Tecnica per lo Studio artropodi e comunità microbiche all'interno Albero tessuti

Riepilogo

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Abstract

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

Introduzione

Floema e corteccia di conifere tessuti ospitano migliaia di organismi. Phloeophagy, l'alimentazione sui tessuti floema della corteccia interna, è un'abitudine di solito associata a scolitidi, woodborers, e molti altri taxa di invertebrati e microrganismi che vivono entro ²³ alberi di corteccia coleotteri. (Coleoptera: Curculionidae) sviluppare e vivere all'interno di floema ad eccezione di brevi periodi quando gli adulti cercano nuovi alberi ospitanti. ³¹ Scolitidi sono stati ampiamente studiati per i loro effetti economici sugli alberi ^18,19, ma osservazioni dirette del comportamento degli insetti all'interno di materiali di alberi sono stati limitati. ⁴ Inoltre, le gallerie costruite da scolitidi diventare l'habitat di una miriade di specie. ¹¹ Un gran numero di funghi, batteri ^{30 3,} acari e nematodi ^{10,21, 16,19} insieme ad altri artropodi predatori e parassiti ^22,24 abitano il materiale floema. Le tecniche di cui quiconsentire l'osservazione diretta di scolitidi, acari e tarli del legno che di solito vivono in ambienti sottocorticali. Lievi alterazioni del protocollo può essere fatto per studiare funghi e batteri.

Scolitidi e organismi associati all'interno dei tessuti degli alberi sono stati studiati con un "sandwich floema." L'uso precoce di questa tecnica può essere trovata nella datazione della letteratura indietro al 1933, quando è stato usato per osservare i stadi larvali di scarabeo Douglas-fir (Dendroctonus pseudotsugae). ² Il panino floema è passato attraverso molte derivazioni da materiali diversi si sono resi disponibili. Originariamente, questo dispositivo costituito da un pezzo di floema posto tra due lastre di vetro, pressate insieme da fasce elastiche. ² Successivamente, morsetti, nastro, colla, plastica e altri materiali sono stati utilizzati nella costruzione del sandwich. ^{13,14 , 15,17,26,28} Il protocollo qui descritto offre miglioramenti rispetto alcuni dei disegni del passato. Per esempio, inpassato, specie di prova sono stati inseriti nel lato del sandwich, tra le lastre di vetro o di plastica. Questo limita la costruzione di gallerie in una direzione. L'uso di fori di entrata nella piastra superiore permette una maggiore libertà per le specie di prova per avviare la costruzione della galleria naturale. Un altro vantaggio del protocollo presentato è il suo design semplificato, che può essere facilmente realizzato con pochi strumenti. L'uso del sandwich floema ha permesso l'osservazione diretta del comportamento alimentare, la riproduzione, lo sviluppo, e le interazioni di organismi che non sarebbe altrimenti stata possibile. ^{1,5, 22} Questo metodo è anche un ottimo strumento per la K-12 dell'istruzione e della scienza programmi e le indicazioni.

Ci sono diverse sfumature nella creazione di un panino floema che sono difficili da interpretare da o non riportate nei manoscritti. Crediamo che una visiva (cioè, video) descrizione della produzione di un panino floema è necessario e sarebbedi valore per gli scienziati e gli educatori interessati a studiare gli organismi phloeophagous. Il nostro protocollo fornisce un modo semplice e poco costoso per osservare artropodi, microbi e altri organismi che popolano i tessuti floema.

Protocollo

1. Floema Selezione e Cancellazione dal albero

1. Selezionare un albero con caratteristiche particolari. Raccogliere floema da pini (vale a dire, gli alberi del genere Pinus) in quanto hanno un livello caratteristico floema che ha uno spessore di qualche millimetro. ^18,27 Una volta che un albero si trova che ha pochi rami più bassi, verificare l'assenza di eventuali altri difetti come gli attacchi di insetti e / o agenti patogeni. In alternativa, utilizzare floema da altri alberi di conifere come abeti panini floema. ⁹ Altri alberi specie possono essere adatti per la rimozione floema come legni duri.
   NOTA: Conifere con grandi corone in genere hanno il tessuto floema più spessa. Per massimizzare la quantità di floema, è meglio tagliare alberi che hanno pochi difetti e rami sul tronco (tronco). Specie di pino che sono il lavoro di auto-potatura migliore. Floema è in genere più spesso durante la stagione di crescita ed è spesso più in alto il tronco che in prossimità del suolo. Floema è a volte difficile da Remove dagli alberi durante l'autunno o inverno.
2. Tagliare un albero verso il basso o utilizzare i registri di recente tagliati a ottenere tessuto floema. Scegliere una direzione che cade che ridurrà al minimo i danni per l'albero e alberi vicini. Rami tagliati fuori dal tronco per consentire un più facile accesso ai materiali di corteccia durante la rimozione floema.
3. Una volta che un albero viene tagliato (abbattuti, caduto a terra) iniziano raschiando la corteccia del tronco con una lama affilata pareggio (Fig 1A.). Raschiare una zona della corteccia fino a raggiungere lo strato floema.
   NOTA: Lo strato floema è in genere di colore più chiaro (ad esempio, color crema) e umido, mentre la corteccia esterna è più secco e di colore più scuro (Fig 1B.). Fare attenzione a non raschiare il floema. L'area di corteccia raschiata dipende dalla dimensione del pezzo floema (s).
4. Dopo la corteccia viene rimossa, tagliare un contorno del pezzo floema con un coltello affilato. Assicurarsi che la lama taglia fino al xilema (Fig. 2A).
5. Per rimuovere il floema, partono da un angolo del pezzo floema con le dita per rimuovere con cautela indietro il floema. Utilizzare un coltello per aiutare a raschiare il floema fuori dal xilema. Continuare a tirare il floema spento fino l'intero pezzo viene rimosso.
   NOTA: Floema bucce in genere fuori della struttura più semplice in estate. Per floema che è estremamente difficile da rimuovere, uno strumento a forma di spatola può aiutare nello sforzo.
6. Posizionare immediatamente il pezzo floema in un sacchetto sterile. Per ottenere i migliori risultati, vuoto sigillare il sacchetto (Fig. 2B) o, se si usa sacchetti ziploc, rimuovere tutta l'aria dal sacchetto. Questo aumenta la longevità del floema. Facoltativamente, inserire più pezzi di floema in un sacchetto. Conservare floema in sacchetti ermetici leggermente sopra zero (tra 1 e 10C) per mantenere la freschezza.

2. Creazione del Sandwich floema

1. Tagliate due pezzi uguali di acrilico trasparente, in policarbonato, o un disco, materiale trasparente simile (ad esempio, vetro) un po 'di grandi dimensionir rispetto al pezzo di floema (Fig. 2C). Attorno ai bordi del acrilica per evitare angoli strappi la guarnizione Parafilm. Questo protocollo utilizza un 1/8 in. Di spessore acrilico trasparente.
   NOTA: La dimensione dei pezzi tagliati dipende dalle esigenze dell'organismo soggetto e la durata dello studio. Per esempio, una coppia di scolitidi utilizza 4 dm ² del floema un periodo mese, ma solo bisogno di 1 dm ² se lo studio ha luogo entro alcuni giorni.
2. Realizzare un foro in uno dei pezzi acrilici per consentire l'ingresso di organismo studio (s). La dimensione e il numero dei fori dipende obiettivi (Fig. 2D).
3. Prima di mettere il floema tra i pezzi in acrilico, sterilizzare la superficie acrilica (con> 70% di etanolo) o, se si utilizza nuovo acrilico, rimuovere la pellicola protettiva.
4. Posizionare il nuovo pezzo di floema tra i pezzi in acrilico sterili. Orient pezzo acrilico con il foro (s) sul lato interno o esterno del floema, whicheveOccorre r. Tipicamente, rivolto verso il lato esterno del floema (lato che aveva corteccia su di esso) verso i fori di ingresso.

3. tenuta Sandwich floema

1. Per creare un sigillo temporaneo intorno panino floema, utilizzare 2. Parafilm strisce larghe tirato attorno ai bordi del sandwich floema (Fig. 2C). In alternativa, utilizzare un involucro di cloruro di polivinilidene per sigillare i bordi. ⁶ Avanti, posizionare un morsetto su ogni lato del sandwich renda al acrilica al floema. Assicurarsi che l'intera superficie è un giro di vite per evitare che lo spazio d'aria tra l'acrilico e floema (Figura 2C). Se non è bloccato correttamente, i campioni possono muoversi in tra l'acrilico e il floema.
2. Per creare una tenuta semipermanente aggiungere una gelatina epossidica o petrolio non incollaggio intorno floema. Assicurarsi che il materiale circonda completamente il floema. Successivamente, utilizzare morsetti o le viti con bulloni (potrebbe essere necessario praticare dei fori in anticipo) per contenere l'acrilico stretto al floema.I panini rimangono solo valida per un massimo di uno o due mesi.
3. A seconda delle esigenze di ossigeno degli organismi di studio, aggiungere un filtro dell'aria su uno o più lati del sandwich. Questo permetterà all'aria di entrare nel panino floema, ma limita la perdita di acqua dal floema. Usiamo semplici filtri a carbone che riducono anche il rischio di contaminazione batterica e fungina.
4. Per i campioni di studio che richiedono l'entrata e l'uscita a volontà, sostituire uno dei pezzi in acrilico con legno o materiale simile che un insetto in grado di scavare. Ciò è particolarmente importante per l'osservazione di tarli del legno, perché dopo il loro stato larvale si completa nello strato floema, che poi portavano nella xilema.
5. Per evitare che i soggetti di prova di uscire i fori di ingresso, posizionare piccole piastre di Petri (o altri oggetti, nastro) sui fori, fuga di blocco. Dal momento che gli organismi che si trovano in questi spazi sono abituare a bassi livelli di luce, può essere necessario posizionare i panini in una stanza buia o scatola, o luogo omateriale paque in alto per bloccare la luce.

4. di osservare i microrganismi presenti nel floema Sandwich

1. Introdurre esemplari studio in ammissione foro del sandwich floema (Fig. 2D). Osservare i campioni utilizzando un microscopio dissezione sotto una luce rossa o luce bianca fissato a un livello basso (Fig. 2E).
2. Per registrare le attività o la crescita di esemplari all'interno del panino floema collegare una fotocamera o una videocamera per il microscopio. Attaccare telecamere speciali all'oculare del microscopio (Fig. 2E & F). Per molto piccoli organismi come gli acari, nematodi, e pseudoscorpioni, utilizzare una telecamera ad alta definizione collegata al microscopio.
3. Per registrare suoni, inserire i microfoni nel foro di entrata del sandwich floema o attraverso il lato del sandwich floema. Poiché il foro di ingresso è piccolo, utilizzare un piccolo microfono, come un microfono a condensatore a elettrete.
4. Per registrare dal lato o la superficie diil panino floema utilizzare un elemento piezoelettrico (Fig. 3B). Per riprodurre il suono, utilizzare lo stesso elemento piezoelettrico o collegare un trasduttore tattile (Excitor) alla superficie della parte superiore o inferiore della acrilico.

Risultati

Il protocollo sopra descritto consentirà un ricercatore di osservare gli organismi che vivono nell'ambiente criptico sotto la corteccia di un albero. Per illustrare l'uso di questa tecnica si descrive uno studio rappresentativo dal nostro laboratorio che utilizza questa tecnica. ¹² In questo esperimento, panini floema sono stati usati per osservare gli effetti dei trattamenti acustici su capacità riproduttiva, la distanza tunneling, e la sopravvivenza di scolitidi (Fig . 2E e 2F). Osservazione diretta di coleotteri, reso possibile dall'utilizzo di un panino floema, ha rivelato diversi risultati interessanti. In primo luogo, abbiamo registrato le distanze di tunneling quotidiane contrassegnando posizione degli scarabei in acrilico con un pennarello ogni 24 ore. Questo processo ha rivelato differenze significative tra i trattamenti sonori che sarebbero stati nascosti, senza il panino floema. Successivamente, abbiamo osservato una riduzione della produzione di uova con particolari trattamenti del suono. La natura mobile del panino floema permesso eosservazioni gg da completare sotto un microscopio da dissezione senza disturbare i coleotteri. Durante queste osservazioni, abbiamo catturato scarabeo uova comportamento, che con una fotocamera ad alta definizione collegata al microscopio. Altre osservazioni importanti incluso l'uccisione di compagni e l'avvio di volo associata a particolari trattamenti acustici. Il test panino floema è stato fondamentale per il nostro studio di corteccia scarabeo risposte ai trattamenti acustici. Queste scoperte, che sarebbe impossibile osservare sotto la corteccia di un albero, sono preziosi contributi allo sviluppo di opzioni di gestione per la lotta contro i focolai bostrico.

Figura 1. A) Strumenti necessari per rimuovere la corteccia da un albero. I punti 1 e 2 sono lame disegnare utilizzati per raschiare corteccia dell'albero. Gli articoli 3 (ascia) e 4 (pull sega) sono utili per rimuovere ramizona nei pressi di rasatura. B) L'uso della lama sorteggio per rimuovere la corteccia da un albero. Notate il colore della luce del floema sotto la corteccia rossastra.

Figura 2. A) La rimozione del floema dopo la corteccia è stata raschiata di albero. B) floema fresco conservato in sottovuoto borsa. C) panino Floema con fascette tenendo i pezzi in acrilico insieme e Parafilm intorno ai bordi per evitare contaminazione e disseccamento del floema. D ) Scarabeo di corteccia vicino al foro perforato in acrilico. E) per mezzo del microscopio per osservare panino floema. Display F) Video scolitidi all'interno panino floema.

Figura 3. A) acquisizione del feromone da coleotteri in sandwich di floema. L'aria è di essere tirato attraverso provette contenenti Super-Q assorbente. B) Registrazione e riproduzione del suono tramite un trasduttore piezoelettrico (al centro nella foto) per coleotteri pino mugo nel panino floema.

Discussione

Il panino floema permette l'introduzione e l'osservazione degli artropodi, microbi, e altri piccoli organismi che popolano i tessuti floema. ^{1,7,8,9,17,18} Questa tecnica ha portato a nuove scoperte e una migliore comprensione dei comportamenti, vita tratti la storia, lo sviluppo, e le interazioni degli organismi all'interno dell'albero floema. ^1,5,10 Il protocollo panino qui descritto è un ibrido di disegni del passato, e fornirà un panino economico che può essere facilmente costruito con attrezzatura minima e materiali. I pezzi di vetro, acrilico o policarbonato possono essere riutilizzati, e gli unici materiali di consumo sono il Parafilm e floema.

Anche se tutte le fasi del protocollo sono importanti, alcuni passaggi devono essere seguiti rigorosamente al fine di garantire il più alto grado di successo. In primo luogo, un albero deve essere situato che ha una porzione di tronco gratuito, o relativamente libera, di rami. Gli alberi che hanno molti rami sono difficili da radere e volontà yield pochi pezzi floema vitali, come ogni ramo deve essere tagliato attorno durante la rimozione del floema. Quindi, è importante minimizzare l'esposizione all'aria del floema. Abbiamo posto rapidamente ogni pezzo floema in un sacchetto al momento della rimozione. Dopo 3-6 pezzi vengono rimossi, vengono trasferiti in un sacchetto sottovuoto; usiamo un inverter di potenza per eseguire il sigillante fuori una batteria del veicolo nel campo. Ultimo, sanificazione i pezzi in acrilico e la pulizia generale durante l'esecuzione di questo protocollo consentirà di ridurre la crescita di funghi nel panino. Questo è particolarmente importante per le osservazioni estese.

Come accennato in precedenza, vi sono limitazioni dell'apparato panino floema. Poiché lo strato floema è sottile, solo piccole organismi che tipicamente rimangono nel floema possono essere introdotti nel panino. Insetti più grandi come tarli del legno (ad esempio, Buprestid, Cerambycidae specie) possono essere introdotti e osservati per le prime fasi del loro ciclo di vita. Questo lasso di tempo è di solito limitata a due atre settimane; dopo questo punto le larve richiede legno xilema annoiarvi in ​​per impupamento. Al contrario, per gli scolitidi, in particolare quelli nel genere Ips, un ciclo di vita completo può essere osservato, tra cui l'accoppiamento, uova da cova, alimentazione, pupating, e eclosion in un coleottero adulto. A questo punto, la fattibilità del sandwich è di solito esaurito a causa di essiccazione e la crescita fungina. ²⁸ Inoltre, questo apparecchio non consente insetti liberamente e naturalmente colonizzano o uscire il panino floema. ²⁷

Il nostro protocollo è flessibile in termini di dimensioni, forma e tipo di floema utilizzato. Studi brevi richiedono meno materiale floema e dimensioni panino possono essere scalati di conseguenza. Molte specie di conifere sono stati utilizzati come donatori floema in un panino floema (ad esempio, ponderosa pino ^12, Douglas-abete ^2, abete rosso ^29, loblolly pino ^27, longleaf pino ^27). Materiali a sandwich possono essere modificati; esampie, lastre di vetro possono essere utilizzati al posto di acrilico e resina epossidica o nastro invece di Parafilm.

La parte più difficile di questo protocollo è il processo di rimozione floema. Gli alberi accanto all'altro possono differire in quanto sia difficile il loro floema è quello di rimuovere. Quando un albero è difficile floema, la pazienza è fondamentale. In questi casi, eseguire accuratamente il coltello tra xilema duro e il floema spugnosa. Questo processo si sente letteralmente come la scuoiatura l'albero.

Dopo aver imparato la tecnica di base panino, modifiche al protocollo possono aiutare a bisogni specifici in forma. Ad esempio, affinando le tecniche necessarie per rimuovere floema, pezzi più grandi possono essere rimossi e utilizzati per creare panini grandi. Inoltre, le modifiche possono essere fatte per ospitare strumenti specifici, ad esempio, fori supplementari per monitorare le emissioni chimiche (Fig. 3A), o di registrazione o riproduzione di suoni (Fig. 3B). Le modifiche possono essere apportate per consentire la conservazione semipermanente del floema e l'organoismi, o per le osservazioni temporanee di organismi che possono poi essere lasciato libero.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls