Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Riepilogo

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Abstract

Con il ritmo del progresso scientifico accelerare rapidamente, sono necessari nuovi metodi per la neuroscienza sperimentale per manipolare rapidamente e facilmente l'espressione genica nel cervello di topo. Qui si descrive una tecnica introdotta da Passini e Wolfe per la consegna intracranica diretta di transgeni viralmente-codificati nel cervello neonatale mouse. Nella sua forma più elementare, la procedura richiede solo un secchio di ghiaccio e una siringa microlitro. Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per l'uso con cornici stereotassica per migliorare la coerenza dei ricercatori nuovi alla tecnica. Il metodo si basa sulla capacità del virus adeno-associato (AAV) di spostarsi liberamente dai ventricoli cerebrali nel parenchima cerebrale, mentre il rivestimento ependimale è ancora immaturo durante la prima 12-24 ore dopo la nascita. Iniezione intraventricolare di AAV a questa età i risultati in diffusa trasduzione di neuroni in tutto il cervello. Espressione inizia entro giorni di iniezione e persiste per la lifetime dell'animale. Titolo virale può essere regolato per controllare la densità di neuroni trasdotte, mentre la co-espressione di una proteina fluorescente fornisce un'etichetta vitale di cellule trasdotte. Con la crescente disponibilità di servizi di base virali per fornire i reagenti sia off-the-shelf, pre-confezionati e preparazione virale personalizzato, questo approccio offre un metodo opportuno per manipolare l'espressione genica nel cervello di topo che è veloce, facile e molto meno costoso di ingegneria germinale tradizionale.

Introduzione

I metodi tradizionali per modificare l'espressione genica neuronale richiedono tempo e costosa manipolazioni linea germinale. Alternativa de novo approcci come in utero elettroporazione o iniezione stereotassica lentivirali dare risultati più rapidi e sono meno costosi, ma hanno lo svantaggio di richiedere un intervento chirurgico complesso di ^1-3. Inoltre, l'espressione del transgene ha una gamma limitata spaziale con questi metodi. Qui, descriviamo un metodo veloce, facile ed economico per la manipolazione neuronale diffusa tramite iniezione intraventricolare di virus adeno-associato (AAV) nel cervello neonatale mouse. Il metodo è stato descritto da John Wolfe e Marco Passini, nel 2001, dove hanno suggerito piccola dimensione delle particelle di AAV ha permesso di diffondere all'interno del fluido cerebro-spinale che passa dai ventricoli laterali attraverso la barriera ependimale immaturo e nel parenchima cerebrale ^{4, 5.} Iniezione intraventricolare di AAV all'interno del first 24 ore dopo che i rendimenti nascita diffusa di trasduzione virale di sottoinsiemi neurali che abbracciano tutte le regioni del cervello, dai bulbi olfattivi per il tronco cerebrale ^6,7. Transgeni viralmente-consegnati sono espressi e attiva entro giorni di iniezione e persistere fino a un anno dopo la trasduzione. Così, questa manipolazione versatile consente studi che spaziano dallo sviluppo del cervello postnatale precoce invecchiamento e la degenerazione nell'adulto.

In adattando la tecnica alle nostre esigenze sperimentali specifiche, ci siamo concentrati principalmente sulla AAV8 sierotipo perché è il più efficiente a trasduzione neuroni ^6. Mostriamo che il titolo virale può essere diluito per controllare la densità di neuroni trasdotte per test esperimenti conseguenze cellule intrinseca di manipolazione genetica. Inoltre, abbiamo dimostrato che due virus potrebbero essere co-iniettati per la produzione di modelli di espressione che sono diretta a gruppi distinti o sovrapposti di neuroni, a seconda dei sierotipi scelti perimballaggio virale. Il nostro lavoro espande la versatilità di questa tecnica per l'uso in una vasta gamma di impostazioni neuroscienze sperimentali.

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Protocollo

Eseguire tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dal Baylor College of Medicine Istituzionale Animal Care and Use Committee.

Virus adeno-associato (AAV) vettori replica-incompetente per la consegna del transgene nel cervello di roditori sono approvati per la sicurezza biologica di livello 1 uso. Consultare il sito web di CDC per la pubblicazione governo degli Stati Uniti "Biosafety in Microbiologia e laboratori biomedici (BMBL)" che elenca in dettaglio i requisiti specifici in materia di procedure di protezione e di gestione virus corretto. Verificare con il personale veterinario e ambientale della sicurezza locale per imparare requisiti specifici per le procedure istituzionali che utilizzano virus. Regolamento in materia di camere di procedura, la quarantena, e l'identificazione di gabbie a rischio biologico variano a seconda delle istituzioni.

1 Prepare P0 Pups e Foster Madri

1. Fornire alta chow grasso per tutte le donne incinte e che allattano per sostenere le richieste energetiche di allevamento e l'allattamento.
2. In serata, impostare una gabbia di allevamento con l'aggiunta di uno o due femmine sane alla gabbia di un singolo maschio residente. La mattina seguente, verificare le femmine per una spina di accoppiamento e separare le femmine dai maschi se una spina è presente.
   1. Utilizzare madri adottive per sollevare cuccioli da un background genetico con scarse caratteristiche materne (per esempio, C57BL / 6 o C3HeJ). Madri adottive accettano cuccioli di un'altra cucciolata, se i cuccioli ceduti sono nati entro quattro giorni dalla propria cucciolata della madre adottiva.
   2. Impostare una gabbia di accoppiamento separato con ICR o femmine FVB accanto gli allevatori sperimentali in modo che i due gruppi di donne forniscono approssimativamente nello stesso tempo.
3. Le femmine consegnerà in 19 ± 1 giorni dalla data di presa, a seconda del ceppo sfondo. Tre giorni prima della delivery (16 giorni dopo la data di spina), posizionare la femmina incinta in una gabbia pulita con materiale di nidificazione fresco e un riparo coperto.
4. Verificare la presenza di cuccioli appena nati due volte al giorno a partire 2 giorni prima della data di consegna prevista (17 giorni dopo la data di presa). Esaminate la gabbia con minimo stress per le madri sbirciando attraverso il fondo per la presenza di neonati rosa. I topi di solito offrono cuccioli di mattina, ma in rare occasioni consegnerà in pomeriggio.
5. Pianificare di eseguire iniezioni non appena i cuccioli in allattamento (che sarà evidente dalle macchie di latte visibili), o entro 6 ore di nascita, a seconda di quale viene prima.

2 Preparare Attrezzature per iniezione

1. Preparare una siringa 10 ml con un ago da 32 G per neonati generali P0. Se si esegue l'iniezione stereotassica, montare la siringa sul braccio manipolatore.
2. Se si utilizza un telaio stereotassico per preparazioni iniettabili, raffreddare la fase neonatale a 4-8 ° C con l'aggiunta di 100% ethanolo e ghiaccio secco al serbatoio all'estremità anteriore del blocco. Mantenere la temperatura superiore a 1 ° C per evitare il congelamento dei cuccioli.

3 Preparare diluizioni virali per iniezione

1. Preparare una soluzione trypan colorante blu 1% (20x magazzino).
2. Preparare aliquote 5-25 microlitri di virus adeno-associato (AAV) stock all'interno di un armadio biosicurezza di classe 2. Posizionare questi aliquote a -80 ° C per un uso futuro. Evitare ulteriori cicli di gelo-disgelo in quanto questo provoca il virus a perdere efficacia trasduzione.
3. Rimuovere un'aliquota di AAV da -80 ° C freezer e posto sul ghiaccio a sciogliersi.
4. Preparare la soluzione virale iniettabile diluendo il virus in soluzione salina ghiacciata 1x tampone fosfato (PBS). Inizia con una diluizione seriale di dieci volte ⁽¹⁰ ottobre - 10 AGOSTO particelle virali / emisfero) per l'ottimizzazione iniziale del modello di trasduzione.
5. Aggiungere 20x trypan blu alla soluzione AAV ad una concentrazione finale di 0,05%.

4. Messa in scena il Newborn Pups per iniezione

1. Posizionare una piastra di alluminio piccolo sul ghiaccio per raffreddare. Inserite un compito asciutto pulire sulla parte superiore della piastra per proteggere la pelle del cucciolo dal metallo freddo. Questo serve come superficie fredda piana per anestetizzare e l'iniezione i cuccioli.
2. Preparare un tampone di riscaldamento adatto per tenere i topi neonatale caldo prima e dopo l'iniezione.
3. Una volta che i cuccioli appena nati hanno cominciato a infermiera, eliminare circa la metà di loro dalla gabbia e lasciare l'altra metà con la loro madre. Posizionare i cuccioli raccolti sul pad di riscaldamento in attesa di iniezione.
   NOTA: Se la madre biologica non si preoccupa per i cuccioli, rimuovere l'intera cucciolata dalla gabbia immediatamente e posizionare i cuccioli su un pad di riscaldamento in attesa di iniezione. Tale situazione può presentarsi con la prima cucciolata nata a C57BL / 6 femmine o con altri ceppi inbred che presentano scarse caratteristiche di allevamento. In questa situazione, macchie di latte non saranno visibili su cuccioli appena nati.
4. Trasferire un pup dal pad riscaldamento sulla piastra di metallo freddo per indurre l'anestesia ipotermia. Attendere 2-3 minuti per il cucciolo a diventare completamente anestetizzato. Confermare anestesia comprimendo molto delicatamente una zampa e monitor per mancanza di movimento o la respirazione.

5 Iniezione di AAV in topi neonati

1. A mano libera iniezione intracranica di AAV in topi neonatale:
   1. Carico 5 ml di AAV diluito con il 0,05% trypan blu nella siringa di iniezione.
   2. Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.
   3. Identificare i siti di iniezione a due quinti della distanza dalla sutura lambda per ogni occhio. Un sito di iniezione alternativo si trova a circa 0,8-1 mm lateralmente dalla sutura sagittale, a metà strada tra lambda e bregma. Questi punti di riferimento sono visibili attraverso la pelle a P0.
   4. Segnare il sito di iniezione con una penna laboratorio non tossico.
   5. Tenere la siringa con la scala visibili monitrollo del volume di soluzione erogata.
   6. Assicurarsi che il pollice può raggiungere la parte superiore del pistone. Quindi rimuovere il pollice dal pistone durante il posizionamento dell'ago per evitare accidentalmente erogazione virus.
   7. Trovare una posizione comoda per bloccare il braccio per l'iniezione mettendo il gomito sul banco e appoggiato il braccio sul secchiello del ghiaccio.
   8. Posare il cucciolo su un fianco con la testa direttamente sotto la siringa. Girare la testa del cucciolo in modo che il sito di iniezione marcato rivolto verso l'alto, e delicatamente ma con fermezza tenere questa posizione con la mano aperta.
   9. Tenere la siringa perpendicolare alla superficie del cranio e inserire l'ago al sito di iniezione marcata ad una profondità di circa 3 mm. Iniettare l'ago fino a quando la resistenza diminuisce leggermente, che indica che l'ago è penetrato nel ventricolo laterale. Se è necessario un riferimento, segnare tre millimetri dalla punta dell'ago con il creatore non tossico. Regolare la profondità di iniezione per le dimensioni dei cuccioli e la tensione sulla base dye targeting dei ventricoli.
   10. Tenere la siringa rigidamente in modo che il pistone può essere premuto senza spostare l'ago più lontano nel cervello. Se l'iniezione viene spostato nel talamo, diffusione virale sarà fortemente limitata.
   11. Iniziare lentamente iniettando virus, mentre il monitoraggio del volume erogato dalla siringa. Somministrare un volume massimo di 2 microlitri in ciascun ventricolo. Se l'ago è in posizione corretta, il colorante si diffonderà per riempire il ventricolo.
   12. Estrarre lentamente l'ago.
   13. Lasciare che il primo sito di iniezione per chiudere prima di iniettare l'altro emisfero.
       NOTA: Non iniettare lo stesso sito più di una volta. Reinserire il virus forze ago che è già stato iniettato a trapelare e provoca lesioni o morte del cucciolo.
   14. Iniettare il ventricolo controlaterale utilizzando la stessa procedura.
2. Iniezione stereotassica di AAV in topi neonatale:
   1. Carico 5 ml di AAV diluito con 0.05% trypan int bluo la siringa di iniezione detenuta dal manipolatore stereotassica.
   2. Inserire delicatamente la testa del cucciolo tra le sbarre orecchio del telaio neonatale. Assicurarsi che la testa sia livello dell'asse Y (anteriore a quella posteriore), controllando che la linea tra lambda e bregma è parallelo al palco. Assicurarsi che la testa sia livello dell'asse X (lato a lato), controllando che una linea immaginaria tra le orecchie, o una linea tra gli occhi, è parallela allo stadio.
   3. Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.
   4. Utilizzare il manipolatore stereotassico per posizionare la siringa sopra lambda e quindi azzerare le coordinate X e Y. Spostare le braccia stereotassica a (X, Y) = (0,8, 1,5) mm per cuccioli P0 standard.
      NOTA: le dimensioni Pup e coordinate stereotassica possono variare a seconda del ceppo ed età. Regolare coordinate basate su iniezioni di tintura come necessario per indirizzare i ventricoli laterali.
   5. Abbassare lentamente l'ago nel sito di iniezione. La superficie del cranio indent e quindi rilasciare una volta che l'ago è penetrato la pelle. Ritrarre l'ago fino a che il cranio recupera la sua normale forma concava, ma mantenere la smussatura dell'ago sotto la pelle. ZERO coordinata Z, a questo punto.
   6. Inserire l'ago fino a Z = -1.7 mm e poi rientrare a -1.5 mm.
   7. Iniettare lentamente il virus. Ogni emisfero può accogliere fino a 2 ml di soluzione.
   8. Tenere la siringa in posizione per 30-60 secondi dopo aver completato l'iniezione e poi lentamente retrarre l'ago sopra 1-2 min.
   9. Ripetere l'operazione per l'emisfero controlaterale, utilizzando le coordinate negative in asse X per il sito di iniezione.
      NOTA: le coordinate alternativi per l'iniezione sono (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm e (1.2, 1.0, -1.5) mm. Eseguire la prima iniezione a (0.8, 2.0), per poi passare a (0.8, -2.0), (1.2, 1.0) e infine (1.2, -1.0). Iniettare 1 ml di soluzione in ogni sito, per un totale di 2 ml per ogni emisfero. Muoversi rapidamente tra le iniezioni per completare la procedura in less di 10 min.

6. post-iniezione di cura

1. Dopo aver completato le iniezioni in entrambi gli emisferi, posizionare il cucciolo di nuovo sulla rampa di riscaldamento fino alla sua temperatura corporea e la pelle color ritorno alla normalità e il cucciolo comincia a muoversi.
2. Se si utilizza la madre biologica di allattare i neonati iniettati, restituire i cuccioli iniettato alla madre biologica dopo che il recupero normale movimento. Posizionare i restanti cuccioli uninjected sul pad riscaldamento. Ripetere la procedura fino a quando sono state iniettate tutti i mouse.
3. Se si utilizza una mamma adottiva per allattare i neonati iniettati, trasferire tutti i cuccioli iniettati alla madre adottiva per la cura dopo il loro recupero movimento normale.
   1. Rimuovere la maggior parte o tutti i cuccioli appartenenti alla madre adottiva dalla gabbia per assicurare il successo degli animali iniettati.
   2. Se i cuccioli della madre adottiva e iniettati cuccioli hanno lo stesso colore degli occhi e della pelle, contrassegnare i cuccioli dalla madre adottiva con una penna laboratorio in modo che possano esseredistinto più tardi.
   3. Posizionare cuccioli della madre adottiva e alcuni di loro biancheria da letto insieme con i cuccioli iniettati. Assicurarsi che i cuccioli iniettate acquisiscono il profumo della sua prole biologica per migliorare l'accettazione dei nuovi cuccioli.
   4. Mettere solo i cuccioli iniettate nuovamente dentro la gabbia della madre adottiva. Abbattere ogni residuo cuccioli dalla madre adottiva.
4. Assicurarsi che la madre sta partecipando ad allattare i cuccioli e iniettati entro 10 minuti della loro immissione nella gabbia. Se la madre non raccoglie i cuccioli entro questo tempo, trasferire i cuccioli di un'altra madre adottiva.
5. Etichettare la gabbia con una carta di rischio biologico per mostrare che esso contiene animali viralmente-iniettati. Casa la gabbia in una zona approvato per 72 ore.
6. Dopo il periodo di quarantena 72 ore, trasferire la madre e cuccioli (ma non di biancheria da letto o altri oggetti gabbia) per una gabbia pulita. Eseguire questo trasferimento all'interno di un cabinet di livello 2 di biosicurezza per evitare l'esposizione a qualsiasi assestamento viralmente contaminati. Return la gabbia pulita con gli animali iniettati alla struttura normale mouse.
7. Posizionare la gabbia sporca in un sacchetto di rischio biologico, sterilizzare in autoclave, e poi tornare la gabbia al vivaio.

7 Cleanup

1. Posizionare la soluzione virus restante a 4 ° C per un uso futuro. Il virus mantiene efficienza di trasduzione per almeno 2 mesi se conservato a 4 ° C ^8.
2. Disinfettare l'ago per l'iniezione e la siringa con il 2% di candeggina seguita da risciacqui ripetuti in acqua deionizzata.
3. Pulire l'area di lavoro con il 2% di candeggina seguito dal 70% di etanolo.
4. Raccogliere tutti gli elementi usa e getta compresi puntali per pipette, tubi, mascherina e guanti in un sacchetto di plastica a rischio biologico. Smaltire i materiali di scarto, come richiesto dalla legge locale e politiche istituzionali (cioè autoclave o incenerire).

8 Preparare Brains mouse per Imaging

1. Inserire un topo iniettato in una camera di anidride carbonica eutanasia a 34 settimane dopo l'iniezione. Seguire le linee guida istituzionali per le procedure di eutanasia corrette. Non profumato animali con paraformaldeide come questo placare l'etichetta fluorescenza.
2. Rimuovere tutto il cervello dal cranio e fissare per 3-12 ore in 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C.
3. Trasferire il cervello fissata al 30% di saccarosio per crioprotezione. Incubare a 4 ° C fino al cervello scende sul fondo.
4. Raccogliere un secchio di ghiaccio secco finemente tritato. Tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Bury le due metà del cervello nel ghiaccio secco a congelare.
5. Raffreddare la fase microtomo con l'aggiunta di ghiaccio secco e il 100% di etanolo.
6. Fissare il cervello al palco con la linea mediana verso il basso con PBS, e permettere di congelare.
7. Sezione attraverso il cervello a 30-45 micron di spessore utilizzando un microtomo congelamento scorrevole.
8. Inserire sezioni in piastre da 24 pozzetti contenenti soluzione antigelo (250 ml glicerolo, 300 ml di glicole etilenico, tampone fosfato 500 ml di 0,1 M, pH 7,4). Piastre di copertura with stagnola e conservare a -20 ° C per un uso futuro.
9. Raccogliere sezioni 1-4 pozzetti e lavare 3 volte in PBS.
10. Mount sezioni su vetrini da microscopio e coprioggetto. Lasciare i vetrini ad asciugare in un luogo buio.
11. Diapositive immagine utilizzando filtri appropriati per nativo YFP o tdTomato per controllare il modello trasduzione virus.

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Risultati

I rendimenti intraventricolare successo iniezione virale diffusa e robusta espressione neuronale. Qui abbiamo valutato trasduzione virale utilizzando YFP o tdTomato geni fluorescenti sotto il controllo del promotore di pollo beta actina (CBA promotore). Questi costrutti sono stati confezionati in AAV8 e iniettate nei ventricoli laterali di neonatali topi (P0) ICR. Titoli virali alti (10 ¹⁰ particelle per emisfero) hanno determinato l'etichettatura densa del bulbo olfattivo, striato, corteccia cerebrale, i...

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Discussione

Abbiamo descritto un procedimento versatile per la manipolazione genica neuronale utilizzando AAV come veicolo di distribuzione capillare nel cervello neonatale topo. Rispetto ad altri metodi di transgenesi neuronale, come in utero elettroporazione ¹ o iniezione stereotassica intracranica ^2,3, iniezione virale neonatale è relativamente facile e semplice. La procedura di base può essere eseguita in pochi minuti con solo un cestello di ghiaccio e una siringa microlitro. Sopravvivenza ottimale e di ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal