Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Riepilogo

Pelle dei mammiferi contiene una gamma diversificata di strutture - come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose - che presentano modelli distintivi di organizzazione spaziale. Analizzando pelle come cavalcatura piatto approfitta della geometria 2-dimensionale di questo tessuto per produrre tutto spessore immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee.

Abstract

La pelle è un tessuto altamente eterogeneo. Strutture intra-dermiche includono follicoli piliferi, i muscoli erettore del pelo, specializzazioni epidermiche (come gruppi di cellule di Merkel), ghiandole sebacee, nervi e terminazioni nervose e capillari. La disposizione spaziale di queste strutture è strettamente controllata su scala microscopica - come si è visto, ad esempio, nella disposizione ordinata di tipi cellulari all'interno di un singolo follicolo pilifero - e su scala macroscopica - come visto dagli orientamenti quasi identiche di migliaia di capelli follicoli in una regione locale di pelle. Visualizzazione queste strutture senza sezionare fisicamente la pelle è possibile a causa della geometria 2-dimensionale di questo organo. In questo protocollo, dimostriamo che la pelle del mouse può essere sezionato, fisso, permeabilizzate, macchiato, e ha chiarito come un oggetto a due dimensioni intatte, un monte piatto. Il protocollo consente una facile visualizzazione delle strutture cutanee nella loro interezza attraverso l'intero spessore di grandi aree di pelle optsezionamento iCal e ricostruzione. Immagini di queste strutture possono essere integrate con le informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo.

Introduzione

La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria ^1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l'importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di afferenti (sensoriali) ed efferenti del nervo fibre (Figura 1). Diverse regioni del corpo sono associate caratteristicamente diversi tipi di pelle. Nella maggior parte dei mammiferi, quasi tutta la superficie corporea è coperto con la pelle che è densamente compresso con follicoli piliferi. [Gli esseri umani e talpe nude costituiscono deroghe al secoloè modello.] Capelli manca dalle superfici palmari delle mani e dei piedi, che sono anche associati con modelli specializzati epidermiche (dermatoglifi), ghiandole esocrine, e le terminazioni nervose sensoriali. Gli eventi cellulari e molecolari che controllano la crescita, la differenziazione e la disposizione spaziale delle cellule all'interno del follicolo pilifero sono di particolare interesse in quanto ogni follicolo mostre, in miniatura, molte delle caratteristiche centrali della organogenesi ^2. Queste funzionalità includono l'esistenza delle cellule staminali e una nicchia di cellule staminali, le migrazioni cellulari coreografati con precisione, e il montaggio di strutture multicellulari dai componenti embriologicamente distinte.

Questo articolo descrive i metodi per la dissezione, il fissaggio, l'etichettatura, e la pelle del mouse di imaging come un foglio bidimensionale intatta, indicato come un "tutto il monte" o "flat mount" di preparazione. Poiché la pelle mouse è relativamente sottile, è possibile immagine attraverso l'intero spessore di sci appiattitan usando la microscopia confocale convenzionale. L'approccio piatta monte all'imaging pelle del mammifero è tecnicamente vantaggioso perché evita il bisogno di sezionamento fisico, consentendo in tal modo strutture da ricostruire interamente sezionamento ottico. Poiché quasi tutta la pelle viene elaborato come un singolo oggetto, il piatto di montaggio approccio facilita anche l'imaging di più regioni della superficie del corpo, preservando informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo. Infine, le strutture all'interno della pelle sono tipicamente presenti nei modelli che si ripetono a intervalli regolari, facilitando così la raccolta di immagini da più rappresentanti di una data struttura. Queste caratteristiche sono familiari a neurobiologi che lavorano sulla retina, una parte bidimensionale del sistema nervoso centrale che gode di vantaggi analoghi per studi di morfologia neuronale ^3.

L'approccio montare piatto qui descritto è di utilit specialey per lo studio delle strutture che presentano organizzazione spaziale su scala relativamente grande sul piano bidimensionale della pelle. Un esempio di grande organizzazione spaziale è la polarità coordinata dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato capelli - gruppi di cellule di Merkel, muscoli muscolo piloerettore, ghiandole sebacee, e le terminazioni nervose ^4. Follicoli piliferi sono orientate ad un angolo rispetto al piano della pelle, e la componente del vettore follicolo che sia situato sul piano 2-dimensionale della pelle generalmente esibisce un orientamento rispetto agli assi del corpo che è preciso per ciascun posizione sul corpo. Ad esempio, i follicoli dei capelli sul punto di ritorno da rostrale a caudale e capelli sulla superficie dorsale dei piedi puntano da prossimale a distale. Capelli orientamento follicolo è controllato da segnali di polarità planare delle cellule (PCP, chiamato anche la polarità del tessuto ^5). Questo sistema di segnalazione è stato scoperto in Drosophila dove un piccoloinsieme di geni essenziali PCP è stata trovata per controllare l'orientamento di peli e cuticolare setole. Tre orthologues mammiferi di geni fondamentali PCP - omologhi frizzled 6 (Fzd6, noto anche come FZ6), caderina EGF LAG sette-pass G-recettore tipo 1 (Celsr1), e vang-like 2 (Vangl2) - svolgono ruoli analoghi in mammiferi pelle, coordinando gli orientamenti dei follicoli dei capelli con gli assi del corpo. Studi di FZ6 topi knockout (Fzd6 ^tm1Nat, di seguito denominato FZ6 ^{- / -)} mostrano che il difetto primario in assenza di segnalazione PCP è una randomizzazione iniziale o disorganizzazione dell'orientamento follicolo pilifero, senza alcun effetto sulla struttura intrinseca dei follicoli ^6-8. Un secondo sistema non-PCP agisce successivamente per favorire l'allineamento locale di follicoli vicini, che porta alla produzione di grandi schemi per capelli come spirali e ciuffi.

Un secondo esempio di grande scalaorganizzazione spaziale all'interno della pelle è visto nelle morfologie di pergole assoni sensoriali. Neuroni sensoriali che innervano la pelle hanno i loro corpi cellulari nella radice dorsale e gangli del trigemino. Questi neuroni rilevano temperatura, dolore, prurito, e vari tipi di deformazioni meccaniche che influiscono sulla pelle e capelli ^9. Essi possono essere suddivisi in sottotipi in base diametro dell'assone e velocità di conduzione, struttura terminale del nervo finale, e gli schemi di espressione dei recettori, canali e altre molecole. A causa della elevata densità di innervazione all'interno della pelle, analisi che coinvolgono visualizzare tutti assoni (ad esempio, immunocolorazione anti-neurofilamenti) o anche tutti assoni di una singola classe (come visto quando un singolo tipo di cellula è marcata mediante espressione di un reporter fluorescente) generalmente rivela una fitta sovrapposizione di assoni che rende impossibile definire la morfologia di un individuo Arbor. Per aggirare questo problema, abbiamo utilizzato molto radi geneticamente diretto lAbeling per produrre campioni di pelle dorsali in cui i singoli pergole assone ben isolate sono visualizzabili da espressione di un giornalista istochimica, fosfatasi alcalina placentare umano ^10. Questo approccio permette la visualizzazione inequivocabile delle singole morfologie assone pergolato e una definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali sulla base di criteri morfologici.

Protocollo

Questo studio è stato eseguito in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutti gli animali sono stati trattati secondo approvata la cura degli animali istituzionale e l'uso comitato (IACUC) protocollo MO11M29 delle istituzioni mediche del Johns Hopkins. Consultare le linee guida Istituzionale cura degli animali e uso comitato per i metodi approvati di eutanasia locali. Indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza quando si maneggiano fissativi aldeide o solventi organici.

1. Preparazione dei Materiali

1. Versare Piatti SYLGARD
   1. Seguire le istruzioni del produttore, mescolare il catalizzatore con la base, e mescolare con una bacchetta di plastica.
   2. Deporre circa 35 ml di liquido Sylgard per 10 cm di diametro tessuto piatto di coltura. Tissue Culture piatti sono più profondo i piatti batterici standard; ciò fornisce spazio verticale per i perni di insetti.
   3. Posizionare il dishes su una superficie orizzontale a temperatura ambiente per una notte. Bolle formatesi durante la miscelazione spariranno.
   4. Seguendo polimerizzazione, memorizzare le piastre Sylgard a temperatura ambiente.
      NOTA: le piastre SYLGARD possono essere conservati a temperatura ambiente per anni e riutilizzati più volte fino a quando il Sylgard stacca dalla piastra.
2. Soluzioni
   1. Benzil benzoato e alcool benzilico (BBBA). Mescolare 2 volumi benzile benzoato e 1 volume di alcool benzilico. Conservare al buio in una bottiglia di vetro con un tappo di vetro o teflon top.
      ATTENZIONE: Occasione BBBA deve essere opportunamente gestito come rifiuto solvente organico. Non permettere BBBA per contattare plastica.
   2. Soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 4 g PFA a 80 ml di acqua, aggiungere 0,1 ml 1 N NaOH, mescolate su un piatto caldo a ~ 70 ° C per ~ 5 minuti fino a quando il PFA è completamente sciolto, quindi aggiungere 10 ml 10x PBS e portare il volume a 100 ml con acqua.
      ATTENZIONE: L'inalazione di formaldeide / PFA e BBBA vapori dovrebbe essereminimizzato mantenendo queste soluzioni in contenitori coperti. Formaldeide / PFA è una sostanza cancerogena.
   3. Oil Red O. Preparare uno stock di 0,5% in isopropanolo. Immediatamente prima dell'uso diluire con acqua ad una concentrazione finale di 0,3% Oil Red O, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron.

2. Dissezione pelle, Fissazione, e Clearing

1. Dorsale pelle per Immunostaining e Melanina Imaging
   1. Per i più giovani topi (ad esempio, feti e giorno postnatale (PUP P) 0-P3), eutanasia il mouse per inalazione isoflurano. Euthanize topi più anziani per inalazione isoflurano o per iniezione ketamina / xylazina seguita da dislocazione cervicale.
   2. Rimuovere i capelli con un rasoio elettrico e gel per capelli rimozione. Per i topi di età inferiore P8, questo passaggio può essere saltato.
   3. Utilizzare una lama di rasoio per fare un taglio orizzontale dalla base della coda lungo ogni fianco, passando sul lato dorsale della base di ciascun arto, procedendo laterale alle orecchie e finezione al naso.
   4. Buccia delicatamente la pelle dal procedimento tessuto sottostante da posteriore ad anteriore mantenendo la pelle tra le dita guantate in modo che non venga pizzicato dalla pinza. Staccando la pelle a livello delle orecchie, tagliare le orecchie con un paio di forbici e procedere lentamente soprattutto come la pelle può strappare in questa posizione.
   5. Da questo punto in poi, orientare la pelle con la parte interna rivolta verso l'alto. Appunta la pelle per Sylgard con ~ 20 vie di insetti distribuiti uniformemente attorno alla periferia; non più di-tendere la pelle (Figura 2B). Coprire la pelle con 10-20 ml di PBS.
   6. Sezionare il grasso della pelle e del tessuto connettivo associato con pinze inclinate o curve con l'estremità appuntita della pinza fronte orizzontalmente per minimizzare il rischio che la pinza penetrino nella pelle. Estrudere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto la pelle da dolci un applicatore con punta di cotone sulla superficie cutanea.
      NOTA: Se la pelle sta andandoda utilizzare per appartamento immunoistochimica montaggio o istochimica, rimuovere la maggior quantità di tessuto connettivo possibile; se la pelle sta per essere utilizzato per visualizzare follicoli piliferi basato su melanina pigmentazione, rimozione meno completa del tessuto connettivo è soddisfacente. Pelle prenatale richiede una minima "pulizia" del tessuto connettivo aderente.
   7. Fissare la pelle appuntato con l'aggiunta di 20 ml di preparati al momento 4% PFA / PBS o il 10% formalina tamponata per 10 cm piatto Sylgard (se verrà utilizzata la pelle di melanina imaging o della fosfatasi alcalina (AP) istochimica) o 20 ml di appena preparato 2% PFA / PBS (se verrà utilizzata la pelle di immunoistochimica o visualizzare transgenico cheratina (KRT) 17-GFP ^11), e ruotare delicatamente durante la notte in una stanza fredda. Il giorno dopo, lavare in PBS per> 10 min.
      NOTA: formalina standard è 37% di formaldeide; Pertanto, "il 10% di formalina" è del 3,7% di formaldeide.
   8. Per AP colorazione e immunostaining, continuare al punto 3. Per melanina imaging, disidrata la pelle attraverso una serie graduata di etanolo (70%, 95%, 100%), un giorno per ogni passo, con lieve rotazione orizzontale a temperatura ambiente. Rimuovere tessuti connettivi residue.
   9. Con la pelle in 100% di etanolo, rimuovere i perni di insetti e, se desiderato, tagliare la pelle con forbici per rimuovere il più periferica 1-2 mm di pelle con i fori dei perni.
   10. Trasferire la pelle per un piatto di vetro 10 cm di diametro, posizionate due vetrini da microscopio di vetro sulla pelle per evitare che il curling, e aggiungere 20 ml di BBBA. BBBA indurisce rapidamente tessuto quindi è importante per la pelle per essere appiattito sotto il peso dei vetrini prima di aggiungere il BBBA.
   11. Nel corso dei prossimi parecchie ore, sollevare le diapositive fuori la pelle per un paio di secondi per consentire alla BBBA per lavare la pelle.
       NOTA: Indossare guanti quando si lavora con BBBA. A seconda dell'età e della pelle ci può essere fino al 30% di ritiro in BBBA.
2. La pelle del piede per l'Analisi del follicolo pilifero Patterning
   NOTA: La gamma di età tipicamente esaminati è P1-P8.
   1. Dopo l'eutanasia, tagliare i piedi sopra la caviglia e fare un unico taglio dritto lungo la superficie ventrale attraverso le piante dei piedi.
   2. Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante, procedendo in una direzione prossimale a distale.
   3. Tagliare le cifre per rilasciare la pelle e il pin per Sylgard con la superficie interna rivolta verso l'alto (Figura 2C). C'è tessuto connettivo minimo sulla pelle del piede.
   4. Pelle transgenica Krt17-GFP è ora pronto per l'imaging. Per l'imaging melanina procedere con la fissazione, disidratazione e BBBA compensazione come descritto nella sezione 2.1.
3. La pelle del piede per la visualizzazione ghiandole sebacee
   1. Dopo l'eutanasia, rimuovere i capelli sfregando gel per capelli di rimozione sulla superficie cutanea con un dito guantato e il pollice; attendere per 10 min.
      NOTA: non utilizzare un rasoio elettrico, che danneggia la pelle delicata del piede.
   2. Wcenere la superficie della pelle con acqua di rubinetto, sezionare e il pin la pelle a Sylgard come descritto nella sezione 2.2.
   3. Fissare con 1% PFA / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare in PBS.
      NOTA: Per visualizzare ghiandole sebacee sui piedi, che si sviluppano dopo la prima settimana post-natale, l'età ottimale per l'analisi con Oil Red O è P21, perché questo segna il nadir della pigmentazione dei capelli durante il primo ciclo del capello ^12, e quindi le ghiandole sebacee si può vedere più facilmente. Con i topi albino questa analisi può essere eseguita a qualsiasi età. Per ottenere albino progenie croce pigmentato topi mutanti per una linea mutante tirosinasi come C57BL/6J-Tyr ^c-2J.
4. Preparazione Tail pelle per l'analisi di melanina Distribution, Capelli follicolo Orientamento e ghiandola sebacea visualizzazione
   1. Dopo eutanasia, fare un taglio circolare intorno alla base della coda, e poi una fessura longitudinale che corre la lunghezza della coda lungo la faccia ventrale.
   2. Togliere la pelle coda partendo dalla punta impugnando saldamente la punta della coda-osso e / o tessuto connettivo con una coppia di pinze e la pelle con una seconda coppia di pinze. Pin la pelle coda Sylgard.
   3. Per l'analisi della distribuzione della melanina e capelli orientamento del follicolo, correggere ed elaborare la pelle come descritto nella sezione 2.1. Per l'analisi delle ghiandole sebacee, tagliare la pelle coda in una serie di segmenti ~ 0,5 a 1 cm di lunghezza prima del fissaggio e incubare i pezzi di pelle in PBS / EDTA 5 mM notte a 37 ° C per indebolire il derma-epidermide adesione ^13.
   4. Staccare delicatamente l'epidermide dal derma, appuntare l'epidermide a Sylgard (faccia interna verso l'alto), e fissare nel 4% PFA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS, e macchiare con Oil Red O come descritto di seguito.
      NOTA: Un rasoio elettrico e / o capelli gel rimozione possono essere utilizzate prima di sezionare pelle coda anziani (es. P21), ma questo trattamento è facoltativo poiché i capelli sulla coda non èdenso come altre parti del corpo.

3. Reazioni colorazione

1. Umano placentare fosfatasi alcalina (AP) Istochimica per visualizzare geneticamente etichettati Axon conici ^10,14,15 (Figure 3A, B)
   1. Dopo PFA fissazione sulla Sylgard, collocare pelli fissati in un piatto di vetro da 10 cm ed immergere in PBS / 1 mM MgCl _2. Ruotare delicatamente il piatto in un bagno d'acqua a 70 ° C per 90 minuti per distruggere l'attività della fosfatasi endogena.
   2. Visualizza dell'attività giornalista AP istochimica con un hr incubazione 4-48 a temperatura ambiente in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl _2, 0,34 mg / ml NBT, e 0,175 mcg / ml BCIP, tipicamente usando 10-15 ml di soluzione colorante per la pelle dorsale P21. Monitorare la reazione sotto il microscopio da dissezione, facendo attenzione a non lasciarlo procedere al di là del tempo ottimale, come giudicato mediante ispezione visiva delle assone colorazione intensità rispetto al aspecifica NBT deposizione.
   3. Arrestare la reazione mediante lavaggio con tre cambi di PBS/0.1% Tween-20 nel corso di 1 ora, ri-pin bucce al Sylgard, disidratare le bucce attraverso una serie di etanolo, e poi trasferire le bucce per un piatto di 10 centimetri con BBBA.
      NOTA: BBBA dissolve lentamente il precipitato NBT. Durante le prime ore di BBBA, uno sfondo multa di precipitato NBT si dissolverà; come risultato, la soluzione BBBA si scurisce, e la pelle alleggerirà. Passare alla BBBA fresca dopo poche ore.
   4. Dopo l'imaging della pelle AP-tinto, trasferirlo in etanolo per> 1 ora a temperatura ambiente e poi riporla in etanolo fresco a -20 ° C. Pelli AP-colorati possono essere memorizzati in questo modo per molti mesi senza perdita di segnale.
2. Oil Red O di colorazione per visualizzare ghiandole sebacee ⁴ (Figure 3C-F)
   1. Rimuovere spilli insetti e trasferire il piede fisso leggera o pelli coda dalla piastra Sylgard ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti, confino a due campioni di pelle per pozzetto. Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Colorare con 2 ml di 0,3% Oil Red O in 60:40 isopropanolo: acqua (vedere paragrafo 1.2) a temperatura ambiente per 2 ore.
   3. Lavare con 60:40 isopropanolo: acqua per 5 minuti a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con acqua. Con attenzione via i bordi della pelle, compresi i fori, con forbici sottili in modo che la superficie della pelle può essere fatta più piatta possibile.
   4. Mettere la pelle su un vetrino con la superficie esterna rivolta verso l'alto, aggiungere alcune gocce di acqua o mezzo di montaggio acquoso, coprire la pelle con un vetrino, e poi il nastro delicatamente il coprioggetto al vetrino per appiattire ulteriormente la pelle.
3. Appartamento Monte Immunostaining ^4,16,17 (Figure 3G, H)
   1. Tagliate un rettangolo di pelle PFA fisso (ad esempio uno centimetri x 0,5 cm), segnando il suo orientamento con un taglio asimmetrico (ad esempio ritagliare l'angolo anteriore destro). Eseguire l'incubazione elavare con passaggi lieve rotazione su una piattaforma rotante orizzontale. Nei pozzetti di un 6 - o 12-pozzetti di coltura tissutale, lavata diverse volte con PBS per rimuovere residui PFA, lavare con ~ 10 cambi di PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) oltre 5-8 ore a temperatura ambiente per permeabilize la pelle.
   2. Incubare con l'anticorpo primario a 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per cinque giorni a temperatura ambiente. Coprire i pozzetti della piastra con nastro adesivo trasparente o di plastica adesivo per eliminare le perdite per evaporazione.
   3. Lavare con 10-15 cambiamenti di 0,3% PBST oltre 5-8 ore e incubare con l'anticorpo secondario in 0,3% PBST con siero di capra al 5% e 20% DMSO per 3 giorni a temperatura ambiente.
   4. Lavare con 10-15 cambiamenti del 0,3% PBST oltre 5-8 ore.
   5. Disidratare in 25%, 50%, e 75% di metanolo per 5 minuti ciascuna e quindi 3x in 100% di metanolo per 20 minuti ciascuno.
   6. Pioggia in BBBA notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Appartamento montare immunoistochimica della pelle più giovane~ P1 può essere eseguita come descritto sopra ma con incubazione più breve e tempi di lavaggio. Ad esempio, la pelle P1 può essere immunostained considerando un notte di incubazione in anticorpo primario e vari ore di incubazione in anticorpo secondario, e con intervenendo lavaggi di solo 2-3 ore in 0,3% PBST. Come notato sopra, le pelli più giovani sono anche sufficientemente sottili da poter essere ripreso senza BBBA compensazione.
4. Visualizzazione Merkel gruppi di cellule con Nerve fluorescente Terminal Dye assorbimento (Figure 3I-L)
   AMI-43 (verde) e AM4-65 (rosso) sono fissabili coloranti fluorescenti che entrano cellule via non selettivo canale cationico ^18. Nella pelle vivente questi coloranti vengono selettivamente assorbiti e concentrati in cellule di Merkel.
   1. Sciogliere 1 mg AM1-43 o AM4-65 in 2 ml di PBS e conservare in aliquote a -80 ° C.
   2. Iniettare cuccioli appena nati per via sottocutanea con 2-10 mg colorante per grammo di peso corporeo con un ago G 29.
   3. Un giorno dopo, eutanasia topi e diffuCT Il pelli dorsali.
   4. Fissare le pelli in 4% PFA / PBS a 4 ° C per una notte, lavare con PBS, e montare la pelle come descritto nella sezione 3.2.

4. Imaging and Image Analysis

1. Imaging follicolo pilifero Orientamento (Figura 4)
   1. Utilizzare un microscopio da dissezione di dorsale immagine, a piedi, o pelli di coda che sono immersi in BBBA, schiacciata sotto un vetrino, e ancora nel piatto di vetro - questo approccio minimizza la contaminazione BBBA del microscopio.
   2. Illuminare il piatto da sotto. Per minimizzare la variazione spaziale dell'intensità della luce attraverso il campo di vista, elevare il piatto di vetro ad una altezza circa 10 cm sopra il piano di lavoro standard del microscopio da dissezione e posizionare un diffusore di plastica o lastra di vetro sopra la sorgente di luce.
   3. Ritorno alla pelle di 100% etanolo per la conservazione a lungo termine a -20 ° C.
      NOTA: Lasciando la pelle in BBBA per più di un giorno fa sì che i granuli di melanina per rompere unparte. Una volta che la pelle è stata trattata BBBA si indurisce e rimane piatta da quel punto in avanti. Pelli differenti possono essere codificati con una serie di tacche al loro anteriore e / o posteriore termina, in modo che possano essere conservare insieme, per risparmiare spazio nel congelatore.
2. Imaging and Tracing Axon conici (Figure 3A, B)
   1. Posizionare AP macchiato pelle (sezione 3.1.3) tra due lastre di vetro del tipo usato per i piccoli gel proteici. Evitare l'introduzione di bolle d'aria tra le piastre e la pelle, e quindi favorire la attentamente tutta BBBA eccesso con un tovagliolo di carta. Posizionare il panino della piastra-pelle-piatto su un palco microscopio (Figura 2D).
   2. Utilizzare in campo chiaro o illuminazione DIC con un obiettivo 10X e 2 micron o 5 micron Z-passi. Utilizzare una fase XY meccanizzato per catturare un montaggio di immagini XY che vengono cuciti insieme per creare un unico set di dati tridimensionali in scala di grigi.
      NOTA: Per un unico grande pergolato assone, questo set di dati può essere uns grande come 5 Gb.
   3. Eseguire manuale, automatico, o tracciato semi-automatizzata delle pergole assoni con qualsiasi di una varietà di pacchetti software.
      NOTA: Software come neuromantico (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) è uno strumento di ricostruzione neuronale gratuito che viene eseguito in un ambiente PC ed è relativamente facile da padroneggiare ^10.

Risultati

Brightfield imaging flatmounts pelle può essere utilizzato per immagine afferenze cutanee sensoriali (Figura 3A ¹⁰⁾ e modelli follicolo basato su melanina pigmentazione (Figura 4). Confocale di flatmounts pelle può essere utilizzato per definire la geometria di (1) gruppi di cellule Merkel, visualizzati con anti-citocheratina-6 o con AM colorante assorbimento (figure 3I-L), (2) i muscoli erettore del pelo, visualizzati con anti- actina muscolo liscio

Discussione

Padronanza dei metodi di dissezione sopra descritti richiede solo pazienza, una mano ferma e un paio di buoni strumenti di dissezione. La pelle dissezione dorsale è relativamente facile, ma la coda e la pelle del piede dissezioni - soprattutto in età precoce postnatale - sono più impegnativo. In età precoce prenatale (ad esempio, prima di E15), la pelle è difficile da rimuovere senza strapparla. Opportunamente, per molti studi di crescita e patterning di strutture della pelle nei topi, gli eventi di intere...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)	Roche	11383221001
AM1-43	Biotium	70024
AM4-65	Biotium	70039
Benzyl alcohol	Sigma	402834
Benzyl benzoate	Sigma	B-6630
Confocal microscope	Zeiss	LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	C6198	1:400
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-c	1:500
Dissecting microscope
Dissection tools	Fine Science Tools		scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G	EM Sciences	17984-25
Formalin	Sigma	HT501320
Glass dishes	Pyrex		6 cm and 10 cm diameter
Glass plates	Amersham Biosciences	SE202P-10	10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover	Nair
Horizontal rotating platform	Hoefer	PR250 Orbital shaker
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Ketamine/xylazine	Sigma	K113
Nitroblue tetrazolium (NBT)	Roche	11383213001
Oil Red O	Sigma	O0625
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Razor Blades	VWR	55411-055
Secondary antibodies	Invitrogen		Alexa-dye conjugated
Sylgard-184	Fisher Scientific	NC9020938
Tissue culture plastic dishes			10 cm diameter
Tissue culture plates			6- and 12-well