High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Riepilogo

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

Abstract

Virus a RNA sono responsabili di gravi malattie umane come l'influenza, bronchite, dengue, epatite C o il morbillo. Essi rappresentano anche una minaccia emergente a causa di un aumento degli scambi mondiali e le popolazioni umane che penetrano sempre più ecosistemi naturali. Un buon esempio di tale situazione emergente è epidemie di virus chikungunya del 2005-2006 nell'Oceano Indiano. I recenti progressi nella nostra comprensione delle vie cellulari che controllano la replicazione virale suggeriscono che i composti di targeting funzioni della cellula ospite, piuttosto che il virus stesso, potrebbe inibire un grande pannello di virus a RNA. Alcuni composti antivirali ad ampio spettro sono stati identificati con ospite analisi mirate. Tuttavia, misurando l'inibizione della replicazione virale in colture cellulari con riduzione degli effetti citopatici come visualizzatore ancora rappresenta una strategia di screening fondamentale. Tali schermi funzionali sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus ricombinanti che esprimono giornalista enzimi capable della bioluminescenza come la luciferasi. Nella presente relazione, abbiamo dettaglio un gasdotto high-throughput screening, che combina il morbillo ricombinanti e virus chikungunya, con saggi di vitalità cellulare, per identificare i composti con un profilo antivirale ad ampio spettro.

Introduzione

Virus a RNA sono responsabili di una grande varietà di infezioni umane, e hanno un enorme impatto sulle popolazioni di tutto il mondo, sia in termini di salute pubblica e di costo economico. Vaccini efficaci sono stati sviluppati contro diversi virus a RNA umano, e sono ampiamente utilizzati come trattamenti profilattici. Tuttavia, vi è ancora una mancanza critica di farmaci terapeutici contro infezioni da virus RNA. Infatti, i vaccini non sono disponibili efficaci contro i principali agenti patogeni umani, come il virus della dengue, il virus dell'epatite C o da virus sinciziale respiratorio umano (HRSV). Inoltre, i virus a RNA sono responsabili per la maggior parte delle patologie emergenti, che sono aumentate in frequenza a causa degli scambi globali e l'impatto umano sui sistemi ecologici. Contro questa minaccia che rappresentano i virus a RNA, il nostro arsenale terapeutico è estremamente limitato e relativamente inefficiente ^1-3. Terapie attuali si basano essenzialmente sul tipo ricombinante I interferoni (IFN-α / β) per stimolare l'immunità innata,o la somministrazione di ribavirina. Sebbene il meccanismo di azione di questo analogico ribonucleoside è controversa e probabilmente si basa su vari meccanismi, l'inibizione di IMPDH cellulare (inosina monofosfato deidrogenasi), che esaurisce piscine GTP intracellulare, è chiaramente essenziale ^4. Ribavirina, in combinazione con Interferone-α, è il principale trattamento contro il virus dell'epatite C. Tuttavia, i trattamenti IFN-α / β e ribavirina sono relativamente scarsa efficacia in vivo contro la maggior parte dei virus a RNA come efficiente smussato IFN-α / β segnalazione attraverso l'espressione dei fattori di virulenza ⁵ e spesso sfuggire ribavirina ^3. Questo aggiunto al fatto che il trattamento ribavirina sta sollevando importanti problemi di tossicità, anche se è stato recentemente approvato contro la malattia HRSV grave con benefici controversi ^6. Più recentemente, alcuni trattamenti specifici per il virus sono stati commercializzati, in particolare contro il virus dell'influenza, con l'o sviluppof inibitori della neuraminidasi ^3. Tuttavia, la grande diversità ed emergere permanente dei virus RNA preclude lo sviluppo di trattamenti specifici contro ciascuno di essi in un futuro relativamente vicino. Complessivamente, questo sottolinea la necessità di strategie efficaci per identificare e sviluppare molecole antivirali potenti nel prossimo futuro.

È banale dire che un inibitore di ampio spettro attivo contro un grande pannello di virus a RNA possa risolvere questo problema. Anche se una tale molecola è ancora il sogno di un virologo, la nostra migliore comprensione dei meccanismi di difesa cellulari e sistema immunitario innato suggeriscono che alcune possibilità esistono ^7,8. Diversi laboratori accademici e industriali sono ora alla ricerca di molecole che stimolano aspetti specifici dei meccanismi di difesa cellulare o vie metaboliche per smussare la replicazione virale. Sebbene tali composti probabilmente mostrerà significativi effetti collaterali, i trattamenti contro le infezioni virali acute saranno amministrareED per un tempo relativamente breve, rendendoli accettabili nonostante una certa tossicità potenziale sul lungo termine. Varie strategie sono state sviluppate per identificare tali ampio spettro molecole antivirali. Alcuni programmi di ricerca mirano a trovare le molecole che colpiscono specifiche vie di difesa o metaboliche. Questo include, per esempio, recettori di riconoscimento patogeno per suscitare l'espressione genica antivirale ⁹ e attivare fattori antivirali come RNASEL ^10, macchine autofagia promuovere degradazione virus ^11, sintesi nucleoside percorsi guidati ^12,13, o cascate apoptotiche per precipitare morte delle cellule infettate da virus ^14. Altri gruppi hanno sviluppato schermi fenotipiche che non sono a target basati ^13,15-17. In tal caso, le molecole antivirali sono semplicemente identificati dalla loro capacità di bloccare la replicazione virale in un dato sistema cellulare. Il presupposto generale è che un composto inibente 2-3 RNA virus non correlati avrebbe un profilo adeguato ad ampio spectrum molecola antivirale. La modalità di azione di composti hit selezionate con un approccio empirico è determinato solo in un secondo tempo e, infine, può portare alla identificazione di nuovi bersagli cellulari per antivirali. È interessante notare, un'analisi retrospettiva di nuovi farmaci approvati dalla US Food and Drug Administration tra il 1999 e il 2008 ha mostrato che, in generale, tali proiezioni fenotipici tendono a rendere meglio rispetto agli approcci di obiettivi di scoprire prima-in-class piccole molecole farmacologiche ¹⁸ .

Replicazione virale in saggi cellulari high-throughput è di solito determinata da virus effetto citopatico. Le cellule sono infettate e coltivate in 96 - o 384 pozzetti in presenza di composti testati. Dopo alcuni giorni, strati cellulari vengono fissate e colorate con coloranti come cristallo violetto. Infine, l'assorbanza è determinato con un lettore di piastre e composti che inibiscono la replicazione virale sono identificati per la loro capacità di conservare i livelli cellulari from indotta da virus effetto citopatico. In alternativa, effetto citopatico virale-mediate sono valutate con test di vitalità standard come la riduzione MTS. Tali saggi sono molto trattabili e conveniente, ma soffrono di tre importanti limitazioni. In primo luogo, essi richiedono una combinazione virus-cellula in cui la replicazione virale è citopatico in soli pochi giorni, ma questo non è sempre possibile, mettendo così per le strategie alternative ^19. In secondo luogo, essi sono scarsamente quantitativa poiché si basano su una misura indiretta della replicazione virale. Infine, composti tossici possono essere segnati come risultati positivi, e quindi devono essere eliminate con uno schermo contatore che misura la vitalità cellulare. Per superare alcuni di questi ostacoli, virus ricombinanti o repliconi sono stati progettati dai genetica inversa per esprimere proteine ​​reporter, come EGFP o luciferasi, da una unità di trascrizione aggiuntivo o in frame con geni delle proteine ​​virali (alcuni esempi sono ^20-23). Quando questi virus si replicano, giornalista proteins sono prodotte con proteine ​​virali stessi. Questo fornisce un saggio molto quantitativa per misurare la replicazione virale e valutare l'attività inibitoria di molecole candidate. Ciò è particolarmente vero per i virus ricombinanti esprimenti luciferasi (o altri enzimi in grado di bioluminescenza) poiché questo sistema giornalista presenta una vasta gamma dinamica con elevata sensibilità e praticamente senza sfondo. Inoltre, non vi è alcuna fonte di luce di eccitazione, evitando interferenze con il composto fluorescenza ^24.

Qui, i dettagli di un protocollo high-throughput di vagliare librerie chimiche per gli inibitori ampio spettro di virus a RNA. I composti vengono testati prima su cellule umane infettate con un virus ricombinante morbillo (MV) che esprimono luciferasi di lucciola ²⁵ (rMV2/Luc, Figura 1, schermo primario). MV appartiene a Mononegavirales ordine, ed è spesso considerato come un membro prototipo del virus RNA negativo-strandes. Come tale, MV genoma è utilizzato come modello per la polimerasi virale per sintetizzare molecole di mRNA che codificano per proteine ​​virali. Nel ceppo ricombinante MV chiamato rMV2/Luc, espressione della luciferasi è espressa da una unità di trascrizione aggiuntivo inserito tra P e geni M (Figura 2A). In parallelo, i composti vengono testati per la loro tossicità su cellule umane usando un reagente a base di luciferasi commerciale che valuta, quantificando ATP, il numero di cellule metabolicamente attive in coltura (figura 1, schermo primario). Librerie chimiche interi possono essere facilmente sottoposti a screening con questi due saggi per selezionare composti che non sono tossici e bloccano efficientemente replica MV. Poi, risultati sono riesaminati per l'inibizione dose-risposta di replica MV, la mancanza di tossicità e per la loro capacità di alterare virus Chikungunya (CHIKV) replica (Figura 1, schermo secondario). CHIKV è un membro della famiglia Togaviridae e il suo genoma è apositive molecola a singolo filamento di RNA. Come tale, essa è del tutto estraneo a morbillo e composti che inibiscono sia MV e CHIKV levano in piedi una grande occasione per inibire un grande pannello di virus a RNA. Proteine ​​non strutturali CHIKV sono direttamente tradotti dal genoma virale, mentre le proteine ​​strutturali sono codificati mediante trascrizione e la traduzione di una molecola di mRNA subgenomico. La nostra replica saggio in vitro per CHIKV si basa su un ceppo ricombinante chiamato CHIKV / Ren, che esprime Renilla luciferasi come parte spaccati della poliproteina nonstructural attraverso un inserimento del gene reporter tra nsP3 e sequenze NSP4 ²⁶ (Figura 2B). La misura dell'attività di luciferasi Renilla consente il monitoraggio della replicazione virale nella fase iniziale del ciclo di vita CHIKV.

Questo protocollo ad alta produttività è stato usato per identificare rapidamente composti con un profilo adatto antivirali ad ampio spettro in una libreria commerciale di 10.000 molecduli arricchito di diversità chimica. I composti sono stati essenzialmente seguendo la regola di Lipinski di cinque, con un peso molecolare compreso 250-600 dalton, e registrare i valori D inferiore a 5. Maggior parte di queste molecole erano nuove entità chimiche non disponibili in altre biblioteche commerciali.

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Protocollo

1. Preparazione di 96 pozzetti Piastre figlia con composti

1. Spostare piastre madri a 96 pozzetti contenenti 10 mM soluzioni madre di composti chimici in DMSO da -20 ° C a temperatura ambiente. Diluire composti 5x in DMSO per ottenere piastre di diluizione a 96 pozzetti intermedi a 2 mm. Diluizione si ottiene pipettando 5 ml in 20 ml di DMSO e miscelazione.
2. Dispensare 1 ml di piastre di diluizione nei pozzetti secchi di bianco, coltura tissutale con codice a barre piastre da 96 pozzetti. Questa prima serie di piastre figlia (D1) viene utilizzato per valutare la tossicità dei composti ad una concentrazione finale di 20 mM. Piastre figlia Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
3. Diluire composti nuovamente 1:10 pipettando 4 microlitri di piastre di diluizione in 36 ml di DMSO e miscelazione. Pipettare 1 ml nei pozzi asciutti di bianco, fondo piatto, colture di tessuti con codice a barre 96-pozzetti piatti. Questo secondo insieme di piastre figlia (D2) viene utilizzato per valutare l'inibizione della MV replication da composti ad una concentrazione finale di 2 mM. Piastre figlia Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

2. Preparazione di colture cellulari per determinare Compound tossicità

1. Crescere le cellule HEK-293T a 37 ° C e 5% CO ₂ in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con stabilizzato L-glutammina e supplementato con 10% siero di vitello fetale (FCS), streptomicina (100 mcg / ml) e penicillina (100 IU / ml). Le cellule sono diversi passaggi per tripsinizzazione ogni 4-5 giorni, e diluito 1:10 in un pallone fresco. Le cellule devono essere in fase di log per esperimenti.
2. Il giorno dell'esperimento, recuperare le cellule mediante tripsinizzazione e di eseguire il conteggio delle cellule. Cellule pellet per centrifugazione e risospendere a 3 x 10 ⁵ cellule / ml in terreno di coltura. Si consideri che 12,5 ml di sospensione cellulare sono necessari per ogni piastra screening.
3. Trasferire le cellule in una mangiatoia, e dispensare 100 ml di sospensione cellulare in zolle D1 contenenti spillo componenti chimiciONDI. Sospensione cellulare nel trogolo è regolarmente agitato per evitare la sedimentazione.
4. Spike controllo pozzetti A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 e G12 con 1 ml di DMSO. Pozzetti verranno utilizzati come riferimento per le cellule viventi (tossicità). Spike controllo pozzetti B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 e H12 con 1 ml di DMSO e 2,5 ml di una soluzione 0,5% IGEPAL per uccidere le cellule. Pozzetti saranno utilizzati come riferimento per le cellule morte (elevata tossicità).
5. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.

3. Preparazione di colture cellulari infette da rMV2/Luc

1. Crescere e recuperare cellule come descritto in 2.1 e 2.2. Ancora una volta, Risospendere le cellule a 3 x 10 ⁵ cellule / ml in terreno di coltura. Si consideri che 12,5 ml di sospensione cellulare sono necessari per ogni piastra screening.
2. Facoltativo: supplemento terreno di coltura con uridina a 20 mcg / ml.
   Nota: Quando lo screening di librerie chimiche per replicatio viralen inibitori, sembra che i composti di targeting primi passi della via di biosintesi delle pirimidine sono spesso isolati ^13,16,27,28. L'aggiunta di uridina al mezzo di coltura viene utilizzato per filtrare tali molecole antivirali. In effetti, questo ripristina efficacemente la replicazione virale quando gli enzimi a monte della via di biosintesi delle pirimidine sono bloccati.
3. Salvare 01:10 di sospensione cellulare per pozzetti di controllo con le cellule non infette, e procedere all'infezione con il volume rimanente.
4. Scongelare il volume appropriato di soluzione rMV2/Luc. Le soluzioni di archivi MV sono di solito a 10 ⁶ -10 ⁸ particelle infettive per ml. La cultura deve essere infettato da 0.1 particelle infettive di rMV2/Luc per cellule bersaglio, che corrisponde a 0,1 molteplicità di infezione (MOI). Nota: rMV2/Luc deriva dal vaccino MV (ceppo Schwarz) e viene manipolato in un ambiente BSL2.
5. Aggiungi al virus di sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire le cellule infette a un trogolo, e dispensare 100microlitri di sospensione cellulare infettata nelle colonne 2 a 11 piastre di D2 contenenti composti chimici spillo. Sospensione di cellule all'interno della depressione viene regolarmente miscelato delicatamente.
6. Nelle colonne 1 e 12, dispensare 100 microlitri di cellule non infette un pozzo per due. Cellule infettate sono dispensati negli altri pozzetti.
7. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.

4. Misure Luciferase attività e analisi dei dati

1. Rimuovere le piastre D1 dal termostato, e determinare la vitalità cellulare con l'aggiunta di 50 ml di base di luciferasi-fattibilità reagenti direttamente ai pozzetti di coltura. Miscelare e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Leggere le piastre con un luminometro. Tempo di integrazione è impostato a 100 msec per bene.
2. Rimuovere le piastre D2 dal termostato, e determinare l'attività di luciferasi aggiungendo 50 ml di substrato luciferasi direttamente pozzetti di coltura. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente, e leggere le piastre con un luminometro come descriletto sopra.
3. Calcolare un Z'-fattore per ciascuna piastra D1 del saggio di tossicità a garantire la qualità dello schermo ^29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), dove μ + e + σ corrispondono a mezzo di luminescenza e deviazioni standard per le cellule HEK-293T con solo DMSO (senza tossicità), e-μ e σ-sono mezzi di luminescenza e deviazioni standard per pozzetti di coltura trattati con IGEPAL per uccidere le cellule. Z 'dovrebbe essere superiore a 0,5, o la corrispondente piastra viene scartato.
4. Impostare la soglia di tossicità a μ + / 2. Scartare composti con valori di luminescenza di sotto di questo cut-off (Figura 3A).
5. Calcolare un Z'-fattore per ciascuna piastra D2 del saggio antivirale. Qui, μ + e + σ corrispondono a mezzo di luminescenza e deviazioni standard per cellule infettate coltivate con il solo DMSO, e μ e σ-sono mezzi di luminescenza e deviazioni standard per le cellule non infette. Ancora una volta, piatti con Z & #39; valori inferiori a 0.5 vengono scartati.
6. Calcolare l'inibizione della replicazione virale come segue: percentuale di inibizione = (μ + - attività di luciferasi per il composto X) / (μ + - μ-) * 100. Impostare la soglia di inibizione al 75%, e selezionare composti che sia a ridurre i valori di luminescenza di sotto di questo cut-off (Figura 3B) e non sono tossiche secondo i criteri descritti in 4.4.

5. Schermo secondario per la tossicità e ampio spettro di attività antivirale

1. Assicurati 01:02 diluizioni seriali per ogni colpo composto in DMSO, a partire da 500 micron a 4 micron (8 diluizioni). Riempire bianco, tessuti piastre di coltura con codice a barre con 50 ml di terreno di coltura. Aggiungere 1 ml di ogni diluizione composto in pozzetti di coltura. Ripetete due volte per avere 3 piastre di coltura con diluizioni seriali duplicati per ogni composto colpo.
2. Preparare 37,5 ml di una sospensione di cellule HEK-293T a 6 x 10 ⁵ cellule / ml in terreno di coltura come descritto sopra (in 2.1 e 2.2). Dispensare 2x 12,5 ml in tubi falcon e infettare le cellule sia con rMV2/Luc al MOI = 0.1 o CHIKV ricombinante che esprime Renilla luciferasi (CHIKV / Ren) a MOI = 0.2. Mescolare capovolgendo.
   Nota: CHIKV / Ren è derivato da un ceppo selvatico di CHIKV e quindi dovrebbe essere manipolato in un ambiente BSL3. Le piastre possono essere spostati da BSL3 a BSL1 volta substrato Renilla è stato aggiunto ai pozzetti di coltura (vedi sotto).
3. Dispensare 50 ml di infetti, rMV2/Luc-infected, o CHIKV / cellule Ren-infetti in piastre di coltura contenenti diluizioni seriali di composti ferita. Incubare 24 ore a 37 ° C.
4. Aggiungere 50 ml di substrato luciferasi di lucciola per determinare l'attività lucciola luciferasi in pozzi rMV2/Luc-infected. Aggiungere 50 ml di Renilla substrato luciferasi per determinare l'attività luciferasi Renilla in CHIKV / pozzi Ren-infettati. Infine, aggiungere 50 ml di base di luciferasi-test vitalità reagente per cellule non infette per determinare la vitalità cellulare.
5. Dati Plot (Figura 4) e determinare le concentrazioni di composti che inibiscono colpite MV e la replica CHIKV del 50%. Ignorare composto mostrando una certa tossicità in questo saggio.

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Risultati

Questo gasdotto di screening si basa in primo luogo sulla selezione dei composti che inibiscono la replicazione MV e non mostra alcuna tossicità cellulare significativa (Figura 1, schermo primario). Sfrutta saggi basati luciferasi per determinare la tossicità cellulare e l'inibizione della replicazione virale. Tutte le fasi di pipettamento e acquisizione dati può essere eseguita in un ambiente ad alta produttività con una piattaforma robotica.

Tossicità cellulare de...

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Discussione

La pipeline di screening qui descritto mira a selezionare i composti con un profilo adatto come inibitori ampio spettro di virus a RNA. Quando una libreria di 10.000 composti è stato proiettato con questo protocollo e sono stati applicati criteri di filtraggio di cui sopra, cioè l'inibizione della replicazione MV superiore al 75%, 40 composti (0,4%) ha ottenuto positive. Inoltre, circa la metà di loro ha mostrato una certa tossicità nel saggio di redditività basati luciferasi, e sono state disattese pe...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-well polystyrene cell culture microplates, white	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity.