Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

Riepilogo

Descriviamo un metodo altamente riproducibile per l'occlusione permanente di un roditore grande vaso sanguigno cerebrale. Questa tecnica può essere realizzato con pochissima danni periferici, minima perdita di sangue, un elevato tasso di sopravvivenza a lungo termine, e volume dell'infarto coerente commisurato alla popolazione clinica umana.

Abstract

L'ictus è una delle principali cause di morte, invalidità, e la perdita di socio-economici in tutto il mondo. La maggioranza di tutti i colpi risultare da un'interruzione nel flusso sanguigno (ischemia) ^1. Dell'arteria cerebrale media (MCA) offre una grande maggioranza di sangue alla superficie laterale della corteccia ^2, è il sito più comune di ictus ³ umano, e ischemia nel suo territorio può causare un'estesa erettile o morte ^1,4,5. I sopravvissuti di ictus ischemico spesso soffrono di perdita o rottura delle capacità motorie, deficit sensoriali, e infarto. Nel tentativo di catturare queste caratteristiche chiave della corsa, e in tal modo sviluppare un trattamento efficace, molta enfasi è posta su modelli animali di ischemia in MCA.

Qui vi presentiamo un metodo di occludere in modo permanente un vaso sanguigno corticale superficiale. Saremo presenti con questo metodo con un esempio di un rilevante occlusione nave che modella il tipo più comune, la posizione e outcome di ictus umana, occlusione dell'arteria cerebrale permanente (pMCAO). In questo modello, abbiamo chirurgicamente esponiamo MCA nel ratto adulto e successivamente occludere con doppia legatura e resezione del vaso. Questo pMCAO blocca il ramo corticale prossimale MCA, causando ischemia in tutti MCA territorio corticale, una grande porzione della corteccia. Questo metodo di occlusione può essere utilizzato anche per occludere porzioni più distali dei vasi corticali per conseguire ischemia focale più mira una regione più piccola di corteccia. Gli svantaggi principali di pMCAO sono che la procedura chirurgica è alquanto invasiva poiché è richiesta una piccola craniotomia per accedere MCA, sebbene questo provoca danni tissutali minimi. I vantaggi principali di questo modello, tuttavia, sono: il sito di occlusione è ben definita, il grado di riduzione del flusso sanguigno è coerente, funzionale e compromissione neurologica avviene rapidamente, dimensioni dell'infarto è coerente, e l'elevato tasso di sopravvivenza a lungo permette valutazione cronica termine.

Introduzione

Al fine di indurre condizioni di ischemia che imitano efficacemente ictus ischemico umano, vari modelli ictus animali sono ampiamente utilizzati, con diversi volumi di infarto risultanti. Nel modello photothrombotic, il cervello viene irradiato attraverso il cranio intatto utilizzando illuminazione laser dopo l'iniezione endovenosa di una sostanza fotosensibile (come rosa bengala), con conseguente coagulazione fotochimica, ostruzione dei vasi irradiati, ischemia e nel tessuto circostante ^{6, 7.} Photothrombosis può portare a molto piccole, le regioni isolate di infarto ed è tipicamente utilizzato come mezzo di modellazione "mini-ictus", o "micro-ictus".

La tecnica più ampiamente adottato per indurre ictus ischemico, in particolare in arteria cerebrale media (MCA), è il modello monofilo intraluminale ^8, in cui un filamento viene chirurgicamente introdotto nella carotide esterna e avanzare finché la punta occlude la base del MCA. A primary sfida del filamento intraluminale occlusione è l'alto tasso di mortalità (70% quando MCA è occluso per 3 ore, un punto di tempo rilevante per la ricerca ictus) ^9. Altri problemi con il metodo inclusa possibile emorragia subaracnoidea, occlusione incompleta, e il volume dell'infarto variabile ^10,11. Risultati di questo modello in un ampio grado di infarto sia nella corteccia e subcortically ^12, e modelli di una massiccia corsa umana.

Sebbene i modelli ictus sia micro e massiccia sono importanti, tratti umani sono in genere da qualche parte nel mezzo. In ampi studi clinici, varia infarto ictus nel formato 28-80 cm ^3, che si traduce in 4,5-14% della IPSI ishemic emisfero ^9. In confronto, il nostro ratto pMCAO infarto dimensione varia da circa 9-35 mm ^3, che costituisce il 3-12% dell'emisfero IPSI ishemic. Il nostro modello pMCAO, quindi, ricorda da vicino i volumi infarto ictus ischemico umani per percentuale del cervellovolume.

Oltre alla modellazione del danno strutturale di ictus, risultati pMCAO in deficit funzionali e comportamentali simili alla condizione umana. Come minimo, un modello efficace dei risultati della corsa in deficit di movimento controlaterale a danno del colpo ^13-15, perdita o distruzione di funzione motoria e sensoriale ^16,17, perdita o interruzione di attività neuronale evocata ^16,18, riduzioni del flusso sanguigno cerebrale ^{19, 20,} e di infarto ^21,22. Di conseguenza, i nostri modelli pMCAO una grave occlusione della MCA con conseguente disabilità fisica, perdita di funzione all'interno della corteccia sensoriale (e cortecce limitrofi), interruzione di attività neuronale, una grave riduzione della MCA flusso di sangue, e gli attributi infarto-segno distintivo di ictus ischemico ^{23 -25,} quindi servire come un modello efficace di ictus umana.

Procedurale, pMCAO coinvolge una piccola craniotomia in cui togliamo accuratamente il cranio e la dura madre dalun 2 x 2 mm "finestra chirurgica" sopra il segmento iniziale (M1) di MCA, appena prima della biforcazione primaria di MCA nei rami corticali anteriori e posteriori (Figure 1A e 1B). Passiamo una mezza curva inversa taglio sutura ago e filo (6-0 seta) attraverso lo strato piale delle meningi, sotto MCA e al di sopra della superficie corticale (vedi Tabella di reagenti e attrezzature specifiche per le forniture chirurgiche necessarie per effettuare pMCAO ). Abbiamo poi legare una doppia legatura, serrare le due nodi intorno MCA, e transetto la nave tra i due nodi. La doppia legatura e recisione attraverso M1 si verifica appena distale al lenticulostriate ramificazione, in modo che solo i rami corticali del MCA sono colpiti-quindi solo infarto corticale (nessun danno sottocorticale) avviene ^26,27 (Figura 2). Anche se ictus umano coinvolge spesso infarto sottocorticale, modellare questo nei roditori richiede una maggiore invasività (occludere vasi cerebrali prima corticale Branching richiede arterie di accesso attraverso l'arteria carotide nel collo e richiede occlusioni supplementari) nella tecnica e una maggiore variabilità nella dimensione dell'infarto. Il modello qui descritto non può essere eseguita più prossimale, come l'accesso ai rami precedenti di MCA non è possibile tramite una semplice craniotomia. Mentre può essere chirurgicamente possibile indurre un infarto sottocorticale via pMCAO, occlusione comporterebbe una procedura estremamente invasiva e pertanto non ideale.

Efficacia di occlusione può essere confermata tramite laser Doppler, o laser speckle di imaging ^12,24,25 (figura 3), o istologicamente post mortem (Figura 2). Va notato che la ricerca precedente ha dimostrato che la stimolazione sensoriale può svolgere un ruolo importante nell'evoluzione e l'esito di infarto; conferimento della protezione da danni quando somministrato entro 2 ore di pMCAO e causando un aumento dei danni ictus quando somministrato a 3 ore dopo pMCAO ^24,25,28. Abbiamo confermato che a 5 ore di post-pMCAO, la stimolazione non ha più un effetto sul risultato (dati non pubblicati). Pertanto, la stimolazione sensoriale dei soggetti deve essere ridotto al minimo per 5 ore dopo pMCAO di ottenere volumi di infarto con variabilità minima. Di conseguenza, il nostro gruppo gestisce "controlli non trattati" di questo tipo, mantenendo i ratti anestetizzati per 5 ore post-pMCAO, al buio, con la stimolazione sensoriale minimale, ed espressamente nessuno stimolo soffio.

Va inoltre osservato che la variazione occasionale nella struttura MCA, comprendente un'eccessiva ramificazione, più segmenti primari, o l'assenza di arterie comunicanti può verificarsi ad una frequenza di 10 a 30% in maschi adulti Sprague Dawley ^29,30. Se si osservano anomalie nei MCA, si consiglia di non utilizzare quel particolare argomento, come l'aggiunta di animali con tali anomalie vascolari aumenta la variabilità infarto.

Inoltre, ci sono diversi aspetti pratici di oprocedura di ur che rendono questo metodo occlusione vantaggioso per le indagini ictus. Prima, suture possono essere collocati intorno all'arteria ma non serrati per raccogliere una valutazione di base, seguita da valutazione post-ischemica dopo legatura e recisione. In questo modo, la preparazione chirurgica necessaria per l'occlusione sia effettivamente controllato per, entro soggetti. Perché soggetti potrebbero rimangono stazionari oa una telaio stereotassico tutta occlusione, è possibile condurre la valutazione sperimentale di ciascun soggetto prima, durante, e dopo occlusione senza spostare il soggetto o disturbare qualsiasi apparecchiatura sperimentale in uso ^25,28. Inoltre, questa procedura si traduce in un tasso di mortalità molto basso, anche in soggetti di età compresa tra roditori 21-24 mesi di età (equivalente ad un uomo anziano) ^31, e possono quindi essere utilizzati per valutare i trattamenti ictus nei ratti che più da vicino modellare il più comune fascia di età dei malati di ictus ^25,28. Vessel transection serve anche diversi scopi pratici. L'assenza di sanguinamento dopo resezione conferma che la nave è stata completamente occlusa in entrambi i siti di legatura. Ulteriormente, transezione assicura una perturbazione permanente del flusso sanguigno. Infine, transezione assicura che qualsiasi flusso di sangue rilevata nelle porzioni distali del vaso occluso deve provenire da una sorgente alternativa.

Infine, anche se non specificatamente descritto questa tecnica di occlusione per MCA in questo manoscritto e video, la stessa doppia tecnica di resezione legatura può essere applicato a qualsiasi nave cerebrale che si può accedere tramite craniotomia. Nostro laboratorio, per esempio, utilizzata pMCAO in combinazione con più occlusioni permanenti aggiuntivi di rami distali MCA al fine di bloccare sia primaria, e collaterali flusso di sangue ²⁴ in una maniera simile alle tecniche di intese a indurre selettivamente ischemia all'interno della corteccia somatosensoriale primaria ^32.

In conclusione, til suo metodo per occlusione permanente applicato alla MCA da vicino i modelli tre aspetti principali di ictus ischemico umana: la posizione più comune (MCA), tipo (ischemia), e il grado di danno (infarto) associato con la letteratura clinica umana di ictus. Inoltre, questo metodo di occlusione può essere applicato a siti occlusione singole o multiple in tutto il cervello, e può essere condotto in soggetti anziani con un alto tasso di sopravvivenza. Data la natura dinamica, permanente, e relativamente non invasiva di questa occlusione, questa tecnica rappresenta un ulteriore strumento per i ricercatori pre-clinici che valutano nuovi approcci per la protezione e il trattamento di ictus.

Protocollo

1. Per iniziare: Strumenti chirurgici richiesti

Vedere la Figura 4

1. Trapano dentale (Kavo Dental Equipment, Modello: UMXL-TM), 2-bit trapano, trapano e 3 bit
2. Aghi ipodermici Due ~ 30 gauge
3. Seghettato pinzette, curvo punta opzionale (può essere utile ma non essenziale)
4. Due belle pinzette punta
5. tronchesi
6. Filo di sutura
7. Micro forbici

2. Creazione della finestra chirurgica

1. Anestesia: Le procedure sono in conformità con le linee guida NIH e sono stati approvati da UC Irvine cura degli animali e del Comitato Usa. Soggetti sperimentali sono 295-400 g maschi Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) e la seguente procedura di anestesia dovrebbe essere utilizzata:
   1. Iniettare ratto per via intraperitoneale con un bolo di pentobarbital di sodio (55 mg / kg di peso corporeo), seguita da una iniezione intramuscolare di atropina (0,05 mg / kg, peso corporeo) in hind gamba, e amministrato 3.0 cc di destrosio al 5% in acqua per via sottocutanea.
   2. Supplemento di sodio pentobarbital (27,5 mg / kg di peso corporeo), iniezioni, se necessario. Somministrare un antibiotico pomata oftalmica per gli occhi per proteggere le cornee durante le seguenti procedure. Somministrare 5% di destrosio (3 ml) e atropina (0,05 mg / kg, peso corporeo) ogni sei ore diminuiscono le secrezioni respiratorie durante l'anestesia. Misura di temperatura corporea tramite una sonda rettale, e mantenere la temperatura corporea a 37 ° C da una coperta termica autoregolante.
2. Individuare il MCA mediante:
   1. Diradamento a 2 x 2 mm di imaging / finestra visualizzazione sulla corteccia somatosensoriale utilizzando una dimensione di 3 HP punta finché il cranio è quasi trasparente e poi diradamento alla piena trasparenza utilizzando una dimensione di 2 HP punta. Posizione di MCA può allora essere visto attraverso la finestra e la sua traiettoria prossimale utilizzato per approssimare la posizione del segmento iniziale. MCA generalmente eseguito in diagonale attraverso questofinestra in un rostrale caudale / ventrale alla direzione dorsale (per esempio, a sinistra in basso a destra / in alto durante la visualizzazione emisfero sinistro dal punto di vista del chirurgo). La finestra chirurgico può quindi creata sopra dove l'osservatore stima il segmento M1 (prossimale alla corticale ramificazione) per essere collocata sulla base dei rami distali visibili attraverso la prima finestra. Per minimizzare la quantità di cranio che viene rimossa per poter accedere alla MCA, la finestra / visualizzazione immagini deve essere posizionato vicino a, ma separata dalla finestra chirurgica.
      Oppure
   2. Una piccola finestra chirurgico dovrebbe essere posizionata circa 3 mm anteriore e di 1 mm lateralmente al foro ovale o il nervo mandibolare, vicino al rostro arco ^30,33,34. Per accedere efficacemente stelo della MCA (noto anche come il segmento M1), il muscolo temporale è temporaneamente riflessa dalla superficie del cranio. (Nota: In caso di interventi chirurgici di sopravvivenza a lungo termine, l'esperienza del nostro laboratorio è stato that, consentendo il muscolo temporale di rimanere attaccato al suo ancoraggio, il muscolo si ri-temprare alla superficie del cranio, permettendo un comportamento alimentare salutare ed efficace manutenzione del peso corporeo.
3. Seguire MCA al rostrale, angolo ventrale della finestra di imaging (se si usa questo come riferimento) per stimare dove suo ramo corticale iniziale risiede.
4. Creare una nuova regione sottile cranio (ci riferiamo a questo come alla finestra chirurgica) leggermente rostrale e ventrale alla finestra di imaging (se si utilizza questo come riferimento) in cui il segmento M1 (pre-corticale ramificazione) di MCA dovrebbe essere. NOTA IMPORTANTE: Lasciare circa 2 mm di spazio tra la finestra di imaging (se si utilizza questo come riferimento) e la finestra chirurgico.
5. Individuare il gambo del MCA (noto anche come il segmento M1) appena prima corticale ramificazione dell'arteria come illustrato nelle Figure 1A e 1B.
6. Utilizzando un formato HP-3 punta, sottile il teschio sopra la posizione del segmento M1 stimato. Quando l'cranio diventa un po 'trasparente, passare alla dimensione più delicato po' HP-2 trapano e sottile il cranio fino a quando non è completamente trasparente. Confermare visivamente come area chirurgica finestra diventa abbastanza sottile per visualizzare vascolare, e valutare la posizione di M1 a questo punto e completare la finestra in modo che vi sia 2-3 mm su ciascun lato della lunghezza del segmento M1 (questo permette stanza per inserimento e l'uscita del ago di sutura su ciascun lato della MCA).

NOTA IMPORTANTE: Fermare diradamento quando lo spessore del cranio è simile a quella della pellicola trasparente. Il vaso si romperà se il trapano sfonda il cranio e la dura madre. Se il cranio non è abbastanza sottile dall'altro, rimuovendolo per l'occlusione sarà difficile e può causare danni alla corteccia o arteria.

7. Prendete un 30 gauge (30 G) ago ipodermico e piegare la punta di un ago, utilizzando seghettato pinzette.
8. Utilizzare l'ago da 30 G per forare la cura craniocompletamente in una zona non direttamente sopra un'arteria. Utilizzare questo foro di puntura per consentire pinzette per afferrare cranio e rimuovere con attenzione la zona assottigliata della finestra chirurgico.
9. Prendere un nuovo bisogno 30 G, piegare la punta come al punto 6, e rimuovere con attenzione la dura.

NOTA: Taglio della dura lo farà a staccare e MCA diventerà più prominente, a seguito della pressione ridotta.

3. Occludere la MCA

1. Utilizzare tronchesi per tagliare una mezza curva di inversione taglio sutura ago (turno 3/8, 16 millimetri ago di sutura) fino a circa 3-5 mm.
2. Infilare l'ago di sutura rifilato come mostrato nella foto in figura 4E. NOTA IMPORTANTE: E 'importante che l'ago è filettato in modo da entrambe le estremità del filo di sutura sono di lunghezza equivalente. Ciò permette alla trazione di entrambe estremità ottenute sotto M1, allo stesso tempo, l'ago può quindi essere tagliato lasciando liberi due lunghezze di filo per legare i due nodi intorno MCA.
3. Utilizzare il seghettato la pinzetta scivolare l'ago di sutura sotto M1. Inserire con circa 0,5-1 mm di distanza da MCA, rimanendo come superficiale possibile in modo da ridurre al minimo i danni alla corteccia, ma evitando di affaticare troppo MCA pure.
4. Quando l'ago di sutura esce dall'altra parte tale che è sotto MCA, utilizzare una multa pinzetta punta (come mostrato sotto) per tirare la punta dell'ago sutura dal lato opposto, pur continuando ad alimentare o spingere l'altra estremità della sutura ago con la punta seghettata pinzette.
5. Una volta che l'ago di sutura viene completamente passato sotto MCA ed è stato estratto, continuare a tirare la sutura ago o filo finché la lunghezza del filo è uguale su entrambi i lati del MCA. Premendo verso il basso il filo come viene alimentato attraverso in modo da sforzare il MCA può essere utile per prevenire la rottura come il filo passi sotto l'arteria.
6. Tagliare il filo vicino al ago di sutura.
7. Usare entrambe le pinzette punta fine a districare i due fili di sutura risultantes in modo che ci sono due thread indipendenti infilate sotto MCA che non si tocchino. Idealmente i fili saranno di circa 1 mm l'uno dall'altro, dove passano sotto MCA.
8. Usare entrambe le pinzette punta fine per legare due nodi distinti (due legature) con i fili intorno MCA che tentano di sostenere che circa 1 mm di spazio tra i nodi per permettere spazio per transection.

NOTA: Se si desidera un controllo interno sham, preparare l'occlusione lasciando i nodi occlusione sciolti in modo che esse non restringono MCA a tutti e raccogliere dati prima di serrare i nodi e tagliando il vaso. Tagliare il filo per evitare che la cattura su qualsiasi cosa prima di occlusione, ma lasciare abbastanza filo per permettere il serraggio dei nodi più tardi. In questo modo, qualsiasi rappresentazione basale o raccolta dei dati può essere eseguita con tutti della stessa invasione chirurgica dell'occlusione e dei nodi serrati al punto di tempo appropriata con poco ritardo.

9. Una volta che i nodi hanno essereit tirato stretto, utilizzare le forbici micro al transetto M1 tra i due nodi.
10. Nel caso di lungo termine, studi di sopravvivenza:
    1. Sutura incisa cuoio capelluto lembo a posto con filo chirurgico sterile o fissare il tessuto con clip sterili ferita.
    2. Somministrare antibiotici a livello locale per l'area della ferita (come bacitracina unguento) e sistemica tramite iniezione profilattica di ampicillina (150 mg / kg IM).
    3. Mentre il soggetto è ancora anestetizzato somministrare una pomata oftalmica antibiotica per gli occhi.
    4. Somministrare supplementare atropina (0,05 mg / kg IM) per diminuire le secrezioni respiratorie durante l'anestesia.
    5. Iniettare flunixin meglumina (1,1 mg / kg) per via sottocutanea a conclusione della chirurgia e di nuovo la mattina seguente (~ 12 ore dopo) per il controllo del dolore.
    6. Posizionare l'animale su un, caldo, superficie inclinata asciutta in modo che il naso gli animali è sopra la coda sulla pendenza (questo facilita la respirazione fino a quando l'animale è sveglio).
    7. Monitorare l'animale fino a quando è sveglio e muoversi in sicurezza per conto suo.
    8. Una volta che l'animale è tornato in vivaio, l'attività dell'animale, l'aspetto, vocalizzazione, e l'alimentazione e bere comportamento deve essere monitorato quotidianamente.

4. Eutanasia

1. A conclusione di ogni esperimento, ratti vanno eutanasia con sodio pentobarbital (2-3 ml, intraperitoneale).

Risultati

Occlusione di successo di una nave può essere confermata utilizzando laser speckle di imaging (LSI), tra le altre tecniche di imaging del flusso sanguigno. Flusso sanguigno nei principali rami corticali di MCA deve scendere a ~ 25% del valore basale o meno seguente occlusione seconda del livello di rumore nel sistema di registrazione e la sensibilità della tecnica. Vedi Figura 3 per un'immagine rappresentativa LSI di un segmento di un ramo corticale di MCA prima e dopo MCA occlusi...

Discussione

Questo protocollo è stato sviluppato per indurre ischemia all'interno della corteccia roditore, e di farlo con il minimo impatto periferico a soggetti sperimentali. La doppia occlusione e metodo transezione permette la conferma visiva che la nave è stata occlusa modo permanente, e possono essere eseguite senza invasione eccessiva o danni ai tessuti, e con un alto tasso di sopravvivenza. Questo protocollo occlusione può essere applicato a qualsiasi imbarcazione corticale che si può accedere mediante craniotomia p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL