RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

Riepilogo

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Abstract

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introduzione

Gli studi genetici sugli organismi viventi utilizzano spesso l'embrione di pollo come modello perché in elettroporazione ovo rappresenta un modo veloce ed economico per transfettare parzialmente strutture embrionali in vivo con il DNA costruisce ^1-5. Vettori di espressione bicistronico che codificano una trascrizione contenente un reporter fluorescente insieme con il gene di interesse, quali pCIG ⁶ o pMES ^7, consentono un rapido controllo di qualità trasfezione regione specifica allo stereomicroscopio prima di elaborare embrioni per l'analisi a valle.

Con i recenti progressi nel sequenziamento del DNA, è ora possibile ottenere interi profili di espressione del trascrittoma digitali da campioni di RNA utilizzando RNA-Seq ^8,9. Pertanto, invece di metodi richiede tempo che consentono l'analisi di pochi prodotti genici in parallelo, come ibridazione in situ, immunoistochimica e qPCR, preparazione di librerie di cDNA perhigh-throughput sequencing in grado di fornire le informazioni di tutto il trascrittoma. L'osservazione degli effetti sperimentali sui livelli di espressione di ogni singolo gene può a sua volta fornire potenti approfondimenti sui percorsi alterati dal costrutto utilizzato. Ciò è particolarmente facile se un gruppo genomico per l'organismo utilizzato è disponibile, pertanto l'embrione pulcino è ancora un modello adatto.

Se l'utente ha accesso ad un affidabile centro di sequenziamento del genoma, il problema principale è l'ottenimento di campioni di RNA di alta qualità. Questo lavoro illustra un metodo per ottenere campioni di RNA da tubi neurali transfettate idonee per l'RNA-Seq, nonché le fasi a valle per analisi in silico delle serie di dati risultanti. Dopo l'elettroporazione in HH12-13 seguito da 48 ore di incubazione, tronco transfettate metà del midollo spinale sono stati sezionati in condizioni di assenza di ribonucleasi, immediatamente lisate e ulteriormente protetto dalla degradazione da ultra-low di congelamento fino purificazione dell'RNA e la biblioteca preparation.

Il server pubblico Galaxy ¹⁰ fornisce l'accesso alle risorse gratuite per l'analisi di dati di sequenziamento high-throughput. La quantità di spazio offerto agli utenti registrati è sufficiente per piccoli esperimenti, eliminando così la necessità di infrastrutture computazionale locale. Analisi dei dati di RNA-Seq include il filtraggio, l'allineamento e la quantificazione / confronto dell'espressione genica. Anche se ci sono linee guida generali per l'analisi dei dati di RNA-Seq, parametri di filtraggio dipenderà in larga misura la qualità della sequenza e devono essere determinate dopo l'analisi di controllo della qualità dei dati grezzi.

Questo protocollo descrive la procedura per ottenere e confrontare i profili di RNA-Seq da pollo embrionale midollo spinale trasfettate in vivo. Di conseguenza rappresentante, confronto di set di dati provenienti da due campioni di controllo indipendenti transfettate con un vettore vuoto ha mostrato che il metodo è riproducibile e dovrebbe permettere di identificare expres differenzialmentetrascrizioni sed in campioni sperimentali. Pertanto, l'applicazione di questo metodo ha il potenziale di aumentare notevolmente il numero di scoperte dopo un solo esperimento e fornire così una grande quantità di dati per successive indagini.

Protocollo

1. elettroporazione il costrutto di interesse nei tubi neurali della HH12-13 pollo embrioni in ovo

Utilizzare un reporter fluorescente, preferibilmente in una trascrizione bicistronico o fuso con la proteina di interesse con una intercalando 2a virale peptide ^11, per consentire una rapida identificazione di individui con livelli soddisfacenti di trasfezione. NOTA: il tempo di incubazione tipico per questa fase è di circa 48 ore a 37,8 ° C.

1. Aprire una piccola finestra nelle uova dopo la rimozione di 3 ml di albumina con una siringa accoppiato ad un 18 G x 1 1/2 ago. Per migliorare la visualizzazione dell'embrione, iniettare una piccola quantità di inchiostro di china diluito 1:50 con soluzione sterile di Ringer sotto l'embrione ^1-4.
2. Dopo che copre l'embrione con soluzione sterile di Ringer, iniezione di una soluzione 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% colorante alimentare (F, D & C) contenente 2,5 mg / mL di DNA attraverso l'estremità posteriore del tubo neurale fino a riempirefino alla regione romboencefalo. Per l'elettroporazione, elettrodi di platino posizione (0,5 mm di diametro) separati di 4 mm ¹ lungo la regione del fianco e consegnare 5 impulsi di 50 msec e 20 V con un intervallo di 100 msec tra loro ^4.
3. Dopo l'elettroporazione, incubare gli embrioni manipolati per 48 ore di più, fino a raggiungere fase HH23 e identificare persone fisiche che presentano elevato livello di trasfezione in corrispondenza della regione del fianco allo stereomicroscopio a fluorescenza.
   NOTA: La durata dell'incubazione dopo elettroporazione dipende dalla scopo dell'esperimento. I plasmidi elettroporate in grado di generare significativi livelli di espressione dopo 2 ore ^2. Pertanto, se l'interesse risiede nei geni insorgenza precoce del periodo di incubazione post-elettroporazione può essere ridotto.

2. Harvest trasfettate con successo embrioni e sezionare il Metà midollo spinale elettroporate

NOTA: Questa procedura dura 2-3 ore per ogni 10 embrioni e rese 1-2 Mg di RNA totale per ogni embrione. La dissezione dei tubi neurali richiede movimenti fini e alcune sessioni di prove potrebbe essere necessario prima di applicarlo ai campioni sperimentali.

1. Decontaminare strumenti di dissezione metalliche con soluzione RNase decontaminazione o di cottura a 150 ° C per 4 ore ¹² e preparare DEPC trattati con PBS. Utilizzare solo nuovo plasticware RNasi-free certificata.
   NOTA: Dopo la raccolta, è importante seguire le cure standard per prevenire la contaminazione RNasi durante la dissezione.
2. Raccogliere gli embrioni con un paio di belle forbici dissezione e un cucchiaio di raccolta setacciato. Mantenere gli embrioni a freddo DEPC trattati con PBS in una capsula di Petri a 100 mm.
3. Con un paio di pinzette sottili, tagliare l'intera regione del fianco (tra il limite posteriore della gemma dell'arto anteriore e il limite anteriore del germoglio posteriore dell'arto) e trasferire questa sezione in un piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS.
4. Usare due aghi di vetro sottili di perforare a tre diversipunti su ogni lato dorsolaterale dell'embrione tra il tubo neurale e il mesoderma parassiale.
5. Introdurre i due aghi di vetro nella foratura centrale e lentamente spostare uno di loro via lungo il tubo asse anteriore-posteriore neurale. Ripetere questa operazione per le perforazioni che non sono stati realizzati dai primi movimenti. Rimuovere il mesoderma parassiale indipendente con un paio di pinzette sottili.
6. Ruotare l'embrione lateralmente, inserire le punte delle pinzette tra il tubo neurale e la notocorda e farli scorrere in direzioni opposte lungo l'asse anteriore-posteriore per separare le due strutture.
   NOTA: Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte del mesoderma ancora attaccato al tubo neurale.
7. Se necessario, rimuovere tutti i pezzi più grandi di tessuto mesodermica che rimangono attaccate tirando con un paio di pinzette, mentre con delicatezza il tubo neurale con un altro paio di pinzette. Al termine, trasferire delicatamente il tubo neurale ad un altro piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS usando unaRNasi-free Pasteur pipetta di vetro accoppiato ad una pompa manuale pipetta e tenere in ghiaccio fino a quando tutti i tubi sono sezionati.
8. Dividere i tubi neurali in due metà. Per questo, inserire la punta affilata di un paio di pinzette chiuso nel lume e aprire la piastra di copertura spostando le pinzette attraverso esso. Dopo questo, separare le metà tagliando la piastra con le punte pinzette.
9. Ordina elettroporate da metà non elettroporate in un ambito dissezione fluorescenti e trasferire in una provetta da 1,5 ml riempito di ghiaccio freddo DEPC trattati con PBS. Se necessario, sfiora i microtubi delicatamente per rilasciare qualsiasi tessuto attaccato alle pareti di plastica e di promuovere sedimentazione dei tubi.
10. Spin a 100 xg per 3 secondi e rimuovere molto lentamente fino PBS possibile con un 1 ml micropipetta. Fate questo mentre guardando una fonte di luce che brilla attraverso la provetta per controllare se il materiale embrionale viene aspirato per la punta della pipetta; se questo accade, scarica lentamente e ripetere la centrifugazione.
11. Aggiungere 70 ml di soluzione di lisi per l'estrazione dell'RNA per la metà del tubo neurale e sfogliare la provetta per mescolare il contenuto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e mescolare vigorosamente nel vortex. Ripetere il 5 min di incubazione e vortex altre due volte. Conservare a -80 ° C.
12. Raccogliere almeno otto metà del tubo neurale per campione per assicurare un rendimento adeguato per il passaggio successivo. Pool campioni più piccoli se diverse sessioni di elettroporazione / dissezione sono tenuti ad accumulare sufficiente numero di tubi neurali. Conservare i campioni sufficienti per duplicati o triplicati per ogni condizione.

3. Purificare RNA e preparare librerie per Illumina Sequencing

1. Rimuovere i campioni da -80 ° C stoccaggio e disporli sul ghiaccio per 15-30 min. Riprendiamo scongelamento a temperatura ambiente fino a completa.
2. Vortex bene e lasciato a temperatura ambiente per 5 min. Nuovo Vortex e centrifugare a 15000 xg per 1 min a pellet materiale insolubile.
3. Trasferire il surnatante in una nuova provettae procedere con l'estrazione di RNA in base al totale isolamento di RNA istruzioni del manuale kit. Eluire nel volume minimo raccomandato per aumentare la concentrazione.
   NOTA: il trattamento DNasi dopo pulizia è consigliato al fine di evitare la potenziale contaminazione delle sequenze di DNA genomico in set di dati di RNA-Seq.
4. Flick la provetta per mescolare il contenuto e rimuovere 5 ml per l'analisi di controllo della qualità. Conservare il campione restante a -80 ° C fino preparato libreria; questi campioni devono essere scongelati solo una volta per evitare la degradazione dell'RNA.
5. Eseguire RNA purificato in uno strumento Bioanalyzer utilizzando il kit di RNA 6000 Nano; Valore RIN deve essere almeno superiore a 7 per procedere.
6. Generare le librerie utilizzando un kit di preparazione biblioteca RNA-Seq compatibile Illumina e multiplex fino a 4 librerie in una corsia di uno strumento HiSeq set di generare 100 bp singola legge. Se possibile, includere tutti i campioni nella stessa seduta di ridurre al minimo i potenziali artefatti tecnici.
   NOTA: Questo dovrebbe produrre fino a 50 milioni di reads per campione, che è più che sufficiente per ottenere la copertura per la maggior parte dei geni ^13.

4. Confrontare i set di dati di RNA-Seq nel server Galaxy pubblici ^10.

NOTA: lo spazio di archiviazione del server è limitato e sperimentazioni a confronto molti campioni può richiedere la cancellazione dei file intermedi generati nelle fasi di filtraggio.

1. Creare un account utente nel server pubblico Galaxy ( https://usegalaxy.org ) e FTP caricare i dataset Illumina in formato FASTQ.
2. Preparare i file caricati con lo strumento FastqGroomer ¹⁴ sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione; se i punteggi di qualità sono già codificati in Phred + 33 (Sanger), saltare questo passaggio semplicemente cambiando il tipo di file fastqsanger sotto gli attributi per ciascun set di dati.
3. Analizzare la qualità generale di ogni set di dati utilizzando lo strumento FastQC sotto la NGS: QC e manipolazione menu.
   NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere data alla grafica che ne derivano per il contenuto sequenza per sequenza qualità di base e per la base, in quanto questi forniranno stime per i parametri utilizzati per tagliare le estremità della legge.
4. Trim legge di scartare 3 'si conclude con i dati di bassa qualità con lo strumento FASTQ Qualità Trimmer ¹⁴ sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento per elaborare solo 3 'finisce per punteggio di qualità inferiore a 20.
5. Rimuovere sequenze adattatore dalla legge utilizzando lo strumento Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento di scartare legge con meno di 45 bp a sinistra, la sequenza di ingresso della scheda utilizzata e scegliere l'uscita di includere entrambe le sequenze tagliate e non tagliate. Inoltre, scegliere di non eliminare sequenze con basi sconosciute in quanto la maggior parte delle basi di bassa qualità sono stati già rimossi nell'ultimo passaggio.
6. Utilizzando lo strumento sequenze Trim ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sotto la NGS: QC e il menu di manipolazione, tagliare le prime basi della legge per rimuovere 5 'pregiudizi sequenza rilevato dal FastQC (in genere 10).
   NOTA: A questo punto, è una buona idea per eseguire nuovamente FastQC e confrontare con l'analisi precedente per determinare se la qualità del set di dati è stata migliorata.
7. Scaricare e scompattare l'ultima assemblea del genoma del pollo per il genoma del browser UCSC da Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) e caricare l'intero file in formato FASTA genoma e il file di formato GTF geni di annotazione alla storia Galaxy utilizzando il tool Upload File nel menu Dati.
8. Mappa legge per ciascun campione al genoma di pollo con l'allineatore TopHat2 ¹⁵ sottole NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare un genoma di Storia (selezionare il file FASTA caricato al punto 4.7).
9. Costruire un trascrittoma previsto per ogni campione mediante Gemelli ¹⁶ sotto i NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare l'annotazione di riferimento come guida (selezionare il file GTF caricato al punto 4.7) e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta.
10. Unisci trascrittomi previsti per tutti i campioni che utilizzano Cuffmerge ¹⁶ sotto la NGS: menu di RNA analisi. Scegliere di utilizzare annotazioni di riferimento (file GTF dal punto 4.7) e dati di sequenza (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7).
11. Confronta i file generati da BAM TopHat2 per ogni campione mediante Cuffdiff ¹⁶ sotto la NGS: menu di RNA analisi. Nelle trascrizioni di campo selezionare il metrascrittoma rged generato da Cuffmerge e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta.
12. Ordina espressione differenziale test tabelle numericamente ascendente nella colonna 13 (valore q) utilizzando lo strumento Dividi sotto il menu Filtro e ordinamento.
    NOTA: I geni / trascrizioni che mostrano espressione differenziale significativo tra le condizioni sperimentali presenterà i valori di q più bassi.
13. Per controllare i risultati visivamente con grafici di copertura, prima convertire i file in formato BAM bedGraph utilizzando lo strumento Crea una BedGraph di copertura del genoma ¹⁷ nel menu BEDTools. Disattivare la segnalazione delle regioni senza copertura, scegliere di trattare le voci giuntati come intervalli distinti e scalare la copertura di un fattore che normalizza la profondità sequenza per tutti i set di dati a confronto.
14. Convertire il file bedGraph risultante in formato pezzo grosso con ilstrumento parrucca / BedGraph-per-pezzo da novanta ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) sotto il menu Formati Converti. Caricare i file pezzo grosso come tracce personalizzati nel browser genoma UCSC ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) per il montaggio galGal4 e cercare un gene di interesse per visualizzare la copertura dei set di dati.

Risultati

Per convalidare il metodo descritto, due campioni di controllo sono stati generati da embrioni elettroporate con i pMES vuoto vettore ⁷ e un campione da embrioni trasfettate con lo stesso vettore contenente l'inserto costruire SCRT2-ZNF, che codifica i domini zinc-finger di pollo SCRT2 ^18. I campioni che producono 11-22 mg di RNA totale sono stati ottenuti da ciascun pool di 8 a 12 embrioni. Tutti e tre i campioni ottenuto un valore ottimale RIN 10 a un controllo di qualità eseguito con lo str...

Discussione

Qui forniamo linee guida per l'analisi degli effetti dopo l'elettroporazione del pollo midollo spinale. Anche se l'elettroporazione di vettori di DNA viene più spesso utilizzato per iperespressione di un gene di interesse, si può anche usare costrutti codificanti dominanti negativi, proteine ​​quimeric o precursori per siRNA per generare condizioni di funzione del gene knock-down ^19-21. In realtà, il confronto dei profili trascrittoma derivanti sia da GAIN- e analisi di perdita-di-funzione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002