Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Riepilogo

I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

Abstract

Echinodermi sono stati a lungo un sistema modello preferito per gli studi di riproduzione e sviluppo, e più recentemente per lo studio della regolazione genica e di evoluzione dei processi di sviluppo. La stella di mare, Patiria miniata, sta guadagnando prevalenza come sistema modello per questo tipo di studi, che in precedenza erano svolte quasi esclusivamente nei ricci di mare, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Un vantaggio di questi sistemi modello è la facilità di produzione di embrioni modificati in cui un particolare gene è attivo o inibiti, etichettare un gruppo di celle, o introdurre un gene reporter. Un metodo microiniezione unico è in grado di creare un'ampia varietà di tali embrioni modificati. Qui, vi presentiamo un metodo per ottenere gameti da P. miniata, producendo zigoti, e l'introduzione di reagenti perturbanti tramite microiniezione. Embrioni sani morphant sono successivamente isolati per studi quantitativi e qualitativi di gefunzione ne. La disponibilità di genoma e trascrittoma dati di questo organismo ha aumentato i tipi di studi che vengono eseguite e la facilità di loro esecuzione.

Introduzione

La stella di mare, Patiria miniata, (comunemente noto come la stella pipistrello) sta emergendo come un interessante e versatile sistema modello per una varietà di cellulare ^{da 1 a 3,} dello sviluppo ^4,5, evolutiva ^{6- 8,} e studi ecologici ^{9- 11.} Adult P. miniata sono distribuiti lungo la costa del Pacifico da Sitka, in Alaska a Baja, California ¹² e sono facilmente mantenuti in acquari marini. Gli ovociti sono tutto l'anno ottenibili e ogni femmina può gettare decine di migliaia di uova. Gli ovociti sono facilmente maturati e fecondati esternamente ^13. Gli embrioni risultanti sono trasparenti consentendo una facile osservazione; si sviluppano in modo sincrono, e richiedono solo acqua di mare per lo sviluppo. Assemblaggio del genoma intero e più trascrittomi sono disponibili anche P. miniata ( Echinobase.org ). Tali vantaggi li rendono ideali per una gamma di ricercae scopi didattici.

Negli ultimi anni, P. miniata è diventato un sistema modello per gene dello sviluppo della rete di regolamentazione analizza ^{14- 16.} Lo scopo di questi studi è quello di identificare l'intero complimento di geni regolatori e determinare la rete delle loro interazioni. Molto di questo lavoro comporta l'espressione genica perturbante attraverso l'introduzione di oligonucleotidi antisenso o in mRNA sintetizzato in vitro. Inoltre, le analisi normative cis sono utilizzati per caratterizzare la funzione del DNA di regolamentazione ^15. Queste analisi richiedono l'introduzione di reagenti perturbazione e / o giornalista DNA costrutti in embrioni. Inoltre, per caratterizzare gli effetti a valle di tali perturbazioni, si deve eseguire il test di molti embrioni per cambiamenti nell'espressione genica di potenziali bersagli. Tecniche di microiniezione di molte centinaia di zigoti sono centrali per questo lavoro.

Echinodermi, tra cui P. miniata , richiedono molti mesi per raggiungere la maturità sessuale. A causa di questo, generalmente non è pratico per sviluppare e mantenere linee transgeniche di questi animali per la sperimentazione. Pertanto, l'allevamento di adulti transgenici non può in modo efficiente creare embrioni modificati. Invece, perturbazione deve avvenire de novo attraverso la microiniezione. Microiniezione offre l'opportunità di modificare gli embrioni con reagenti che non sono cellula-permeabili. Il seguente protocollo descrive un metodo per introdurre il DNA, mRNA, traccianti cellulari, e oligonucleotidi antisenso morfolino in centinaia di uova fecondate in un 2-3 ore seduto attraverso microiniezione. Questo produce materiale sufficiente per una serie di esperimenti a valle tra cui, ma non limitato a, qPCR, ibridazione in situ, RNA-Seq, e western blotting.

Protocollo

Conservare tutta l'acqua di mare o acqua di mare artificiale (SW), animali adulti, e le culture a 15 ° C per quanto è pratico. Assicurarsi che le uova e gli zigoti sono tenuti immersi in SW.

Sali marini in commercio preparati ricostituiti con acqua distillata o di osmosi inversa serve pure una fonte di SW. Controllare la salinità con un densimetro e regolare sali o acqua per raggiungere livelli ottimali. Mantenere i livelli di peso specifico tra 1,020-1,025. Mantenere la vetreria e plasticware separato da tutti gli altri Equipaggiamento per evitare qualsiasi contaminazione con sostanze chimiche. Pulire embrione di grado da laboratorio risciacquando con acqua deionizzata o occasionale ammollo in ipoclorito di sodio diluito seguita da risciacquo più volte in acqua.

1 Ottenere e maturazione gameti provenienti da Patiria miniata Adulti

1. Selezionare un animale per asportare gonadi. Determinare il sesso dopo l'asportazione, cercando la presenza di ovaie o testicoli perché P. miniata non sono sexually dimorfismo.
2. Tagliare una piccola apertura, non più grande di 1 cm, lungo il lato di un braccio stella di mare con una lama di bisturi (Figura 1A). Utilizzo di piccole pinze blunt-ended tirare indietro bordi della incisione per accedere al tessuto gonade e tirare il tessuto delle gonadi attraverso l'incisione.
   NOTA: Evitare di tirare fuori il tessuto intestinale, che è un allentato tessuto grigio o marrone (Figura 1B). Ovaie sono generalmente arancione, giallo o marrone chiaro (Figura 1C), mentre i testicoli sono di colore bianco o beige e quando perturbato causerà acqua di mare per diventare lattiginoso o nuvoloso in apparenza (Figura 1D).
3. Femmine Ritorno alle acquari. Isolare maschi per una o due ore in un contenitore di SW in quanto lo stress da manipolazione può indurre la deposizione delle uova. Animali guariscono lungo il sito di incisione e continuano a fornire gameti per diversi mesi.
4. Raccogliere testicoli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml con il minor SW possibile e conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso. Memorizzare qualsiasi testicoli non cied il giorno della raccolta a 4 ° C per un massimo di una settimana.
5. Raccogliere ovaie in un piccolo piatto di coltura di vetro in diversi millilitri di SW. Per rilasciare gli ovociti dal tessuto ovario, prendere in giro a parte il tessuto con due paia di pinze finché non rimangono pezzi di grandi dimensioni.
   NOTA: In modo ottimale, la maggior parte degli ovociti sono completamente sviluppati. Tali ovociti sono grandi, rotondi, e chiaro marrone giallo o chiaro con una vescicola germinale distinta nell'ovocita (Figura 2A), rispetto al sottoinsieme di ovociti non sviluppati che sono più piccoli, marrone, granulosa, e opaco (Figura 2B). Se è maggiore di circa il 25% degli ovociti sono della varietà sviluppata, selezionare una femmina diversa per ottenere ovociti.
6. Versare gli ovociti e tessuto rimanente attraverso una tazza filtro in maglia con dimensione dei pori di 200 micron e raccogliere il flusso attraverso. Questo conterrà tutte le varietà di ovociti, ma rimuovere il tessuto ovarico. Sloggiare rimanenti ovociti dal tessuto catturati dal filtro a spruzzo wesima SW da una bottiglia a zampillo. Filtrare tazze sono realizzati con un tubo da 50 ml (Figura 3A-A ').
7. Versare il flusso attraverso dal passaggio 1.6 attraverso un 100 micron tazza filtro a rete. Eliminare piccoli ovociti in flusso attraverso. Grandi ovociti pienamente sviluppati che sono pronti per la maturazione rimarrà sul filtro. Risciacquare gli ovociti in un bicchiere pulito 200 ml.
8. Aggiungere 95 ml di SW per il bicchiere di vetro 200 ml di ovociti. Aggiungere 5 ml di 200 mM 1-metiladenina per una concentrazione finale di 10 mM.
9. Trasferire gli ovociti ad un grande piatto di cultura superficiale e posto a 15 ° C. Una zona ad alta superficie piatto cultura del volume consente lo scambio di ossigeno. Gli ovociti non maturi o non possono sviluppare bene se sono sovraffollate durante questa fase di maturazione. Suddiviso in diversi piatti di SW oltre 10 mM 1-methlyadenine fino a quando la cultura è inferiore a 200 ovociti / ml.
10. Lasciare gli ovociti a maturare per 45-90 minuti, ma non più come questo renderà gli ovociti in grado di essere fertilized. Per determinare se la maturazione è completa, guardare gli ovociti in un ambito dissezione. Le vescicole germinali si muove verso e fonde con la membrana cellulare durante la maturazione. E poi si rompe e quindi non è più visibile in ovociti maturi (Figura 2C).

2 Concimazione di ovociti maturi

1. Ha scelto un piccolo gruppo di tessuto testicolare, circa pisello, e tritare in un piccolo piatto di coltura in vetro con circa 1 ml di SW.
2. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire 2-3 gocce di acqua di mare lattiginoso risultante a circa 100 ml di ovociti maturi e agitare il piatto cultura per mescolare. Evitare il trasferimento di pezzi di tessuto testicolare. Evitare l'aggiunta di maggiori quantità di sperma in quanto ciò potrebbe causare polispermia e successivo sviluppo poveri.
3. Dopo alcuni minuti di osservare gli ovociti in un ambito dissezione. Uova fecondate, o zigoti, hanno una busta di fecondazione, che è una cupola trasparente che si alza dal cell membrana (Figura 2D).
   NOTA: Non procedere con la cultura, se inferiore al circa il 90% di uova fertilizzare in quanto i tassi di fecondazione poveri sono un'indicazione di una cultura malsana che non può anche svilupparsi bene.
4. Dopo la fecondazione è completata, cambiare il SW sulle zigoti versando attraverso un filtro a maglia 100 micron e risciacquo in un piatto di cultura con SW fresca. E 'importante rimuovere lo sperma in eccesso per evitare carenza di ossigeno. Posizionare il piatto di coltura a 15 ° C per 15-30 min.

3 De-gelificante e Rowing fertilizzato le uova

1. Preparare piatti iniezione prendendo il coperchio da una piastra di Petri di 60 x 15 mm in polistirene.
   1. Tracciare una linea di pennarello indelebile sul retro del piatto, intorno alla zona che corrisponde al campo visivo del microscopio microiniezione. Questo assicura che tutti gli embrioni filari sono all'interno del campo di vista del microscopio.
   2. Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a segnare una linea attraverso il cerchio, preferably su un lato del cerchio (Figura 3B). Utilizzare questa linea in seguito a rompere aghi da iniezione (punto 4.5).
      NOTA: I reagenti comunemente utilizzati per aderire embrioni di riccio di mare, ad esempio, protamina solfato o poli-L Lisina, sono inutili. De-gelatina P. zigoti miniata aderiscono molto bene alla plastica non patinata. Si noti che non si attacchino bene a piatti di vetro.
2. Aggiungere circa 10 ml SW per ogni piatto in modo che la superficie è coperta, ma l'acqua non schizzare troppo nel piatto in quanto ciò potrebbe turbare gli embrioni filari più.
3. Rimuovere il P. miniata cappotto gelatina zigote con SW acido prima di canottaggio. Questo cappotto gelatina è più ampio di quello osservato per le specie di riccio di mare modello.
   1. Preparare acido SW nel range di pH 4,0-4,2. Il pH è fondamentale per consentire la rimozione efficace del cappotto gelatina pur permettendo il normale sviluppo.
   2. Aggiungere singole gocce di 1 N (1 M) HCl in SW di un 1 L stock di SW. Consentire ad ogni goccia per mescolare completamentee monitorare il pH prima di aggiungere altro HCl.
      NOTA: Uno a diversi ml di HCl risultati del pH del caso, ma non aggiungere l'intero volume in una sola volta.
      NOTA: Preparare 1 N HCl in cappa con SW e 12 N (12 M) HCl.
   3. Rimuovere SW su zigoti da loro versando su un filtro a maglia 100 micron. Risciacquare in un becher da 200 ml nella più piccola quantità di SW possibile (circa 10 ml). Riempire il bicchiere fino a 150 ml con SW acido (pH 4.0) e consentire gli zigoti di sedersi nel SW acido per 3 min.
4. Striscia gelatina cappotto dalle zigoti versando avanti e indietro tra due bicchieri da 200 ml, ogni volta che passa gli zigoti attraverso un filtro a maglie di 200 micron. Versare gli zigoti attraverso il filtro intorno 5-10x sopra su una finestra di tempo 2 min.
5. Rimuovere SW acido versando gli zigoti su un filtro a maglia 100 micron. Sciacquare gli zigoti in un piccolo piatto di coltura di vetro con SW. De-zigoti in gelatina possono attenersi a piatti di plastica. Embrioni immediatamente Row; cominciano a produrre più jelly cappotto che porta a scarsa adesione ai piatti di plastica nel tempo.
6. Utilizzare una pipetta a bocca (Figura 3C-C ') per prendere zigoti dalla cultura piatto di vetro e metterli in linee rette sulle stoviglie di iniezione. Sciogliere il centro del lato sottile di una pipetta Pasteur a fuoco finché il vetro è morbido. Rapidamente tirare le estremità del vetro a parte per produrre un sottile tratto di vetro. Una volta che il vetro è freddo, rompere la piccola estremità della pipetta Pasteur (per ulteriori informazioni sulla preparazione di una pipetta a bocca vedere Wessel et al., 2004 ¹⁷ o Dolce et al., 2004 ^18).
   1. Effettuare una pipetta remi tale che il diametro è appena superiore al diametro degli embrioni in modo che solo un singolo zigote sarà entrare ed uscire dalla pipetta alla volta. Ciò consentirà una singola riga per formare. Piccole pipette di diametro possono togliere la busta fecondazione e disturbare gli zigoti come P. zigoti miniata non hanno una membrana ialina unnd sono abbastanza morbido.
   2. Se gli zigoti non si attacchino al piatto di plastica, li conserva per più tempo a SW acido (fino a diversi minuti). In alternativa, una pipetta di diametro inferiore può essere di aiuto nella rimozione cappotto gelatina per consentire gli zigoti per attaccare in modo più efficace.
   3. Gli zigoti sono leggermente assetto positivo e tendono a galleggiare o soffermarsi appena sopra il fondo del piatto. In questo caso, posizionare la pipetta remi modo che gli zigoti pigiate delicatamente sulla superficie del piatto che escono dalla pipetta (Figura 3D).
      NOTA:. E 'possibile montare in molte righe su questi piatti P. membrane embrionali miniata non diventano più difficili da penetrare nel tempo e quindi si può iniettare centinaia di zigoti su un singolo piatto.

4 Iniezione di zigoti

1. Preparare le soluzioni di iniezione con adeguate concentrazioni di oligonucleotidi antisenso morfolino (MASO), mRNA, o DNA in una conc finaleentration di KCl 200 mM. 400-800 micron MASO e 2,5 ng / ml di DNA tendono a produrre fenotipi morphant riducendo al minimo la tossicità. La concentrazione finale l'uovo sarà 1/125 ^° della concentrazione di partenza ^14. Per soluzioni contenenti iniezione MASOS, calore a 65 ° C per 5 min immediatamente prima dell'uso e quindi memorizzare a temperatura ambiente.
   1. Per facilità di classificare gli embrioni iniettati, aggiungere rodamina destrano tracciante alla soluzione iniettabile per ottenere una concentrazione di 0,1%.
2. Preparare aghi da iniezione tirando tubo capillare di vetro (1,0 millimetri OD ID x 0,75 mm, 100 mm di lunghezza) in un ago di trazione strumento seguendo le istruzioni del produttore. Aghi adatti per l'iniezione di ricci di mare anche funzionare bene per le stelle di mare, in modo da utilizzare parametri simili ^19.
3. Caricare circa 2 ml di soluzione iniettabile in un ago per iniezione con una punta microloader pipetta.
4. Inserire l'estremità smussata dell'ago nel manipulator. Impostare picospritzer a 100 impulsi msec e una pressione d'aria di 40 PSI.
5. Posizionare un piatto di embrioni filari sul palco microscopio e hanno tutti gli embrioni nel campo visivo. Orientate il piatto in modo che la linea è segnato sul lato più vicino all'ago. Posizionare l'ago con un angolo di circa 60 ° in modo che la punta si trova vicino al centro della linea e appena sopra la superficie dell'acqua.
6. Focus sulla linea segnata e abbassare l'ago fino a quando la punta è a fuoco. Abbassare la punta un po 'di più e rompere aperto eseguendo delicatamente nelle creste della linea segnata. Sollevare la punta dalla superficie del piatto e posizionarlo nella parte superiore della prima riga di zigoti e concentrarsi sulle zigoti.
7. Abbassare la punta in modo che questo impalare il centro di zigote provenienti da circa un angolo di 60 °. L'ago penetra facilmente P. zigoti miniata. Passo sul pedale (o altri mezzi di forzatura materiale dal ago per iniezione) per introdurre un bolo di Injesoluzione ction in embrione.
8. Obiettivo per un bolo che è del 20-30% del diametro dell'embrione, o tra 25 e 80 pl. Se il bolo è più grande o più piccolo di questo, regolare la durata dell'iniezione sul picospritzer e iniettare il prossimo embrione. Continuare a regolare la durata per ottenere la dimensione del bolo desiderata. Inizia a 100 msec durata. Re-rompere l'ago se maggiore di circa 200 msec è necessario per introdurre il bolo appropriato. Gettare l'ago e preparare una nuova se è necessaria meno di 15-20 msec per ottenere queste dimensioni bolo come la dimensione dell'ago è troppo grande e può disturbare il normale sviluppo.
9. Procedere per iniettare i restanti zigoti sul piatto di iniezione. Gli embrioni possono facilmente essere iniettato fino a quando inizia la scissione e in singoli blastomeri dopo la prima scissione. Periodicamente sollevare l'ago sopra la superficie dell'acqua per rimuovere zigoti che sporgono sull'ago. Se necessario ri-rompere la punta dell'ago o caricare un nuovo ago se si verifica un blocco.

5. Collezionismo iniettato embrioni per l'analisi a valle

1. Lasciare gli embrioni si sviluppano a 15 ° C a SW. Mantenere elevata superficie e il volume nelle colture per consentire lo scambio di ossigeno. Assicurarsi che gli embrioni non sono affollate; tenere culture pari o inferiore a 200 embrioni / ml. A seconda della fase desiderata embrionale, prevede di raccogliere embrioni iniettati in circa 20-24 ore dopo la fecondazione.
   NOTA: Questo è spesso il momento ideale per ordinare e raccogliere e perché normalmente gli embrioni in via di sviluppo sono facilmente distinguibili morfologicamente, ma non sono ancora nuoto.
2. Se gli embrioni sono nati, salateli leggermente scossa per evitare il nuoto. Aggiungere 200 ml di NaCl 5 M a 10 ml di SW nel piatto iniezione mentre delicatamente roteare il SW. Dopo pochi minuti, gli embrioni cadranno al fondo del piatto. Raccogliere questi e spostarli alla normalità SW salinità.
3. Raccogliere embrioni iniettati sotto una sorgente luminosa fluorescente appropriato compatibile con il tracciante utilizzato nella injectisulla soluzione. Se non è stato utilizzato alcun tracciante, sorta di selezionare gli embrioni per la morfologia normale.
4. Usando una pipetta a bocca, disegnare fluorescente embrioni con una quantità minima di SW e soffiare fuori in un piccolo piatto pieno di cultura SW. Pipette bocca ideali hanno una grande apertura sufficiente per gli embrioni di essere tirato dentro e fuori senza danneggiarli, ma non così grande che gli embrioni indesiderati e SW estranei sono anche tirato su.
5. Una volta che tutti gli embrioni desiderati sono stati raccolti nel nuovo piatto, osservare gli embrioni sotto la luce fluorescente e rimuovere eventuali embrioni non-iniettato o embrioni poco sviluppati.
6. Cultura allineati embrioni a stadi desiderati in un incubatore e procedere con l'imaging o altri protocolli desiderati.

Risultati

L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre i reagenti in embrioni. Dimostriamo l'efficacia del protocollo iniettando un giornalista costrutto di DNA che guida l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP). Embrioni iniettati esprimono GFP a chiazze clonali (Figura 4A-B) in quanto incorpora il DNA durante la prima scissione. Molti reagenti che sono auspicabile introdurre in embrioni sono tossici in quantità elevate e per lotti non ottimali di embrioni. Manifesti di toss...

Discussione

Ci sono due passaggi critici che sono difficili per gli utenti meno esperti di questa tecnica, ma sono essenziali per la creazione di embrioni con successo morphant. La prima è la selezione ovociti sani che matureranno e fertilizzare correttamente. La percentuale di sviluppo normale in una cultura dipende dalla stagione, la salute dell'animale, e il numero di volte che gli ovociti sono stati raccolti da un singolo individuo. Gli oociti tendono ad essere di qualità migliore da aprile a ottobre. E 'importante gu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003