High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Riepilogo

Funzione di misura anticorpo è la chiave per comprendere l'immunità a malaria da Plasmodium falciparum. Questo metodo descrive la purificazione di merozoiti vitali, e la misurazione di opsonizzazione-dipendente fagocitosi mediante citometria di flusso.

Abstract

Plasmodium falciparum antigeni merozoite sono in fase di sviluppo come potenziali vaccini contro la malaria. Un aspetto di immunità contro malaria è la rimozione di merozoiti liberi dal sangue da parte delle cellule fagocitiche. Tuttavia valutare l'efficacia funzionale di anticorpi specifici opsonizzante merozoite è impegnativo a causa della breve emivita del merozoiti e la variabilità dei fagociti primarie. Descritto in dettaglio in questa sede è un metodo per la generazione di merozoiti vitali usando l'inibitore della proteasi E64, e un saggio di merozoite opsonina-dipendente fagocitosi utilizzando la linea cellulare pro-monocitica THP-1. E64 previene la rottura schizonte consentendo lo sviluppo di merozoiti che vengono rilasciati da filtrazione di schizonti trattati. Merozoiti etidio bromuro sono etichettati opsonizzati con campioni di plasma umano e aggiunti a cellule THP-1. La fagocitosi è valutata da un protocollo standardizzato alto rendimento. Merozoiti vitali sono una risorsa preziosa per la valutazione numerAspetti DIVERSI DI P. biologia falciparum, compresa la valutazione della funzione immunitaria. Livelli anticorpali misurati da questo test sono associati con l'immunità alla malaria clinica in individui naturalmente esposti. Il dosaggio può anche essere utile per valutare gli anticorpi vaccino ha indotto.

Introduzione

L'importanza di anticorpi per l'immunità di malaria da Plasmodium falciparum è stato mostrato 40 anni fa, quando immunoglobulina dagli adulti iperimmuni è stato passivamente trasferito a bambini affetti da malaria grave con conseguente malattia alleviato ^1. Di conseguenza, ha cercato notevole sforzo per identificare gli obiettivi di protezione dell'immunità malarica, principalmente attraverso la misurazione titoli anticorpali di peptidi o proteine ​​in batteri espresse da ELISA. Sierologia basato ELISA ha anche dimostrato molto variabile tra gli studi, e non affronta la funzionalità anticorpale ^2. Molti antigeni malaria inducono una IgG1 cytophilic e IgG3 profilo di anticorpi, in particolare gli antigeni di superficie merozoite ^3. Questo pregiudizio sottoclasse suggerisce che l'anticorpo-Fc-recettore (CFR) interazioni con i fagociti sono importanti per le funzioni effettrici delle opsonizzare anticorpi antimerozoite ^4. Diversi vaccini antigene merozoite in fase di sviluppo sono progettati persuscitare funzioni effettrici fagocita ^{5, 6} e sebbene evidenze significative per l'importanza delle interazioni anticorpo-FCR in modelli di roditori malaria esiste ^7-9, e alcuni studi recenti sostengono l'importanza di anticorpi funzionali e funzioni dei fagociti effettrici dell'immunità malaria nell'uomo ^{10, 11,} questa zona rimane poco studiato. Studio sulle anticorpi specifici opsonizzante merozoite è stato limitato da due fattori; la difficoltà di isolare merozoiti buona qualità; e le risposte fagocitosi variabili da cellule primarie.

Fino a poco tempo, centrifugazione ad alta velocità o densità Percoll gradienti sono stati utilizzati per isolare merozoites da surnatanti di coltura di rottura culture schizonte. Questi merozoiti raramente erano vitali, e spesso ulteriormente manipolati da centrifugazione densità e di lavaggio più passaggi ^12, o la crioconservazione ¹¹ prima dell'uso in saggi. Questi processes potenzialmente staccano molte proteine ​​associate perifericamente dalla superficie merozoite, proteine ​​note per essere bersagli antigenici di immunità malarica ^13. Recentemente l'inibitore cisteina proteasi trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) è stato usato per generare merozoiti vitali. E64 previene la rottura schizonte, generando membrana chiusa merozoites ^14, che possono essere interrotti per filtrazione per liberare merozoites vitali ^{15, 16.} Questa tecnica ha portato alla risoluzione spaziale di numerose proteine ​​durante eritrociti invasione ^{15, 17-19} e ha chiarito l'effetto specifico stadio di numerosi farmaci antimalarici ^{16, 20.} Tuttavia, la generazione di merozoiti vitali rimane tecnicamente difficile. Per facilitare la diffusione di questa tecnica e applicazione di saggi funzionali di immunità, un protocollo dettagliato per la purificazione vitale merozoite e il loro utilizzo in unsaggio funzionale standardizzata di anticorpi: cooperazione cellulare in opsonizzazione e fagocitosi è descritto qui.

Questa tecnica dimostra un significativo passo avanti rispetto alle precedenti saggi in vitro di merozoite opsonization, come neutrofili scoppio respiratorio, Antibody Dependent Cellular inibizione (ADCI), e saggi merozoite fagocitosi alternative. Questi test sono scarsamente riproducibile a causa di variazione ingressi parassita e l'attività dei fagociti primarie ^{11, 21.} Contaminanti hemozoin può anche influenzare profondamente la funzione dei fagociti ^22. Un recentemente riportato robusto e riproducibile merozoite fagocitosi dosaggio ²³ utilizza la linea cellulare promonocytic THP-1 ^24. Si tratta di un tipo di cellula ideale per saggi flusso elevato throughput citometria com'è non aderente e specificamente esegue Fc-Receptor fagocitosi mediata ^{25, 26.} Un ulteriore complessità, mentre investitoritigating fagocitosi è che il grado di fagocitosi dipende dal numero di merozoiti relativi a cellule THP-1 e la concentrazione plasmatica. Per garantire la riproducibilità tra esperimenti, merozoites devono essere enumerati e una concentrazione definita utilizzati. A causa delle loro piccole dimensioni, il flusso è necessaria la quantificazione citometria.

La procedura qui descritta rimuove hemozoin e genera merozoiti vitali, e descrive l'applicazione di questi merozoiti per citometria a flusso conteggio di merozoiti seguita da opsonizzazione e fagocitosi. Anche se tecnicamente impegnativo, le tecniche descritte possono essere utili a chiarire il contributo delle risposte anticorpali specifiche di superficie merozoite per acquisita naturalmente e vaccino indotto l'immunità.

Protocollo

NOTA: Tutte le fasi, oltre a centrifugazione e citometria a flusso, devono essere eseguiti entro una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità. Assicurarsi che siano prese opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione dei campioni umani. Il test è molto sensibile per piccole quantità di plasma. Le diluizioni previste sono ottimali per la risoluzione delle risposte che vanno 5-78% con il plasma dai bambini semi-immuni da Papua Nuova Guinea (PNG). La diluizione ottimale può variare con i set di plasma in fase di test, e perciò si raccomanda che il plasma essere titolato per determinare le condizioni sperimentali per ciascuna applicazione. Garantire l'inserimento di due controlli negativi cellule THP-1 con merozoites in assenza di plasma; e cellule THP-1 con merozoites opsonizzati con un pool di plasma da malaria persone ingenue. Ciò consentirà di controllo per merozoite aderenza alla cellule THP-1 e per consentire rigorosa citometria a flusso gating di eventi fagocitosi.

L'uso di campioni di plasma PNG eraapprovato dal Comitato di Medical Research Advisory, Papua Nuova Guinea Ministero della Salute, il Walter e Eliza Corridoio Comitato di Etica umano della ricerca (numero di progetto 04/04). Il consenso scritto è stato ottenuto da genitori / tutori di tutti i partecipanti.

1. THP-1 Cultura

1. Mantenere la linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreno RPMI-1640 integrato con siero di vitello fetale al 10% (FCS) e 55 mM 2-mercapthoethanol (THP-1 medium) ed a 37 ° C in un incubatore umidificato CO ₂ 5%.
2. Mantenere le cellule ad una densità inferiore a 5 x 10 ⁵ cellule / ml. NOTA: Overgrowth si tradurrà in differenziamento in cellule aderenti e down-regulation dei recettori Fc. Una volta che le cellule sono state fatte passare circa 10 volte, scongelare un nuovo flacone di mantenere fenotipo cellulare.

2. Preparazione del campione anticorpo e diluizione

1. Il calore inattivare il plasma da testare e plasma di controllo della malaria-naïve incubando a 56 °; C per 30 min
2. Serialmente diluire campioni di plasma a 1/2, 000 in THP-1 medium.
3. Conservare il plasma diluito a -20 ° C.

3. Cultura altamente sincronizzata P. falciparum

NOTA: La linea parassita-GFP che esprimono D10-PfPHG ²⁷ è stato utilizzato per la sua 48 ore ciclo di vita che aiuta la sincronizzazione dei parassiti e la tempistica controllata di E64 aggiunta. Inoltre, perché questa linea esprime GFP nel citoplasma, questa linea permette di rilevare parassitemia e merozoiti gratuiti da rilevamento mediante citometria a flusso di GFP. Tuttavia, l'intensità di fluorescenza GFP non è sufficiente a fornire la visualizzazione all'interno di cellule THP-1, e quindi, merozoiti sono contrastate con etidio bromuro (EtBr). Altri ceppi di parassiti possono essere utilizzati, a condizione che la sincronia stretto è realizzabile. Sincronizzare i parassiti utilizzando una combinazione di trattamento sorbitolo per lisare forme mature ²⁸ e eparina per inibire l'invasione ¹⁵ .

1. Mantenere P. falciparum parassiti in O + eritrociti umani (RBC) al 3% di ematocrito in terreno RPMI-1640 (pH 7,4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ipoxantina ml, 10% di siero umano riunito, 2 mg / bicarbonato di sodio ml, e 20 mg / ml di gentamicina (Parasite medio). Aggiungere 5 mg / ml Blasticidin S-cloridrato al mezzo di coltura di selezionare per GFP + parassiti.
2. Incubare culture in scatole a tenuta d'aria o fiasche di coltura alternativa doppia tenuta a 37 ° C in atmosfera di 1% O _2, 4% di CO ₂ e il 95% N _2.
3. Preparare vetrini striscio sottile, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchia con il 10% di soluzione di Giemsa a 6,7 ​​mM (pH 7.1) tampone fosfato (soluzione Giemsa) per 10 min per monitorare parassitemia. Dopo la colorazione, sciacquarlo in acqua e aria secca. Valutare parassitemia con un obiettivo a immersione in olio 100X.
4. Mantenere culture parassita in un parassitemia di sotto del 5% RBC infetto dividendo culture e aggiungendo infettoRBC come richiesto.
5. Per la sincronizzazione con eparina, aggiungere 20 UI / ml di medico-grado eparina a squillare stadio culture.
6. Quando la maggior parte dei parassiti sono in fase schizonte, le cellule pellet a 300 xg per 5 minuti, togliere medio contenenti eparina e risospendere in mezzo parassita per consentire la rottura schizonte e merozoite invasione.
7. Dopo 4 ore, aggiungere 20 UI / ml di eparina torna a culture, bloccando ogni ulteriore invasione merozoite. NOTA: Diversi cicli di sorbitolo e trattamento con eparina può essere richiesto prima che i parassiti sono sufficientemente sincronizzati. Per generare numeri adeguati di merozoiti, preparare 150 ml di cultura parassita al 3-5% parassitemia.

4. Isolamento di fase avanzata P. falciparum Trofozoiti

1. Trentasei ore dopo il ritorno eparina a culture, pellet cellule in coltura a 300 xg per 5 minuti, e risospendere pellet in mezzo parassita al 25% di ematocrito.
2. Attaccare una grande colonna magnetica (volume matrice di 6,3ml) ad un magnete, ed equilibrare la colonna con mezzo parassita, assicurandosi tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
3. Aggiungere il P. risospeso cultura falciparum alla colonna, e regolare la velocità di flusso di una goccia al sec.
4. Una volta che la cultura è passato attraverso la colonna, lavare la colonna con il mezzo parassita fino a quando il flow-through è pulita.
5. Parassiti eluire dalla colonna in 30 ml di 37 ° C media parassita.
6. Preparare uno striscio sottile di parassiti, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchiare con la soluzione Giemsa per 3 min. Esaminare il vetrino sotto il microscopio, e garantire che i parassiti quasi riempire il globulo rosso, e sembrano essere nelle fasi iniziali schizonte. Se i parassiti non hanno raggiunto la fase di maturazione appropriato, ritorno parassiti purificati ad un incubatore a 37 ° C in atmosfera di 1% O _2, 4% di CO ₂ e il 95% N ₂ fino adeguatamente sviluppato. NOTA: purezza superiore al 90% infette globuli rossi è necessaria per garantire RBCs Non contaminare le preparazioni merozoite.
7. Trattare schizonti isolati con 10 pM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 guanidino) butano (E64) per 6-10 ore. NOTA: i tempi di incubazione più lunghi con E64 sono possibili, ma i merozoiti prodotti non saranno più invasivi.

5. Isolamento di P. falciparum merozoiti

1. Dopo l'incubazione con E64, striscio parassiti, fissare le cellule in 100% di metanolo, e macchia con soluzione Giemsa per valutare la formazione di merozoiti membrana chiusa. NOTA: Una buona resa di merozoiti sarà ottenuta se superiore al 50% dei parassiti si sono formate membrana merozoiti chiusi.
2. Schizonti Pellet E64-trattato a 1.900 xg per 8 min. Lavare con 50 ml di RT mezzo RPMI-1640 (pH 7.4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml ipoxantina, 2 mg / ml di bicarbonato di sodio, e 20 ug / ml di gentamicina (lavare medio) per rimuovere i residui di siero umano .
3. Risospendere il pellet in 2 ml di terreno di lavaggio. NOTA: Utilizzando FCS contenenti THP-1 media produrrà la formazione di schiuma durante la filtrazione.
4. Filtrare i 2 ml di risospesa E64-schizonti attraverso un filtro a siringa da 1,2 μm/32 mm. Raccogliere il filtrato in una provetta da 10 ml. NOTA: Il filtrato contiene merozoites e cristalli hemozoin, con schizonti non-rottura e detriti raccolti nel filtro.
5. Attaccare una piccola colonna magnetica ad un magnete, ed equilibrare con 500 microlitri THP-1 medium.
6. Passare il filtrato sopra la colonna magnetica. Raccogliere il flow-through. NOTA: hemozoin si legherà alla colonna, mentre merozoites passeranno attraverso.
7. Passare il flow-through sopra la colonna altre due volte per rimuovere hemozoin, raccogliendo il flusso attraverso ogni volta.
8. Lavare la colonna con 2 ml di RT THP-1 media per raccogliere eventuali merozoiti rimanenti.
9. Aggiungere EtBr a 10 pg / ml (concentrazione finale) e colorazione per 30 minuti a RT. Proteggere dalla luce per evitare photobleaching. Nota: assicurarsi che tutto il liquido e p EtBr contaminatirifiuti lastic vengono smaltiti in modo adeguato per le sostanze chimiche citotossiche. Merozoiti non sono più invasive termine dell'incubazione.
10. Spin down merozoiti a 4.000 xg per 10 min.
11. Gettare il surnatante in apposito contenitore per rifiuti.
12. Risospendere merozoite pellet in 4 ml THP-1 media e spin down a 4000 xg per 10 min.
13. Aggiungi THP-1 media fino a un volume di 15 ml, e proteggere dalla luce.

6. Quantificare merozoite Concentrazione mediante citometria di flusso

1. Portare il conteggio perline per RT.
2. Preparare PBS con 0,5% BSA per diluire merozoiti.
3. Conte merozoiti a 3 diluizioni; 1 a 100; 1 a 50 e 1 a 25. Preparare provette 3 FACS con 940, 930 e 910 microlitri di PBS +0,5% BSA, rispettivamente. Aggiungere 10, 20 e 40 pl di merozoiti purificati per provetta, rispettivamente.
4. Perle di conteggio Vortex per 30 secondi, e aggiungere 50 ml di perline per tubo FACS contenente merozoiti diluiti.
5. Eseguire i tre dilcampioni merozoite decentrate su un citometro a flusso dotati di un laser a 488 nm. Impostare un cancello rigoroso per merozoiti basato su EtBr e fluorescenza GFP doppia fluorescenza, e il conteggio cancello beads di fluorescenza in un canale separato. Acquisire gli eventi fino a 2.000 perline vengono raccolti. Nota: Queste istruzioni si riferiscono a contare GFP + merozoiti che sono stati contro-colorate con EtBr. Se non utilizzano GFP che esprimono parassiti quindi impostare porte merozoite basati su side scatter e EtBr fluorescenza.
6. Determinare il rapporto di merozoiti: perline dividendo il numero di eventi merozoite dai 2.000 eventi tallone conteggio, calcolare un rapporto per ogni diluizione. Utilizzare le specifiche lotti tallone conteggio per determinare il numero di perle in 50 ml di perline aggiunti per provetta.
7. Moltiplicare il numero di perline in 50 microlitri per il fattore di diluizione e dal merozoite: branello rapporto per tale fattore di diluizione. Questo numero corrisponde alla concentrazione di merozoiti per ml. Eseguire thESE passaggi per ogni diluizione.
8. La media delle concentrazioni misurate merozoite tutti e tre diluizioni. NOTA: Le deviazioni standard superiori al 10% per le concentrazioni stabilite per 1 in 100, 1 in 50, e 1 su 25 diluizioni indicano imprecisioni tecniche di preparazione dei campioni di conteggio.
9. Risospendere merozoiti a 8 x 10 ⁶ / ml merozoiti in THP-1 medio per garantire un rapporto finale di quattro merozoiti per THP-1 cella. NOTA: Altro merozoite di THP-1 ratio può essere usato, e concentrazioni devono essere modificati di conseguenza.

7. Fagocitosi Assay

1. Aggiungere 200 ml di calore FCS inattivi per pozzetto di 96 piastre ben inferiori a U, e lasciare a RT O / N per bloccare le piastre. Dopo l'incubazione, rimuovere FCS e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS sterile. Rimuovere PBS e le piastre conservare a 4 ° C fino al momento.
2. Calcolare il numero di cellule THP-1 necessarie per analizzare campioni di plasma e controlli, permettendo pozzetti in triplicato per campione a 1 x 10 ^{5 THP-1 le cellule per pozzetto.}
3. Determinare THP-1 concentrazione cultura caricando 10 ml di coltura su un vetrino emocitometro. Contare il numero di cellule presenti in 4 gruppi di 16 quadrati angolari della emocitometro sotto un microscopio, poi la media dei conteggi. Moltiplicare il conteggio medio da 10.000 a calcolare il numero di cellule per ml.
4. Centrifugare il numero di cellule THP-1 a 500 xg per 5 min, e risospendere a 6.7 x 10 ⁵ cellule / ml in THP-1 medium.
5. Aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 in THP-1 medium per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti con fondo a U, con conseguente 10 ⁵ cellule / pozzetto. Preparare 3 pozzetti per campione che saranno testati. Piastra Ritorno al incubatore fino al momento di aggiungere merozoiti.
6. Aggiungere 150 ml di preparazione merozoite a 8 x 10 ⁶ / ml per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti fondo U-separato. Preparare un pozzetto per ogni campione testato
7. Aggiungere 10 ml di campioni di plasma preparati diluiti per bene, per tegli piastra che contiene i merozoiti, e mescolare bene per garantire la soluzione omogenea.
8. Rimuovere la piastra THP-1 dal termostato, e aggiungere 50 ml di soluzione di merozoite / plasma per pozzetto contenente cellule THP-1, con pozzetti in triplicato per ogni campione di plasma.
9. Mescolare bene e incubare a 37 ° C in 5% di CO _2, incubatore umidificato per 40 min. Coprire con un foglio per proteggere dalla luce.
10. Dopo 40 min, campioni di centrifugazione per 5 min a 500 xg in una 4 ° C prechilled centrifuga ad arrestare fagocitosi.
11. Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte in PBS freddo +0,5% BSA 2 mM EDTA (buffer FACS). NOTA: EDTA faciliterà nel mantenere una sospensione singola cella per citometria a flusso.
12. Fissare le cellule in 90 ml di 2% paraformaldeide (PFA) in PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fissativo). Lasciare in ghiaccio fino all'acquisizione, al riparo dalla luce.

8. Citometria a Flusso

1. Acquisire i campioni utilizzando un citofluorimetro wi attrezzatath un laser a 488 nm e throughput elevato lettore di piastra di fissaggio. NOTA: Ciò consentirà fino a 400 campioni di plasma da analizzare da una preparazione merozoite. Le cellule possono anche essere trasferiti in provette per uso caricamento del campione.
2. Cancello vitali cellule THP-1 di avanti e scatter laterale.
3. Impostare il cancello positivo EtBr basato sulle 'cellule THP-1 con merozoites e senza plasma' di controllo.
4. Acquisire un minimo di 10.000 eventi per campione.

9. Analisi dei dati

1. Analizzare i dati in citometria a flusso software di analisi, e impostare porte stringenti per gli eventi positivi EtBr.
2. Calcolare la fagocitosi percentuale per ogni campione: la% di EtBr + cellule per campione meno le cellule positive% con plasma non immune.
3. Risultati medi in tutta triplicati. NOTA: le deviazioni standard per un triplice copia in eccesso del 10% indicano imprecisioni sperimentali. Alcuni retroscena eventi EtBr positivi possono essere osservati a seguito di merozoiTE adesione alla superficie di cellule THP-1, ma dovrebbe essere costante per tutti i campioni contenenti merozoiti. Impostazione del cancello sulla base delle «cellule THP-1 con merozoites e nessun plasma 'di controllo, e sottraendo qualsiasi sfondo delle' cellule THP-1 con i non-immune plasma 'di controllo si tradurrà in% fagocitosi che riflette la fluorescenza a causa interiorizzato / fagocitati solo merozoiti.

Risultati

La fase di maturazione dei parassiti prima del trattamento E64 è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. Figura 1AI mostra il grado di maturazione appropriato di schizonti per l'aggiunta E64. I parassiti dovrebbero essere grandi e quasi riempire il globulo rosso. Un aspetto maculato di Giemsa indica merogonia è iniziato, e E64 dovrebbe essere aggiunto per produrre merozoiti membrana chiusa (Figura 1Aii). Se si aggiunge E64 in precedenza per trofozoita parassiti teatrali, membrana merozoites chiusi non vengono generati anche dopo 12 ore di E64. Invece parassiti assumono morfologia anormale come l'allargamento del vacuolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoiti non si formano. Se E64 è aggiunto in seguito per schizonti, merozoites membrana chiusa non vengono generati come rottura schizonte è disinibita (Figura 1CI e 1Cii). Occorre un elevato livello di parassita sincronia, altrisaggio una serie di tre risultati descritti si vedrà dopo il trattamento E64.

Rimozione di hemozoin è un altro passo fondamentale per merozoiti purificazione. Se merozoiti non vengono purificati da hemozoin allora cluster merozoite-hemozoin forma che non può essere sloggiato da pipettaggio. Questi aggregati eseguiti sul citometro come singoli eventi, anche se con diverse caratteristiche forward-scatter e side-scatter di singoli merozoiti, con conseguente imprecisa conteggio merozoite mediante citometria di flusso (Figura 2A). Come cellule THP-1 possono anche fagocitare hemozoin, questi cluster merozoite-hemozoin possono anche essere fagocitati (Figura 2B). Questi aggregati sono fluorescenti altamente EtBr in quanto contengono più merozoiti. Fagocitosi dei risultati aggregati in un profilo EtBr fluorescenza THP-1 equivalente a quello osservato per la fagocitosi di più singoli merozoiti. Quindi, se hemozoin non viene rimosso, la fluorescenza EtBr di cellule THP-1 sarà un overestimate del potenziale opsonizzante per il plasma in prova. Hemozoin è anche riferito di alterare significativamente la funzione dei fagociti. GFP merozoiti positivi sono bancone colorati con EtBr per aumentare la visualizzazione di merozoiti fagocitati da cellule THP-1. Utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo, tutti merozoiti GFP positive sono contrastate con EtBr che ha una intensità di fluorescenza più luminoso (Figura 3A). Valutazione fagocitosi da EtBr fluorescenza permette una risoluzione superiore di merozoite fagocitosi di fluorescenza GFP (Figura 3B).

Il numero di merozoiti aggiunte al saggio sarà modulare la quantità di fagocitosi osservato. Per questo motivo, un conteggio preciso mediante citometria a flusso è critica. Aumentando rapporti di merozoiti: THP-1 si tradurrà in maggiore aderenza dei merozoiti di cellule THP-1 in assenza di plasma (Figura 4A). Aumentare merozoite: THP-1 ratio si traduce anche in una maggiore phrisposte agocytosis quando merozoiti sono opsonizzati (Figura 4B). A 4:01 merozoite: THP-1 ratio è raccomandato per le risposte fagocitosi robuste. Usando questo rapporto, e la diluizione del plasma indicato, questo test è in grado di risolvere bassi, intermedi e alti livelli di anticorpi opsonizzante. Tra 0 e 78 per cento di risposte fagocitosi sono state osservate utilizzando campioni di plasma PNG e le altre condizioni descritte. Tali risposte sono state recentemente dimostrato di associarsi con l'immunità clinica acquisita naturalmente alla malaria ^10. Figura 5 mostra esempi di 4 quartili di risposte fagocitosi da privati ​​PNG.

Figura 1. Tempi della E64 Inoltre è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. (A) maturatio appropriato. n fase di parassiti i) prima del trattamento E64, e ii) merozoiti membrana chiusa prodotti dopo 6 ore di trattamento E64 (B) membrana merozoites chiusi non vengono generati se E64 viene aggiunto ai parassiti immaturi; i) trofozoiti tardivamente, e ii) dopo 12 ore di E64 (C) schizonte la rottura non è inibito se E64 è aggiunto segmentato in ritardo schizonti.; i) schizonti fase avanzata, e ii) dopo 6 ore di E64. Barra della scala rappresenta 10 micron.

Figura 2. Rimozione hemozoin è fondamentale per generare una sospensione merozoite cella singola. Aggregati merozoite-hemozoin formano a seguito di filtrazione a membrana merozoiti chiusi, a meno che hemozoin è magneticamente separato dal merozoiti. (A) Forward-scatter e side-scatter appezzamenti di merozoiti con hemozoin rimossoe hemozoin mantenuto. (B) aggregati hemozoin-merozoite possono essere fagocitati dalle cellule THP-1. Diff-Quick colorati diapositive cito spin di cellule THP-1 incubati con PNG plasma opsonizzati preparazioni merozoite con o senza hemozoin. Barra della scala rappresenta 10 micron.

Figura 3. Colorazione con etidio bromuro consente per la risoluzione superiore di merozoite fagocitosi. D10-GFP merozoites purificate sono di contrasto con EtBr per migliorare intensità di fluorescenza. (A) citometria a flusso histrogram di merozoiti purificati con gating su GFP merozoites positivi, e una macchia dot mostra EtBr fluorescenza all'interno di questa popolazione GFP positive gated. (B) scatter in avanti rispetto GFP e scatter in avanti rispetto EtBr di cellule THP-1 a seguito fagocitosi di merozoiti fluorescenti dual GFP e EtBr. Gates sono stati d Rawn basato sulle cellule THP-1 con merozoiti e nessun controllo di plasma.

Figura 4 Il merozoite:. THP-1 ratio influisce sul grado di fagocitosi osservato. (A) Cinque merozoite: THP-1 ratio sono raffigurate; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Solo le cellule di controllo indica fluorescenza di fondo a causa di cellule THP-1. THP-1 EtBr fluorescenza per ciascun rapporto è indicato per merozoites opsonizzati con un pool di plasma o PNG con il plasma non immune australiano (B) Media fluorescenza intensità di cellule THP-1 per diverso merozoite:. THP-1 ratio, e opsonization con piscina di PNG plasma o plasma non immune australiano (media + SEM). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Un'ampia gamma di anticorpi opsonizzante può essere misurata. Merozoiti stati opsonizzati con plasma da individui PNG e incubati con cellule THP-1. Vengono mostrati quattro risposte fagocitosi rappresentativi. Gates sono state elaborate sulla base di cellule THP-1 con merozoites e nessun controllo di plasma e numeri indicano la fagocitosi% dopo la sottrazione delle cellule THP-1 con controllo di plasma non-immune. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Per misurare merozoite fagocitosi, conoscenza di due tecniche è necessaria: purificazione di merozoiti e THP-1 test fagocitosi. I passaggi più critici per la combinazione di queste due tecniche sono le seguenti: 1) i parassiti altamente sincronizzati; 2) Aggiunta di E64 al momento giusto per produrre membrane merozoites chiusi; 3) Rimozione hemozoin per evitare aggregati; 4) Accurate conteggio merozoite mediante citometria di flusso; 5) la diluizione del plasma utilizzato; e 6) mantenendo bassa densità cellulare e numero passaggio di cellule THP-1. Un'attenta considerazione di questi aspetti fondamentali garantirà risposte fagocitosi robuste siano rispettate.

Sebbene, qui descritto è la preparazione di merozoiti per valutare la fagocitosi, la tecnica può essere utilizzata per una vasta gamma di applicazioni. Indipendentemente dalla metodologia a valle, preparazioni ottimali merozoite dipendono temporizzazione corretto E64 aggiunta per generare merozoiti. Il metodo qui descritto E64 ha dimostrato di yield merozoiti invasive per l'uso in microscopia ad alta risoluzione degli eventi di invasione e di saggi di sensibilità ai farmaci ^15-20. Mentre la redditività merozoite non è essenziale per la fagocitosi, è necessaria l'integrità del rivestimento superficiale merozoite. Pertanto, il metodo E64 qui descritto consente merozoites alta qualità per essere prodotto per valutare la risposta anticorpale al rivestimento superficiale. Come illustrato in Figura 1, se E64 viene aggiunto troppo presto o membrana merozoiti chiusi troppo tardi non si formano. Per questo motivo, sono necessarie culture parassita altamente sincroni. Qui, l'uso di trattamenti sorbitolo e eparina a stretto sincronizzare culture parassita D10-GFP ad una finestra di 2 ore è descritto. L'eparina può promuovere gametocytogenesis in altri laboratori isolati, e quindi deve essere usato con cautela. Metodi di sincronizzazione alternativi come alanina possono anche essere utilizzati purché parassiti ben sincronizzati vengono prodotti ^29. Se E64 viene aggiunto ai parassiti asincroni, un puntello più bassoortion di merozoiti membrana chiusa sarà prodotto e rimanendo parassita-infetti RBC sarà o rottura normalmente o sviluppare morfologia anormale. La presenza di parassiti che non hanno sviluppato in membrana racchiuso merozoiti comporterà intasamento del filtro e ridurre significativamente la resa merozoite ottenuto.

Durante la filtrazione di merozoiti membrana chiusa, hemozoin è liberato dai vacuoli digestivi ed è presente come cristalli liberi in soluzione. Hemozoin è altamente pro-infiammatorio ed è stato segnalato per modulare monociti e macrofagi fagocitosi risposte ^{30, 31.} Oltre a modulare la fagocitosi, come mostrato nella Figura 2, hemozoin può formare aggregati merozoiti in soluzione. Come cellule THP-1 possono fagocitare questi aggregati, questo può essere un confounder importante per la risoluzione di anticorpo fagocitosi mediata. Pertanto, la rimozione di hemozoin è necessario in questo saggio di avoid complessità di hemozoin su phagocyte biologia. Inoltre, la mancata rimozione hemozoin può anche essere deleterio quando si utilizza questa tecnica per generare merozoiti libero per altre applicazioni, specialmente dove è richiesta merozoite quantificazione.

Come illustrato nella Figura 4, il numero di merozoiti aggiunto al dosaggio può influenzare il grado di fagocitosi da cellule THP-1. Anche se citometria a flusso consente l'enumerazione di concentrazione merozoite, attenta pipettaggio e replicare conti di merozoiti sono necessarie per migliorare la precisione. Ciò è particolarmente importante se più linee parassiti vanno testati side-by-side. È stato precedentemente dimostrato che il plasma dai bambini semi-immuni da PNG può essere notevolmente diluito prima risposte declino ^23. Descritto qui è la diluizione ottimale di plasma (1/120, 000 diluizione finale di plasma) per una coorte di 5-12 anni i bambini PNG che ha prodotto la vasta gamma di phagocyt. risposte OSIS descritte nella Figura 5 Questa gamma ha permesso per la stratificazione delle risposte in quattro gruppi (0-19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% fagocitosi), e il modello di regressione ha rivelato che le risposte opsonizzante sono stati associati con protezione dalla malattia clinica e ad alta densità parassitemia ¹⁰ Per diverso coorte studi può essere necessario regolare la diluizione del plasma per garantire la fagocitosi da cellule THP-1 non è saturo o al di sotto del livello di rilevazione.

Citometria a flusso permette fagocitosi veloce e quantificabile con una migliore precisione in microscopia. Questo protocollo è un alto rendimento, piatto a base di e automatizzata acquisizione di piastre a 96 pozzetti per studiare acquisita naturalmente immunità umorale. Il metodo richiede la colorazione di merozoiti con etidio bromuro, macchie DNA tuttavia alternative come SybrGreen, DAPI e propidio iodio, macchie o macchie proteine ​​di membrana potrebbero essere utilizzati. Questo test potrebbe essere suscettibile di Primarmonociti e neutrofili y, e potrebbero essere adattati se fagociti o FcR biologia sia di interesse. Cellule primarie o cellule THP-1 differenziate in vitro con PMA possono essere utilizzati per studiare la fagocitosi in malaria e altri agenti patogeni ^{12, 32-34.} Tuttavia utilizzando cellule primarie può essere impegnativo in quanto queste cellule sono aderenti e anche la visualizzazione non-mediata anticorpo fagocitosi ^35. Inoltre, la variabilità in purezza, vitalità e funzionalità sono alcune limitazioni chiave per l'uso di cellule fagocitarie primarie. I recettori Fc coinvolti nella fagocitosi merozoite rimangono uncharacterized, e quindi utilizzando anticorpi bloccanti a specifici recettori Fc potrebbe chiarire il contributo di ciascun recettore Fc per merozoite fagocitosi. Come THP-1 fagocitosi è FcR dipendente, questo permette interpretazione semplice della fagocitosi osservata. Questo test si presta anche ad affrontare la specificità antigenica dei opsonizzare anticorpi che potrebbero essere raggiunte da utilizing parassiti knock-out per gli antigeni di superficie merozoite, oppure utilizzando anticorpi umani purificati affinità per merozoite proteine ​​di superficie. Inoltre, in studi approfonditi di risposte citochine seguenti merozoite fagocitosi mancano, e potrebbero essere raggiunti da questo test.

Queste due tecniche costituiscono notevoli progressi allo studio degli anticorpi antimerozoite funzionali. La purificazione di merozoiti di alta qualità è vantaggioso utilizzare merozoites crioconservati, o microsfere fluorescenti rivestiti con antigeni merozoite. Sebbene questo test è stato utilizzato come strumento di valutazione immunità acquisita naturalmente, può rivelarsi uno strumento importante per affrontare l'acquisizione di immunità in risposta alla vaccinazione. Mentre è stato recentemente dimostrato che la fagocitosi o merozoiti opsonised è associato con protezione da malaria clinica, non è possibile trarre conclusioni dirette dal vitro THP-1 fagocitosi in vivo phagocytosis di merozoiti la fagocitosi in questo saggio si verifica in condizioni statiche e in assenza di competere globuli rossi. I possibili adattamenti di questo test può quindi fornire uno strumento versatile per una maggiore comprensione della malaria e merozoite fagocitosi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1 cell line	American Type Culture Collection	TIB-202
RPMI-1640	Gibco	31800-089
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	10099-141
2-mercapthoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML	Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x)	Sigma	P0781
HEPES	SAFC	90909C	Cell culture grade
Hypoxanthine	Calbiochem	4010
Human Serum	Donation from Australian Red Cross		Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	1.06329.0500
Gentamycin	Pfizer	61022027	Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml)	Pfizer		Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	50-70-4
E64 Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	E3132-10MG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	98281-100G	Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20	Merck	10383.4G	Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck	1.09204.0500	1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm	Pall Life Sciences	4656
QuadroMACS Separator (for small column)	MACS Miltenyi BioTec	130-091-051	Interchangeable with MidiMACS
VarioMACS Separator (for large columns)	MACS Miltenyi BioTec	130-090-282
MACS MultiStand	MACS Miltenyi BioTec	130-042-303
LS Column (small magnetic column)	MACS Miltenyi BioTec	130-042-401
Large magnetic column	MACS Miltenyi BioTec	130-041-305
Ethidium Bromide	Bio-Rad	1510433	Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads	Invitogen	C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader	BD Biosciences
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software	Tree Star