Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Riepilogo

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Abstract

Neuroni dopaminergici rappresentano meno dell'1% del numero totale di neuroni nel cervello. Questa bassa quantità di neuroni regola importanti funzioni cerebrali come il controllo motorio, la motivazione, e la memoria di lavoro. Neuroni dopaminergici nigrostriatali degenerano selettivamente nella malattia di Parkinson (PD). Questa perdita neuronale progressiva è inequivocabilmente associato con i motori sintomi della patologia (bradicinesia, tremore a riposo, e rigidità muscolare). L'agente principale responsabile della degenerazione dei neuroni dopaminergici è ancora sconosciuta. Tuttavia, questi neuroni sembrano essere estremamente vulnerabile in condizioni diverse. Colture primarie costituiscono uno dei modelli più importanti per studiare le proprietà e le caratteristiche dei neuroni dopaminergici. Queste culture possono essere presentate a diversi agenti di stress che imitano PD patologia e ai composti neuroprotettivi al fine di fermare o rallentare la degenerazione neuronale. I numerosi modelli murini transgenici di PD che sono stati generated nel corso dell'ultimo decennio ulteriormente aumentato l'interesse dei ricercatori per le culture neuronali dopaminergiche. Qui, il protocollo video si concentra sulla delicata dissezione dei cervelli embrionali di topo. Escissione precisa del mesencefalo ventrale è fondamentale per ottenere colture neuronali sufficientemente ricchi di cellule dopaminergiche per consentire studi successivi. Questo protocollo può essere realizzato con topi transgenici embrionali ed è adatto per immunofluorescenza, PCR quantitativa, secondo la quantificazione messaggero, o neuronale valutazione morte / sopravvivenza.

Introduzione

La dopamina, uno dei neurotrasmettitori cerebrali essenziali ^1,2, viene rilasciato principalmente dal mesencefalo dopaminergici (DA) neuroni. La maggior parte dei neuroni dopaminergici risiedono nella parte ventrale del mesencefalo ^2-6. Schematicamente, mesencefalo neuroni DA possono essere divise in tre anatomicamente e funzionalmente distinti sistemi di proiezione: mesostriatal, mesolimbico, e percorsi mesocorticali ^2,5. Il sistema nigrostriatale è coinvolta nel comportamento motorio, i percorsi mesolimbico svolgono un ruolo importante nel rinforzo, la motivazione e l'apprendimento, mentre le vie dopaminergiche che proiettano alla corteccia prefrontale sono implicati nella cognizione ^2.

Neuroni DA sono coinvolti in diverse patologie neurologiche umane come la schizofrenia, deficit di attenzione, disturbi iper attività, e la malattia di Parkinson (PD) ^2,4. PD è caratterizzata da una degenerazione progressiva e selettiva di neuroni DA collegamento substantia nigrapars compacta (SNC) al corpo striato. La perdita di Nigro-striatale DA neuroni provoca una grave deplezione di dopamina nello striato che è responsabile dei sintomi motori della malattia di Parkinson (bradicinesia, tremore a riposo, rigidità e) ^7. La causa iniziale del PD idiopatica non è stata stabilita e gli attuali trattamenti sono solo sintomatica, che mira a ripristinare il livello di dopamina nello striato. Il farmaco più prescritto è L-Dopa (levodopa), il precursore naturale della dopamina. Anche se la somministrazione di Levodopa compensa la perdita di dopamina per un certo tempo, le complicanze motorie si verificano dopo i trattamenti a lungo termine (discinesia e stati on / off) ^8,9.

La ricerca sui neuroni dopaminergici e PD è in costante progressione e intensi sforzi sono stati fatti per sviluppare trattamenti basati sul trapianto di cellule, la terapia genica, o agenti neuroprotettivi ^10,11. Tuttavia, una questione importante rimane non chiarita: qual è la causa della estrema vulnerabilità di neuroni DA? Parte della risposta può essere trovata nella attività dei neuroni DA. Una riduzione dell'attività elettrica e della eccitabilità di neuroni dopaminergici sembra aumentare la loro propensione a degenerare ^12. Tuttavia, la complessità del PD patogenesi richiede ulteriori studi per identificare i meccanismi coinvolti nella degenerazione dei neuroni DA ^13-15.

Colture primarie sono particolarmente rilevanti per studiare le proprietà dei neuroni DA ^16-19 e di sfidare questi neuroni a varie sollecitazioni per la valutazione degli agenti neuroprotettivi ^20-24. Modelli di coltura Rat sono più spesso utilizzati, come la dissezione di ratto dell'embrione mesencefalo è più facile, in confronto con il mouse, e una maggiore quantità di neuroni possono essere ottenuti nel ratto. Tuttavia, la generazione di modelli transgenici murini di malattia ²⁵ ha notevolmente aumentato l'interesse della comunità neuroscienziato per colture primarie dal mouse ^26-29. Anche se le culture prepared da animali neonati può essere utilizzato, è meglio prepararli da embrioni allo stadio post-mitotico (E13.5 per i neuroni mesencefalo), quando i neuroni hanno conservato la loro capacità di differenziarsi. Il protocollo che segue presenta isolate mesencefalo neuroni in coltura primaria da embrioni di topo (E13.5), che sono i più difficili da preparare. In particolare, forniamo un protocollo con terreno privo di siero cultura per una migliore riproducibilità. Le due fasi più critiche in preparazione culturale (dissezione e dissociazione meccanica) saranno accuratamente dettagliati nel video associato.

Protocollo

I topi utilizzati in questo lavoro sono stati curati e trattati in conformità con le linee guida del Consiglio dell'Unione europea (86/609 / UE) per l'uso di animali da laboratorio.

1 Preparazione delle soluzioni necessarie

1. Soluzioni Immagini
   1. 10x Poly-L-Ornitina (OLP) Soluzione: pesare 10 mg di PLO bromidrato (peso molecolare = 30,000-70,000) e sciogliere in 70 ml di acqua sterile. Filtrare la soluzione con 0,2 micron filtro a siringa, aliquote, e conservare a -20 ° C.
   2. 30% di soluzione di glucosio: pesare 30 g di D (+) - Glucosio e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   3. Modified mezzo di Eagle di 5x Dulbecco (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: pesare 6 g di polvere DMEM / F-12 Prosciutto e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   4. 7,5% Bicarbonato di sodio _(NaHCO3) Solution: pesare 7,5 g di _NaHCO3 e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   5. 1 M HEPES Soluzione: Pesare 23,8 g di HEPES e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   6. 70% (v / v) etanolo: Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua sterile.
2. Tampone fosfato isotonico con glucosio e antibiotici (PBS-GAB): aggiungere 10 ml di soluzione di glucosio al 30% e 5 ml di soluzione di penicillina-streptomicina a 500 ml di Dulbecco Phosphate Buffered Saline. Conservare a 4 ° C.
3. Inattivato siero fetale bovino (IFB): Scongelare siero bovino notte a 4 ° C e inattivare a 56 ° C per 30 min. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C.
4. Cultura Media: In acqua sterile, mescolare successivamente 40 ml di DMEM 5x / F12-Ham, 1 ml di 1 M HEPES, 2 ml di 200 mM L-glutammina, 2 ml di penicillina-streptomicina, 4 ml di 30% di glucosio unnd 3 ml di 7,5% _NaHCO3 ad un volume finale di 180 ml. Filtrare e utilizzare lo stesso giorno.
5. Ormone Mix
   1. Preparare 180 ml di terreno di coltura. Sciogliere 200 mg di apo-transferrina in questo mezzo.
   2. Pesare 50 mg di insulina e sciogliere in 2 ml di HCl 0,1 M. Aggiungere lentamente 8 ml di acqua sterile mentre mescolando delicatamente. Diluire la soluzione nel mezzo di coltura.
   3. Pesare 19,3 mg di putrescina dicloridrato e sciogliere in 10 ml di acqua sterile. Aggiungere la soluzione alla miscela ormone 10 ml.
   4. Preparare una soluzione di selenito di sodio 3 mM in acqua sterile e una soluzione di progesterone 2 mM in etanolo assoluto. Aggiungere 20 ml di ciascuna soluzione al mix ormonale.
   5. Filtrare il mix di ormoni, un'aliquota in 10 ml e conservare a -20 ° C.

2 Preparazione di piastre di coltura e strumenti

1. FBS rivestimento delle piastre di coltura: Il giorno prima della dissezione, preparare 180 ml di terreno di coltura. Aggiungere 10 ml diIFB a 90 ml di mezzo di coltura. Aggiungere 300 ml / pozzetto di terreno di coltura / 10% IFB in piastre da 24 pozzetti poli-D-lisina pretrattata. Incubare per una notte a 37 ° C. Conservare i supporti rimanenti (con e senza IFB) a 4 ° C.
2. Sterilizzare gli strumenti e le pipette Pasteur. Raccogliere le attrezzature elencate nella tabella dei materiali così come una cappa di classe II a flusso laminare e un incubatore CO _2.

3. Dissezione di mouse mesencefalo

1. Sacrifica un E13.5 il mouse in stato di gravidanza (secondo le linee guida istituzionali). Pulire l'addome del mouse con il 70% di etanolo e aprire la parete addominale. Raccogliere le corna uterine, aprirli utilizzando le forbici delicati, sezionare ogni embrione dalle corna uterine, e rimuovere le membrane amniotiche. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBS sterile-GAB e lavarli con bonifico in 3 bagni identici consecutivi con pinze. Per la dissezione, collocare gli embrioni da 3 in una capsula di Petri sterile 60 mm.
2. Movvia e il piatto finale Petri allo stereomicroscopio. Non decapitare gli embrioni. Utilizzando le forbici Vännäs, asportare il cervello.
   1. Rimuovere con cautela e scartare le regioni anteriori e romboencefalo. A lato rostrale, tagliare vicino alla regione del talamo, al taglio laterale caudale in corrispondenza della zona istmo, rimuovere il collicolo superiore.
   2. Una volta che il mesencefalo ventrale è isolato, rimuovere con cautela le meningi con una pinza ultra fine. Raccogliere i segmenti sezionati, senza le meningi, in una provetta sterile da 13 ml riempito con PBS-GAB.
3. Pulire accuratamente il tubo contenente il mesencephala con il 70% di etanolo e portarla sotto il cofano.

Dissociazione 4. cellulare

1. Lavare mesencephala 3 volte con PBS sterile-GAB. Consenti frammenti del cervello di stabilirsi tra ogni lavaggio ed evitare di interrompere il tessuto. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con attenzione quanto soluzione possibile e incubare segmenti cerebrali in 3 ml di tripsina / EDTA per 15 min a 37 ° C in unCO ₂ incubatore.
2. Fuoco-lucidare le pipette Pasteur per massimizzare la sopravvivenza dei neuroni, come la fine di una pipetta di vetro non levigato è tagliente e può danneggiare le cellule durante le fasi di dissociazione. Leggermente ridurre il diametro estremità (+ 0,5 mm) della pipetta Pasteur mentre fuoco lucidatura.
3. Rimuovere con attenzione quanto soluzione / EDTA tripsina possibile e aggiungere 10 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Lavare i segmenti del cervello 3x con terreno di coltura / 10% IFB.
4. Utilizzando la pipetta Pasteur fuoco lucido, iniziare dissociazione di mesencephala in 6 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Triturare 10x (evitare bolle d'aria), consentono ai blocchi di stabilirsi, poi raccogliere il medium in una nuova provetta sterile 13 ml.
5. Aggiungere 6 ml di terreno di coltura, ripetere il passaggio precedente, una volta e raccogliere il supporto contenente cellule dissociate nello stesso tubo 13 ml.
6. Centrifugare le cellule a 160 g per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura addizionato con10% mix ormonale.

5. cellulare placcatura

1. Contare le celle in sospensione in una cella Malassez e regolare il volume del mezzo ad una concentrazione di 600.000 cellule / ml. Circa 1.700.000 cellule possono essere ottenute da un mesencefalo mouse.
2. Rimuovere FBS-terreno contenente rivestimento da piastre da 24 pozzetti e aggiungere in ogni pozzetto 1 ml di sospensione cellulare (600.000 cellule / pozzetto, 2-4% delle cellule TH +).
3. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO _2/95% di aria. Nessun mezzo cambiamento è necessario. Neuroni dopaminergici sono maturi dopo circa 5-7 giorni in vitro (espressione coerente del trasportatore della dopamina). Conservare le cellule in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo.

6. immunofluorescenza protocollo

1. Pulizia dei vetrini
   1. Il giorno prima della dissezione, aggiungere 10 ml di 1 M HCl in una capsula di Petri. Posare sulla superficie del liquido 12-15 vetrini e attendere 15 min.
   2. Affondare il coperchioscivolare nel liquido e attendere 15 min.
   3. Rimuovere HCl e lavare 3 volte con acqua.
   4. Lavare i coprioggetti rapidamente con etanolo puro, una volta, quindi aggiungere etanolo puro al piatto e attendere 30 min.
   5. Sotto il cofano, rimuovere i vetrini puliti da etanolo e aggiungere 1 coprioggetto per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 12 pozzetti con pinze sterilizzate.
   6. Lavare coprioggetto due volte con acqua sterile (1 ml / pozzetto). Poi, lavarli una volta con PBS sterile.
2. Rivestimento dei vetrini
   1. Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 2x dell'OLP (diluito in PBS). Incubare per 4 ore a 37 ° C in incubatore CO _2.
   2. Rimuovere la soluzione OLP e lavare 3 volte con PBS sterile.
   3. Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubare per una notte a 37 ° C in incubatore CO _2.
3. Placcatura le cellule per immunofluorescenza
   1. Rimuovere medio rivestimento da piastre da 12 pozzetti.
   2. Aggiungere 900,000 cellule / pozzetto in 2 volumi ml e far crescere le cellule in 37 ° C in incubatore. Le celle possono essere tenuti in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo.
4. Immunostaining
   1. Rimuovere media da piastre da 12 pozzetti e lavare con 500 microlitri / pozzetto DMEM preriscaldato a 37 ° C.
   2. Aggiungere 500 ml / pozzetto di DMEM preriscaldato a 37 ° C, quindi aggiungere lentamente 160 ml / pozzetto di 8% paraformaldeide (PFA, concentrazione finale 2%) e incubare per 10 min a 37 ° C.
   3. Rimuovere PFA e lavare 3 volte con PBS / 0,1 M glicina per 10 min.
   4. Rimuovere PBS, aggiungere / pozzetto di PBS / 0,05% di siero di capra 300 microlitri Triton X-100/20% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo primario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all'1% e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari che possono essere utilizzati per la rilevazione di neuroni dopaminergici e caratterizzazione della cultura sono indicati nella tabella materiali. Mantenere1 bene senza anticorpo primario per valutare per lo sfondo dei diversi anticorpi secondari.
   6. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min.
   7. Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo secondario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all'1% e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al buio. Gli anticorpi secondari utilizzati sono indicati nella tabella materiali.
   8. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min.
   9. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS.
   10. Montare i coprioggetti sul lato vetro diapositive cella verso il basso in una goccia di Vectashield. Conservare i vetrini a temperatura ambiente per una notte per consentire al mezzo di montaggio a secco, poi conservarli a 4 ° C.
   11. Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale o di un microscopio a contrasto di fase attrezzata per epifluorescenza. Immagini rappresentative sono state acquisite con un microscopio confocale Leica SP2 UV.

Risultati

Un diagramma di flusso illustrato dei passaggi di coltura mesencefalo è mostrato in Figura 1. Brevemente, dopo aver raccolto embrioni E13.5 da una gravidanza topo svizzera, mesencefalo ventrale è sezionato dall'intero embrione. I frammenti del cervello isolati vengono successivamente sottoposti a digestione enzimatica e dissociazione meccanica. Cellule dissociate sono pellettizzati per centrifugazione, risospese in terreno di coltura e placcato in piastre da 12 o da 24 pozzetti pre-rivestito. Le c...

Discussione

Questo protocollo presenta le procedure ei reagenti necessari per preparare una coltura primaria di neuroni mesencefaliche dal mouse embrionale e la procedura di immunofluorescenza per rilevare neuroni dopaminergici. Fasi critiche della procedura sono la dissezione degli embrioni e la dissociazione meccanica dei frammenti cerebrali raccolte. Strumenti di dissezione di alta qualità aiuta a padroneggiare la tecnica di dissezione. Neuroni DA costituiscono una piccola percentuale di mesencefalo. Pertanto, raccogliendo la p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	Lonza	14-801F
DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Life Technologies	25300-054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140122
L-Glutamine, 200 mM solution	Life Technologies	25030123
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D0547	Powder
Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-Ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P3655
Insulin from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	I5523
apo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	T1147
Putrescine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P5780
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Stock solution 1 M in water
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Stock solution 2% (w/v) in water
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Paraformaldehyde 16% in water	Electron Microscopy Sciences	RT 15710-S
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck Millipore	106329
D(+)-Glucose, Monohydrate	Merck Millipore	4074-2
Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur	Merck Millipore	109057
Sterile water - Aqua B. Braun	Braun
Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent	VWR	20821.321
Sterile Petri dishes	VWR	82050-566
Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR.	VWR	612-2297
Counting chamber Malassez	VWR	631-0975
Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm	PALL Life science	4525
Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long	Fine Science Tools	14002-14	To open the abdominal wall
Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long	MORIA	4877A	To open the uterine wall
Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm	MORIA	2183	To manipulate embryos
Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades	MORIA	MC50	To take out the mesencephalon
Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long	MORIA	9987	To remove meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates	BD Bioscience	356414
BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid	BD Bioscience	353043
SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º	MENZEL-GLÄSER	AG00008032E
Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø	MARIENFELD	117580
Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody	Chemicon Millipore	AB5622	1/200
Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2	Chemicon Millipore	MAB5406	1/400
Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt	Chemicon Millipore	MAB369	1/500
Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody			1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Goat Serum, New Zealand Origin	Life Technologies	16210-064
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-31556	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11001	1/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A-11007	1/1,000
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400
Stereomicroscope	Carl Zeiss microscopy	Stemi-2000C
Bunsen Burner FIREBOY	VWR	451-0136