come solvente B. Impostare la portata di 1 ml / min e il gradiente da 0% solvente B al 0,3% di solvente B da raggiungere in 2,2 min. Poi B 0,8% solvente in in 4,0 min, quindi B 1% solvente in 4.8 min. Restare a 1% B solvente per 9 min e poi andare a 8% solvente B in 6 minuti. Dopo andare a 10% di solvente B in 4 min e il 30% di solvente B in 5 min e rimangono al 30% b solvente per altri 5 min. Raccogliere i picchi cromatografici corrispondenti ai due prodotti diastereomerici in due fiale diverse.
7. Misurare l'assorbanza delle due frazioni raccolte nello spettrofotometro UV e calcolare la concentrazione esatta in base al Lamber-Beer legge (A = εlC, dove A è l'assorbanza, ε il coefficiente di estinzione e L la lunghezza della cella). Utilizzare il ε coefficiente di estinzione del 2'-deossiadenosina (Dado) (15400 M ^-1 cm ^-1 a 260 nm).

6. Sintesi di (5'R) - und (5'S) -5 ',8-ciclo-2'-deossiguanosina

1. Sciogliere 35 mg di 8-bromo-2'-deossiguanosina (8-Br-dGuo) e 30 mg di ioduro di sodio (NaI) in acqua distillata (100 ml) in modo da raggiungere la concentrazione 1 mM e 2 mM, rispettivamente. Regolano gas inerte (Ar o N ₂₎ collegato al flusso fotoreattore e riempire il fotoreattore con la soluzione di reazione.
2. Degassare la miscela di reazione come descritto nella procedura 5 (punto b).
3. Irradiate dalla luce UV utilizzando un 125W media pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 30 min, raccogliere la soluzione in 250 ml pallone. Lavare la fotoreattore con 10 ml di acqua e raccogliere lavaggio nel matraccio stessa.
4. Estinguere la miscela grezza di reazione con 1 M NH ₄ OH soluzione e si evapora il solvente sotto vuoto.
5. Eseguire l'analisi come descritto nella Procedura 5 (passi da E a g). Utilizzare il ε coefficiente di estinzione della 2'-deossiguanosina (dGuo) (11.700 m ^-1 cm ^-1 a 260 nm).

7. Sintesi di isotopica Purina etichetta (5'R) - e (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. Preparare 2 ml di soluzione acquosa 1 mM (acqua distillata) dei ¹⁵ N isotopica nucleosidi purinici etichettati ([15N ^5] Dado o [15N ^5] dGuo) in una fiala di vetro (4 ml) con un coperchio a diaframma.
2. Collegare il flacone con il coperchio a diaframma e collegare alla linea gas (N ₂ O per saturazione della soluzione) attraverso un ago nel setto che raggiunge il fondo della fiala. Un'altra ago corto nel coperchio a diaframma funziona come l'uscita del gas.
3. Lavare la soluzione con N ₂ O per 30 min. Il flusso di gas è regolata per essere molto bassa.
4. L'ago uscita viene prima tolto e dopo 1 'quella lunga segue, in modo da avere una piccola pressione all'interno del flacone.
5. Mettere la soluzione in un apparecchio di radiolisi gamma per 8 ore (calcolo sulla base di una dose tasso ca. 4,5 Gy / min).
6. Dopo la reazione placare la grezzo con 1 M NH ₄ OH soluzione.
7. Eseguire l'analisi cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC-UV) in condizioni note, ⁶ e confrontare il cromatogramma con i riferimenti standard.

8. Radiolisi gamma di soluzioni acquose di DNA

1. Preparare 1 ml di 0,5 mg / ml di soluzione (acqua distillata) del DNA di timo di vitello e messo in una fiala di vetro (2 ml) con un coperchio a diaframma.
2. Degassare la reazione come descritto nella procedura 7 (fasi bd).
3. Mettere la soluzione in un apparecchio di radiolisi gamma per 30 minuti (calcolo sulla base di dose / velocità di ca. 4,5 Gy / min).

9. La digestione enzimatica del DNA

1. Ad un tubo Eppendorf contenente 80 pg di DNA, aggiungere 8 U di nucleasi P1, 0,01 U di fosfodiesterasi II, 20 nmol di EHNA in 20 pl di 300 mM acetato di sodio (pH 5,6) e 10 mM di cloruro di zinco. Incubare la miscela a 37 ° C per 48 ore.
2. Successivamente aggiungere una miscela di 8 U di fosfatasi alcalina, 0,02 U di phosphodiesterase I, in 40 ml di 0,5 M Tris-HCl (pH 8,9) a digestione miscela. Il campione viene incubato a 37 ° C per 2 h.
3. La miscela viene neutralizzata per aggiunta di 10% di acido formico.
4. Trasferire il campione in un Ultra-0.5 Amicon dispositivo centrifugo filtro (cutoff 3 kDa), aggiungere 200 ml di tridistilled H ₂ O. Posizionare il Ultra-filtro nel rotore di centrifuga a 14000 xg per 15 min. Quindi separare il dispositivo Ultra filtro dalla provetta. Liofilizzare l'enzima senza soluzione nella provetta.

10. DNA desalinizzazione campioni prima dell'analisi

1. Eseguire liquida ad alte prestazioni di analisi cromatografica (HPLC-UV) con la colonna analitica (vedere la sezione strumentazione) a seguito di condizioni note ^6.
2. Sciogliere il DNA digerito liofilizzato in 20 ml di H ₂ O e iniettare in HPLC-UV.
3. Raccogliere il campione in un flaconcino dopo l'eluizione sale (primi minuti) e appena prima del tim eluizionee del nucleoside primo (5'R-cdGuo), fino alla fine del programma cromatografico.
4. Il campione viene liofilizzato e resolubilized in 20 microlitri di acqua.

11. LC-MS/MS analisi quantitativa

1. Preparare i HPLC-MS/MS (triplo quadrupolo) prima di iniziare l'analisi caricando il metodo analitico e il metodo per il rivelatore MS (ESI). ⁶
2. Aggiungere 1 ml della miscela isotopica etichettato composti nel campione preparato in Procedura 7.
3. Iniettare 20 pl della soluzione spiked DNA digerito in acqua distillata.
4. I dati cromatografici ottenuti sono elaborati sulla base della precedente taratura con composti di riferimento. Una HPLC rappresentante eseguire contenente adenosina e guanosina 2'-deoxyribonucleosides e loro derivati ​​ossidativi e cicloolefine è mostrato in Figura 11.

Risultati

Il processo di isomerizzazione è stato descritto in particolare esteri del colesterolo, che offrano le mono-trans isomeri di acidi linoleico e arachidonico mostrati in Figura 1 come i primi prodotti di questo attacco, che possono verificarsi in condizioni di stress radicalico libero nell'ambiente biologico. ⁵

In figura 3 il meccanismo chimico coinvolto nel cis-trans isomerizzazione doppio legame è mostrato. La fonte radicale è indicata in modo generico di permettersi S-radicali centrati. Nei protocolli descritti la fonte radicale è luce UV che è in grado di rompere homolitically presente SH legame nella molecola RSH tiolo.

Figura 4 riassume il protocollo tre fasi per la sintesi della classe lipidi modificati e loro rilevamento nel plasma umano: la sintesi rappresenta un processo biomimetico radicali liberi e fornisce anche un one-pot voce conveniente alla GEOMETisomeri mochimico, senza alcuna contaminazione da parte di isomeri di posizione seguita da protocolli di purificazione e isolamento.

Diverse metodologie analitiche possono essere applicate per un rilevamento ad alta sensibilità del contenuto isomero trans e caratterizzazione del mono-trans biblioteca esteri del colesterolo. In particolare, spettroscopia Raman può essere effettuata direttamente sulla frazione esteri del colesterolo senza derivatizzazione (vedere la Figura 2 e la Figura 9).

Il secondo esempio riguarda purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides, quali lesioni del DNA creati dall'attacco dei radicali liberi alla posizione C5 'del residuo di zucchero e successiva formazione di un legame covalente tra lo zucchero e la base frazioni. Quattro strutture possono essere prodotti, cioè, 5 ',8-ciclo-2'-deossiadenosina e 5 ',8-ciclo-2'-deossiguanosina, sia esistenti nelle 5'R e 5'S forme diastereomeriche (Figura 5). In figura 6 tmeccanismo di reazione si è mostrato, che coinvolge fotolisi di 8-bromopurine derivati ​​da 5 a dare i corrispondenti C8 radicale 6, che astrae intramolecularly un atomo di idrogeno dalla posizione del C5 'selettivo che offrano le 2'-deoxyadenosin-5'-il radicale 7. 7 radicale subisce ciclizzazione con una velocità costante nell'intervallo 10 ⁵ -10 ⁶ s ^{-1, 2} seguito da ossidazione del radicale eteroaromatico 8 per dare i prodotti finali ^9. La reazione dei radicali idrossilici, generato da radiolisi dell'acqua, con 2'-deossiadenosina e 2'-deossiguanosina (10) è stata riscontrata ca. 10% per astrazione di idrogeno dalla posizione C5 ^'7.

Il nostro approccio biologia chimica per le biblioteche di purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides (compresi composti marcati) è illustrato in figura 7, con l'identificazione di queste lesioni in oligonucleotidi come pure in campioni di DNA ottenuti da various fonti quali, ad esempio, trattate in condizioni di radiazioni ionizzanti, come simulare delle condizioni di stress radicali.

In figura 8 una apparecchiatura fotoreattore tipico è mostrato. Il dispositivo permette di irradiazione dei composti disciolti nel solvente appropriato. È costituita da: i) la camera di reazione equipaggiato con l'ingresso per il gas inerte (in basso) e due ingressi per l'uscita del gas e per l'aggiunta dei reagenti; ii) una camera interna contenente la lampada a mercurio appropriata collegato ad un sistema di raffreddamento e di energia elettrica, che è inserito nella camera di reazione tramite un giunto di vetro.

Figura 1. Mono-trans isomeri di linoleato colesterolo e arachidonico.

Figura 2. Esteri del colesterolo nel siero umano, di analisi e diretto per la mono-trans isomeri mediante spettroscopia Raman.

Figura 3. L'aggiunta-eliminazione processo che porta al cis-trans isomerizzazione di doppi legami da radicali thiyl.

Figura 4. Tre passi protocollo per lo sviluppo di mono-trans esteri del colesterolo come biomarker di libero stress radicalico.

Figura 5. I quattro purine 5 ',8-ciclo-2'-deossiribonucleosidi diastereoisomeri. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Generazione di C5 'radicali, sia per fotolisi di 5 o per reazione di 10 con i radicali HO •, e il meccanismo di purine 5' ,8-ciclo-2 'la formazione di deossiribonucleoside. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. Protocollo fo l'identificazione di alcuni radicali a base di lesioni del DNA; mtDNA: DNA mitocondriale, nDNA: DNA nucleare.

Figura 8. Reattore fotochimico.

Figura 9. Rappresentante spettro Raman del plasma colesteril estere. Nel riquadro confronto di una regione specifica di colesteril linoleato e colesteril mono-trans isomeri dell'acido linoleico.

Figura 10. Rappresentante analisi GC di FAME ottenuto da plasma esteri del colesterolo.

Figura 11. Rappresentante HPLC eseguire contenente 2'-deossiadenosina e 2'deoxyguanosine insieme alla loro ossidativo e delle purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribo nucleosidi. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussione

La conversione di natura cis acidi grassi insaturi a trans isomeri geometrici è una trasformazione connessa con la produzione di stress radicalico nell'ambiente biologico. Lipidi di membrana delle cellule, che contengono acidi grassi, sono un obiettivo rilevante biologico per stress radicalico e abbiamo prima studiato il endogeno cis-trans isomerizzazione fosfolipidi in colture cellulari, animali ed esseri umani valutando protocolli analitici in ogni caso. ^8-10 Abbiamo dimostrato che questa trasformazione può avvenire da una varietà di composti contenenti S, incluse tioli, tioeteri e disolfuri, che in diverse condizioni di stress radicali sono in grado di generare radicali thiyl, cioè l'agente isomerizzante (Figura 3). L'esempio illustrato in questo articolo si concentra sulla classe di esteri del colesterolo, che rappresentano un noto frazione di lipidi plasmatici, strettamente coinvolto nel metabolismo delle lipoproteine. Il legame estere tra acidi grassi e cholesterol è biosynthesized dal trasferimento di acidi grassi dalla posizione 2 della frazione di glicerolo di fosfatidilcolina di colesterolo, un passo catalizzata dalla acile enzima colesterolo lecitina transferasi (LCAT). Pertanto, plasma esteri del colesterolo sono strettamente connesse con fatturato membrana di lipidi, e contengono percentuali piuttosto elevate di acidi grassi polinsaturi (PUFA) tipicamente presenti in fosfatidilcoline, linoleico e acidi arachidonico cioè. Formazione lipoproteina è coinvolto in malattie cardiovascolari e metaboliche. La reattività di esteri del colesterolo naturali con radicali liberi possono verificarsi i doppi legami di linoleato e residui arachidonico, che possono essere trasformati nei corrispondenti isomeri trans geometrici (vedi Figura 1 per le strutture). Caratterizzazione del contenuto di trans esteri del colesterolo nei campioni biologici è interessante per lo sviluppo di biomarker. Una metodologia indiretta consiste nella trasformazione di cholesteryesteri l isolato dal plasma ai corrispondenti esteri di acidi grassi (FAME metile) e la separazione mediante protocolli gascromatografiche. In questo caso, la calibrazione dei riferimenti standard di cis e trans esteri metilici degli acidi viene eseguita, per consentire la quantificazione del contenuto di trans nei campioni. Sulla base degli studi analitici effettuati sulla libreria esteri del colesterolo, si propone di applicare anche un metodo basato sulla spettroscopia Raman, che può essere effettuata direttamente sulla frazione esteri del colesterolo isolata da plasma, senza ulteriore derivatizzazione al FAME corrispondente (vedi figure 2 e 9). Vale la pena notare che fino ad ora non sono descritti metodi efficaci per cis separato e isomeri trans di acidi grassi contenenti lipidi mediante HPLC, come invece descritto da idroperossidi esteri del colesterolo. Finora, il metodo indiretto gascromatografico è ancora il metodo migliore finora disponibili. Con questo metodo il primo quantitativo valuzione del mono-trans contenuti derivati ​​da esteri del colesterolo isolate dal plasma di soggetti sani è stato fornito. Utilizzo Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) il limite di rilevabilità è soddisfacente (ppb) e quantità nanomolari dei composti sono stati rilevati. ^5. Con i sistemi di rilevazione diverse questo limite può essere anche abbassato. L'effetto delle radiazioni ionizzanti sulla esteri del colesterolo è questione di ulteriori studi, se una risposta lineare si ottiene rispetto alla dose applicata.

Come secondo esempio, abbiamo scelto nucleosidi modificati che possono essere prodotti da danni dei radicali liberi del DNA. Radicali idrossilici (HO •) sono noti per essere la specie più nocive reattive dell'ossigeno (ROS) per la loro capacità di causare modificazioni chimiche di DNA. Lesioni singole o multiple possono verificarsi su DNA, che in cellule eucariotiche si trova nel nucleo e mitocondri. Identificazione e misura delle principali classi di danni ossidativi al DNA generati richiedere la appropriate librerie molecolari, al fine di impostare i protocolli analitici. Abbiamo focalizzato il nostro interesse sulle lesioni più piccole tandem, che sono purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides, avente un legame covalente ulteriore tra la base e le frazioni di zucchero creati dall'attacco dei radicali liberi. I composti sono 5 ',8-ciclo-2'-deossiadenosina e 5 ',8-ciclo-2'-deossiguanosina esistente nelle 5'R e 5'S forme diastereomeriche (Figura 5). Il loro potenziale per diventare liberi marcatore stress radicalico è materia di ricerca fondamentale. ² Infatti, quando il DNA è esposto a HO • astrazione radicale idrogeno dalla posizione C5 'dello zucchero è uno dei possibili eventi che portano alla formazione di queste lesioni tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides può essere misurata come somma di diastereomeri da HPLC-MS/MS digeriti enzimaticamente in γ-irradiati campioni di DNA variabili 1-12 lesioni / 10 ⁶ / nucleosidi Gy andando assenza forma di ossigeno a livello fisiologico di ossigeno Iotessuti n, il rapporto diastereomerico 5'R / 5'S essendo ~ ~ 4 e 3 per 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo, rispettivamente (Figura 11). ¹¹ Si noti che la relazione tra dose di radiazioni e 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdAdo lesioni rilevate nel DNA cellulare è lungi dall'essere compreso. Il singolo esperimento sulla base dell'irradiazione 2kGy riportati nella sperimentale non possono essere considerati conclusivi. ¹¹ Ulteriori esperimenti di questo tipo e quantificazione analitica delle quattro lesioni sono necessari per definire tale rapporto. Il rilevamento di queste lesioni e le trasformazioni più popolari ossidativi (come 8-oxo-2'-deossiguanosina, 8-oxodGuo) sono materia di intense evidenziando l'importanza di entrambe le lesioni durante il metabolismo ossidativo. ^6,13 L'utilizzo di HPLC -MS/MS (triplo quadrupolo) ha un limite di rivelazione assieme a 30fmol per tutte e quattro le lesioni. Ultimi miglioramenti sono richiesti per raggiungere limiti di rilevazione dei livelli attomol dallo strumento produttoritori. Sulla base della letteratura molto recente, ⁶ procedure analitiche dover includere la pulizia corretta del campione e di arricchimento per soddisfare i limiti di rivelazione del MS / MS / MS (ion trap) o del MS / MS (triplo quadrupolo) utilizzati nel nostro caso.

Procedure di sintesi bio-ispirati di composti 1-4 sono stati sviluppati a partire da 8-bromopurine strumenti derivati ​​di cui o fotolisi. ^7,12 Queste procedure comportano una reazione radicalica a cascata che imita il meccanismo di danno al DNA di formazione di 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo lesioni. Da prospettive biologiche, è stato trovato che queste lesioni si accumulano con l'invecchiamento in un tessuto-specifica (fegato> rene cervello>), dimostrando che i meccanismi di riparazione del DNA sono inadeguati per conservare il materiale genetico di queste lesioni. ¹³ Infatti, nucleotide excision repair (NER) è l'unica via attualmente individuate per la riparazione di queste lesioni. ²

I due classees di composti mostrato nelle figure 1 e 5 non sono commercialmente disponibili al momento, tuttavia dalle strategie sintetiche descritte in letteratura non sarebbe difficile preparare questi composti per uso commerciale.

L'approccio multidisciplinare è fornito da studi di biologia chimica non solo ha un valore enorme per l'identificazione di nuovi meccanismi che si verificano in ambiente biologico, ma dà anche un contributo fondamentale alla scoperta di biomarcatori e la diagnostica, in ultima analisi, portare novità nella cura della salute e le strategie di prevenzione. ¹⁴ Il contributo chimica è necessaria per uno sviluppo positivo della medicina molecolare, la creazione di piattaforme integrate e pannelli per profili metabolici che si prevede di consentire una razionalizzazione ottimale di progettazione dell'intervento, sia terapeutico e nutrizionale, riducendo le incertezze e gli errori quando possono essere prevedibili.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517