Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

Riepilogo

Trattamento di osteoblasti di topo primari con acido retinoico produce una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti. Il metodo supera la difficoltà di ottenere e mantenere osteociti primari in coltura, e può essere vantaggioso per studiare cellule derivate da modelli transgenici.

Abstract

La necessità di culture osteociti è ben noto alla comunità dei ricercatori ossee; isolamento di osteociti primario è difficile e produce il numero di cellule bassi. Pertanto, il sistema cellulare più usato è la linea cellulare MLO-Y4 osteociti-like.

Il metodo qui descritto si riferisce all'uso di acido retinoico per generare una popolazione omogenea di cellule ramificate con caratteristiche osteociti morfologici e molecolari.

Dopo l'isolamento degli osteoblasti da calvaria topo, acido all-trans retinoico (ATRA) viene aggiunto a un terreno cella, e di monitoraggio delle cellule viene effettuato giornalmente al microscopio invertito. I primi cambiamenti morfologici sono rilevabili dopo 2 giorni di trattamento e differenziazione, è completa in 5 giorni, con progressivo sviluppo dei dendriti, perdita della capacità di produrre matrice extracellulare, down-regulation dei marcatori osteoblasti e up-regolazione di molecole specifiche per osteociti. contenuto "> monitoraggio delle cellule giornaliero è necessaria a causa della variabilità intrinseca delle cellule primarie, e il protocollo può essere adattato con minime variazioni di cellule ottenute da diversi ceppi di topi e applicate ai modelli transgenici.

Il metodo è di facile esecuzione e non richiede strumenti speciali, è altamente riproducibile, e genera rapidamente una popolazione osteociti maturo in completa assenza di matrice extracellulare, permettendo l'uso di queste cellule per applicazioni biologiche illimitati.

Introduzione

Osteociti, il più abbondante tipo cellule ossee, sono terminalmente differenziate, cellule altamente ramificati localizzati in profondità all'interno dello scheletro. Il corpo cellulare dei osteocytes mature sono contenute nelle lacune di osso e hanno forme diverse; osteociti con corpi cellulari allungati si trovano nell'osso corticale, osteociti arrotondati che sono più frequenti nell'osso trabecolare ^1. Dendriti ramificati estendono dal corpo cellulare e risiedono in piccoli canali chiamati canalicoli, formando una rete complessa che rende più contatti non solo con altri osteociti, ma anche con altri tipi di cellule di midollo, midollo osseo, vasi sanguigni e periciti associati. Attraverso il fluido interstiziale contenuta in lacune e canalicoli, osteociti sono anche definitiva collegato al sistema di circolazione, quindi possono influenzare non solo locale ma anche eventi sistemici, e viceversa il loro comportamento può essere regolata da variazioni sia locali che sistemici ^2.

Ilstudio di osteociti ha recentemente acquisito slancio, grazie a diversi miglioramenti tecnici, quali la generazione di tessuti e animali transgenici cellula-specifici, l'uso di potenti tecniche di microscopia e di high throughput screening molecolare ^3,4. Tuttavia, la conoscenza di queste cellule è ancora incompleta, principalmente a causa della relativa scarsità di adeguati modelli in vitro. In realtà, osteociti sono stati sempre difficili da ottenere e mantenere in coltura a causa della posizione profonda, e il basso livello di proliferazione che caratterizza tale tipo di cellula differenziata.

Nel corso degli anni, un certo numero di metodi sono stati sviluppati per isolare osteociti primario ^5-7, se generalmente producono produzioni di cellule basse e comportano il rischio che anche alcuni fibroblasti contaminanti saranno rapidamente invadere il osteociti ^8. Per questo motivo, più sperimentale in opera vitro è stato condotto finora sulla cella osteociti consolidata line MLO-Y4 ^9.

Metodologie aggiuntive in vitro potrebbero aumentare la possibilità di studiare queste cellule e potrebbero migliorare l'analisi della osteociti biologia e fisiopatologia. Per essere ampiamente adottati, tali metodi dovrebbero essere facili da riprodurre, e non richiederebbero particolari strumentazioni o tempi molto lunghi per raggiungere la maturazione delle cellule. Importante, se applicabile a cellule primarie, che consentirebbero di sfruttare animali transgenici. Recentemente abbiamo descritto che il trattamento della linea cellulare osteoblastica MC3T3-E1 e di osteoblasti primari con acido retinoico induce un cambiamento fenotipo rapido portando allo sviluppo di una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti ^10.

All-trans retinoico (ATRA) è un prodotto del metabolismo attivo della vitamina A che regola la trascrizione genica legandosi ai recettori dell'acido retinoico nucleari (ARSA). RARslegarsi al DNA come eterodimeri con i retinoidi X recettori (RXRs), portando in definitiva a modulazione di acido retinoico (RA)-reattiva geni bersaglio ^11. ATRA è stato dimostrato che modulano la differenziazione e la maturazione dei diversi tipi di cellule, tra i quali altre cellule ramificate come le cellule neuronali ¹² e podociti ^13.

Il metodo qui descritto è basato sulla aggiunta di ATRA di osteoblasti primari. Per essere efficace, ATRA deve essere aggiunto in una fase di maturazione preciso su cellule piastrate ad una densità definita; nella nostra esperienza queste condizioni sono fondamentali per ottenere l'interruttore fenotipo di osteoblasti a osteocytes.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo la normativa vigente europee relative alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono stati esaminati e approvati dal comitato etico dell'Università di Milano e nazionali.

1. Isolamento di osteoblasti primari

Il metodo, con lievi modifiche, segue la procedura descritta da Dodig et al ^14.

1. Preparare digerire medio, aggiungendo 0,1% collagenasi P e 0,05% tripsina (partendo dal 2,5% tripsina 10X, senza rosso fenolo) per mezzo HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, senza calcio, magnesio, o rosso fenolo).
2. Utilizzare 3-4 giorni di età topi (il procedimento può essere applicato a appena 1 mouse).
3. Sacrifica per decapitazione. Spruzzare la testa con il 70% di etanolo e tenere in ghiaccio. Togliere la pelle e muscoli strati da pinzette e dissezione / forbici chirurgiche.
4. Rimuovere delicatamente le ossa parietali esepararli seguendo la sutura sagittale in due metà. Assicurarsi che le ossa sono liberi di suture e di eventuali tessuti aderenti e posizionare singoli pezzi ossei in piastre a pozzetti contenenti HBSS medio fino a quando la procedura è completata.
5. Scartare HBSS e aggiungere a ciascun pozzetto il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C.
6. Scartare il surnatante.
7. Aggiungere nuovamente il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C.
8. Questa volta salvare il surnatante e trasferirla in alfa-MEM (Medium Minimum Essential) supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e l'1% di streptomicina / penicillina.
9. Ripetere i punti 1.7 e 1.8 2x.
10. In comune le tre frazioni raccolte, le cellule di spin mediante centrifugazione a 425 g per 5 minuti, scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di INTEGRAZIONI alfa-MEM per risospendere il pellet cellulare, e trasferirli in un pallone di 25 centimetri ^2.
11. Cambia il mezzo dopo 24 ore per rimuovere i detriti e le cellule morte.
12. Aggiungi l'acido 50 mg / ml ascorbico (AA) e 3 mm Glycerol 2-fosfato idrato sale disodico (GP) al mezzo alfa-MEM.
13. Successivamente, cambiare il mezzo (alfa-MEM più AA / GP) a giorni alterni.

2. ATRA protocollo

1. Condurre tutti gli esperimenti con ATRA (acido all-trans retinoico), in una stanza buia per evitare inattivazione.
2. Preparare una soluzione di tripsina 1X in HBSS medio e mantenerlo a 37 ° C fino all'utilizzo.
3. Rimuovere il supporto da cellule subconfluenti e accuratamente lavarli con HBSS.
4. Aggiungere 1 ml di tripsina, ruotare delicatamente il pallone per consentire tutte le celle da coprire con tripsina, e incubare per 3 min a 37 ° C.
5. Controllare il distacco effettivo di cellule al microscopio invertito.
6. Aggiungere 3 ml di alfa-MEM per inattivare la tripsina.
7. Recuperare le cellule e centrifugare per 15 minuti a 425 g.
8. Risospendere il pellet di cellule in terreno fresco.
9. Mettere una goccia in una camera di conteggio emocitometro, lasciare riposare per un paio di minuti e contare il cell numero.
10. Cellule posto a 25 centimetri ² palloni con una densità di 10.000 cellule / cm ² con alfa-MEM più AA / GP. Essere consapevoli del fatto che la densità cellulare è rilevante per lo sviluppo ottimale dei processi cellulari e contatti intercellulari. Una densità iniziale superiore a 10.000 cellule / cm ² compromette il corretto sviluppo di processi cellulari, ma il numero di cellule inferiori provocare la morte prematura delle cellule, a causa dell'assenza di contatti intercellulari.
11. Aggiungere 5 mM ATRA al mezzo ogni 24 ore.
12. Monitorare le cellule quotidianamente per valutare la morfologia: cambiamenti morfologici sono generalmente osservati dopo 48 ore. Se, dopo le prime 24-48 ore, le cellule sono ancora proliferano, replate alla densità sopra. Una popolazione omogenea di osteocytes matura è presente dopo 4-5 giorni. A seconda delle esigenze, utilizzare cellule in qualsiasi punto di tempo, fino a 12-15 giorni.
13. Quando le cellule vengono piastrate su altri supporti (come coprioggetto o piastre a pozzetti), assicurarsi che la densità sopra è mantenuta econtinuare ad aggiungere ATRA ogni 24 ore fino al momento dell'uso. Lasciare cellule di aderire al nuovo supporto per almeno 24 ore prima dell'esperimento.

3. Immunostaining

1. Per immunostaining, piastra le cellule su vetrini e seguire le metodologie stabilite (si veda ad esempio Burry ^15).
2. Ad esempio, per immunofluorescenza indiretta, fissare in paraformaldeide al 4% o acetone freddo, incubare sequenzialmente con l'anticorpo primario a temperatura ambiente per 1 ora in una camera umidificata, poi con l'anticorpo secondario marcato fluorescente al buio, a temperatura ambiente per 30 min, in una camera umidificata.
3. Utilizzare DAPI o analoghi per contrasto nucleare, e montare anti-fading medio.

4. Alizarina rossa colorazione e estrazione

1. Piastra le cellule su vetrini.
2. Fissare le cellule immergendo il vetrino in etanolo al 70% per 10 min.
3. Coprire le cellule con alcune gocce di soluzione colorante rosso alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)per 30 minuti.
4. Lavare i coprioggetti con acqua di rubinetto. Montare con una goccia di glicerolo su vetrini e prendere le immagini utilizzando un microscopio verticale a 10X e 20X di ingrandimento.
5. Dopo la procedura di cui sopra, recuperare i coprioggetto immergendo i vetrini in acqua di rubinetto.
6. Mettere ogni vetrino in una piastra ben.
7. Aggiungere acido perclorico al 60% (la quantità deve essere sufficiente a coprire completamente le cellule) e lasciare O / N a 4 ° C con agitazione.
8. Leggere la densità ottica del surnatante mediante spettrofotometria a 450 nm.
9. Per normalizzare i valori per numero di cellule, aggiungere Janus verde (soluzione allo 0,2% in PBS) per coprire il preparato cellulare per 10 min.
10. Lavare accuratamente con acqua ultrapura.
11. Aggiungere 0,5 N HCl (la quantità deve essere sufficiente a coprire tutte le cellule) e agitare delicatamente a mano per pochi secondi.
12. Leggere l'assorbanza a 615 nm mediante spettrofotometria.

Risultati

Risultati sono stati ottenuti da 5 a 10 esperimenti indipendenti.

Morfologia cellulare

AA / GP trattati con cellule primarie hanno caratteristiche prevalentemente di ciottoli simili, caratteristici degli osteoblasti maturi. Cellule ramificate intervallati (come indicato dalle frecce rosse in figura 1A) possono essere trovati, che probabilmente rappresentano alcuni osteocytes.

Con il trattamento ATRA, le cellule in rapida in...

Discussione

Negli ultimi anni il osteociti è emerso come la cella più centrale nell'osso. Progressi della ricerca stanno progressivamente rivelando un certo numero di proprietà osteociti insospettabili o non provati, che sono di enorme valore per la progettazione di nuovi e migliore trattamento per una varietà di malattie delle ossa. Tuttavia, indagini di biologia osteociti è stato colpito dalla limitata disponibilità di modelli in vitro a tal punto che osteoblasti sono state usate come cellule surrogati per un l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37 °C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37 °C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
Microscope	Zeiss Apotome
Spectrometer	Safas Xenius