Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Riepilogo

Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.

Abstract

La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all'insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l'uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l'uso di controlli di compensazione adeguati.

Introduzione

Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l'omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c'è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi.

La possibilità di separare la AT adipociti e SVF utilizzando un collagenasi digest seguita da centrifugazione differenziale è stato descritto da Rodbell nel 1964 ^1. Collagenasi II è più spesso utilizzato per la separazione degli adipociti e SVF a causa di manutenzione di adipociti recettori dell'insulina ^1. All'inizio, frazionamento enzimatica di AT è stato principalmente impiegato per studiare adipocyte metabolismo e per isolare preadipocytes. Più recentemente, questa tecnica, combinata con l'ampia disponibilità di citofluorimetri e il numero sempre crescente di anticorpi coniugati fluoroforo disponibili in commercio, ha facilitato la caratterizzazione di AT cellule immunitarie.

Sebbene la presenza di cellule immunitarie nella infiammato AT era stato descritto in precedenza ^2, gli articoli fondamentali per Weisberg et al. e Xu et al. pubblicato nel 2003, furono i primi a documentare l'accumulo di AT macrofagi (ATM) in obesità, che secernono citochine infiammatorie e correlare con AT-specifica e sistemica insulino-resistenza ^3,4. Queste osservazioni hanno fornito la base di un nuovo campo di indagine recentemente coniato, "immunometabolism," ⁵ e sono state seguite da studi che implicano varie popolazioni di cellule immunitarie, comprese le cellule dendritiche ^6, mastociti, cellule T ^{7 8 -}10, cellule B, cellule NKT ^{11 12 13,} eosinofili e neutrofili ^14,15 nello sviluppo dell'obesità associata resistenza all'insulina.

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata della tecnica digest collagenasi utilizzata per isolare le cellule del AT SVF e caratterizzare bancomat e AT cellule T mediante citometria a flusso. Questo protocollo è stato ottimizzato per mouse, tuttavia, gli spettatori possono trarre beneficio dalla lettura di un ottimo articolo che fornisce ampi dettagli sulla ottimizzazione di questa tecnica per l'uomo a ^{16 anni.} I destinatari di questo articolo include investigatori con limitata esperienza di lavoro con il mouse e l'esecuzione di citometria a flusso. Diverse considerazioni pratiche per il bilanciamento resa cellulare e la vitalità con il tempo e le risorse sono presentate così come controlli di citometria a flusso ottimali per la caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie. Oltre al nostro protocollo, i lettori sono referred un recente articolo JoVE da Basu et al. per una eccellente discussione di alcuni aspetti tecnici della citometria a flusso per comprendere adeguati controlli e compensazioni ^17.

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Protocollo

1. Reagenti e accessori per la

Prima di iniziare questo protocollo sperimentale, preparare i seguenti reagenti:

1. 70% di etanolo
2. PBS 1X
3. 1X DPBS (senza Ca e Mg) integrati con 0,5% BSA
4. FACS buffer: 1X DPBS (senza Ca e Mg), 2 mM EDTA, e l'1% FCS
5. Tampone ACK: 150 mM NH ₄ Cl, 10 mM KHCO _3, e 0,1 mM Na ₂ EDTA in acqua

2. Raccolta e Preparazione del tessuto adiposo

1. Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione.
2. Bagnare completamente il pelo con il 70% di etanolo.
3. Fare un'incisione a livello del processo xifoideo (parte inferiore dello sterno) e aprire la cavità toracica per esporre il cuore, facendo attenzione a non recidere le principali vasi sanguigni.

Nota: A questo punto, è anche utile per lasciare il diaframma intatto il piùpossibile e tagliare una tacca dal lato destro della gabbia toracica per permettere al sangue di fluire e perfusato dalla cavità toracica.

4. Agganciare l'atrio destro per permettere al sangue e perfusato per sfuggire al sistema circolatorio.

Nota: Quando si tratta di topi obesi, eccesso pericardico AT può avere bisogno di essere rimosso per consentire l'accesso al cuore.

5. Afferrare il cuore con una pinza e inserire delicatamente un ago nel ventricolo sinistro attraverso l'apice. Perfusione lentamente il mouse con 15 ml di PBS sterile.

Nota: ridurre il tasso di perfusione se i polmoni iniziano a riempirsi ed espandersi.

6. Aprire la cavità peritoneale e rimuovere i cuscinetti di grasso perigonadal con attenzione per evitare eventuali tessuti gonadici.
7. Mettere cuscinetti di grasso in una pesata barca sul ghiaccio contenente 2 ml di 1X DPBS (senza Mg o Ca) integrata con 0,5% BSA, e tritare la AT in pezzi pregiati.

Nota: Limitare la quantità di AT per pesare barca a 1,2 g. Se la quantità di AT supera 1,2 g, dividerlo equamente tra due barche a pesare.

8. Conservare i campioni in ghiaccio e preparare 3 ml di soluzione di collagenasi digest per AT campione costituito da 1X DPBS integrato con 0,5% BSA, 10 mM CaCl _2, e 4 mg / ml di collagenasi di tipo II.

3. Collagenasi Digestione

1. Transfer per provette coniche da 50 ml versando l'omogeneizzato e risciacquo la barca pesare con 1 ml DPBS (0,5% BSA) e 3 ml di soluzione di collagenasi II digest.
2. Incubare a omogeneizzato in uno shaker di rotazione (200 rpm) a 37 ° C per 20 min.
3. Aggiungere 10 ml DPBS (0,5% BSA) per tubi conici e posto sul ghiaccio.
4. Triturare omogeneizzato numerose volte utilizzando una pipetta sierologica 10 ml, e passare sospensioni cellulari attraverso il filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 10 minuti a 4 & dad esempio, C.
6. Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet cellulare in 3 ml di tampone ACK per la lisi degli eritrociti contaminanti.
7. Aggiungere 12 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 10 min a 4 ° C.
8. Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in tampone FACS.

Nota: utilizzare la dimensione del pellet cellulare come guida per quanto tampone FACS per risospendere in Se il pellet cellulare copre il fondo della provetta 50 ml conica, utilizzare 0,5-1 ml tampone FACS, altrimenti, risospendere in 0.25-0.5 ml.

9. I campioni su ghiaccio e preparare 1:10 aliquote di diluizione di ogni campione per il conteggio delle cellule di miscelazione 40 microlitri di buffer FACS, 50 soluzione blu tripano microlitri (0,2%), e 10 microlitri di sospensione cellulare.
10. Contare le cellule vitali sulla base di blu tripano esclusione e diluire sospensioni di cellule ad una concentrazione finale di 5-10 x 10 ⁶ cellule / ml.

4. La colorazione degli antigeni di superficie

1. Aggiungere antitopo CD16/CD32 anticorpo (Fc block) ad una concentrazione finale di 0,5-1 μg/10 ⁶ cellule, e incubare in ghiaccio per 10 min.
2. Campioni di trasferimento (≥ 10 ⁶ cellule) a 12 x 75 mm provette a fondo tondo di polistirolo. Preparare tubi separati se analizzando bancomat e le cellule T, e unire le celle in più per preparare un adeguato numero di tubi per accogliere il risarcimento richiesto e uno (FMO) controlli fluorescenza modificati meno.

Nota: Per fare un esempio, nel quantificare la percentuale di sportelli automatici in base a F4/80 e CD11b, i seguenti compensi e controlli FMO dovrà essere preparato:

- Avviare l'elaborazione (cellule)

- DAPI o ioduro di propidio (PI) macchia singole (cellule, non aggiungono colorante vitalità fino al punto 5.1)

- F4/80 APC (cellule o sfere di compensazione) singoli macchia

- CD11b FITC cellule o singole macchia (sfere di compensazione)

- FMO 1 (celle): Rat IgG2a κ isotipo di controllo APC + CD11b FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1)

- FMO 2 (celle): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotipo di controllo FITC + colorante vitalità (aggiunto a passo 5.1)

3. Aggiungi anticorpi primari fluoroforo-coniugato e / o controlli isotipo alla concentrazione adeguata (vedi Tabella di reagenti e materiali).
4. Proteggere i campioni dalla luce e incubare a 4 ° C per 30 min.
5. Aggiungere 2 ml di tampone FACS sospensione cellulare e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
6. Decantare il surnatante e risospendere SVF pellet di cellule in 2 ml di tampone FACS.
7. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere SVF pellet cellulare in ≥ 400 microlitri di buffer FACS.
8. Trasferire campioni da 12 x 75 mm in polistirolo tubi fondo sferico dotato di un 35 top tube colino cellula micron.
9. Proteggere dalla luce e conservare i campioni a 4 ° C fino al momento dell'analisi FACS.

Nota: Per risultati ottimali cellule devono essere analizzati immeadiately, tuttavia, l'analisi FACS con questo protocollo è stato condotto con successo su cellule marcate memorizzati nel tampone FACS per 1-2 ore a 4 ° C. Se le cellule devono essere fissati per aumentare il tempo di conservazione, cellule marcate possono essere fissate con paraformaldeide al 2% a 4 ° C per 24 ore prima dell'analisi FACS. Aziende anticorpi suggeriscono che le cellule marcate possono essere conservati fino a una settimana, ma questo non è stato testato nel contesto di questa procedura.

5. FACS analisi

1. Prima di analisi FACS, aggiungere colorante vitalità di campioni e controlli adeguati per consentire la discriminazione delle cellule vive / morte.

Nota: Numerose coloranti vitalità sono commercialmente disponibili, ma DAPI e PI sono raccomandati seconda della eccitazione / emissione profiles degli anticorpi fluoroforo-coniugati utilizzati. DAPI e propidio ioduro vengono aggiunti a ciascun campione ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml.

2. Utilizzare un campione di controllo negativo senza macchia, preferibilmente cellule isolate dal tessuto stesso, come i campioni sperimentali, per regolare side scatter (SSC) e forward scatter (FSC) in modo che la popolazione cellulare (s) di interesse sono in scala.

Nota: Per l'analisi delle cellule AT SVF, si consiglia di SSC viene visualizzato in una scala logaritmica contro FSC in una scala lineare. L'uso di una scala logaritmica per SSC è particolarmente importante quando si analizzano ATM, che sono spesso molto grandi e granulare.

3. Disegnare un cancello diffusione luminosa iniziale in base al tipo di cellula (s) da analizzare, e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno in modo che le cellule non colorate sono all'estrema sinistra di un istogramma solo parametro (approssimativamente centrato su 10 ²⁾ per i canali appropriati.

Nota: Si raccomanda di linfociti e macrofagi (o altre cellule mieloidi) essere analizzati separatamente a causa di differenze di autofluorescenza.

4. Utilizzare singoli controlli macchiati o anticorpo di cattura sfere di compensazione per eseguire la compensazione multi-colore.

Nota: Si consiglia l'uso di sfere di compensazione, tuttavia, la compatibilità di ogni anticorpo deve essere garantita. Ad esempio, sfere di compensazione potrebbero non cross-reagiscono con anticorpi di coniglio, nel qual caso le cellule isolate sono tenuti ad ottenere un adeguato controllo singolo macchia.

5. Impostare cancelli sperimentali basati sui controlli modificati FMO.
6. Impostare il citometro di flusso per raccogliere il numero appropriato di eventi basati sulla prevalenza della popolazione di interesse e registrare i dati sperimentali.
7. Esportare i file FCS di dati per l'analisi offline. Ci sono numerosi programmi disponibili per il flusso cytometrl'analisi dei dati y. Si consiglia Cytobank, una piattaforma web-based che permette investigatores per memorizzare e analizzare i dati e generare dati da qualsiasi computer con accesso a internet ^18. Inoltre, Cytobank offre la possibilità di rendere pubblici i dati accessibili o limitare l'accesso a collaboratori.

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Risultati

Collagenasi digestione di AT seguito da centrifugazione differenziale è stato utilizzato per isolare il SVF da cuscinetti di grasso dell'epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentato un basso contenuto di grassi (10% kcal dai grassi) o ad alto contenuto di grassi (60% kcal dai grassi) dieta (LFD e HFD , rispettivamente) per 16 settimane. Cellule del SVF furono poi etichettati con anticorpi primari fluoroforo-coniugato a quantificare la percentuale di vitale ATM (Figura 1) e AT cellule T (fig...

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Discussione

Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell'obesità ha portato all'uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dett...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.