Analisi rapida e robusta di Cellulare e Molecolare polarizzazione indotta da chemochine Signaling

Riepilogo

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Abstract

Le cellule rispondono alla stimolazione chemochine, perdendo la loro forma rotonda in una polarizzazione processo chiamato, e alterando la localizzazione subcellulare di molte proteine. Tecniche di imaging classici sono stati usati per studiare questi fenomeni. Tuttavia, hanno richiesto l'acquisizione manuale di molte cellule seguite da tempo quantificazione della morfologia e la co-localizzazione della colorazione di decine di cellule. Qui, un metodo rapido e potente è descritto per studiare questi fenomeni su campioni costituiti da diverse migliaia di cellule usando un flusso di imaging citometria tecnologia che combina i vantaggi di un microscopio con quelle di un citometro. Utilizzando linfociti T stimolate con CCL19 e colorazione per le molecole MHC di classe I e actina filamentosa, una strategia di gating è presentato per misurare simultaneamente il grado di alterazioni di forma e la misura di co-localizzazione di marcatori che sono affetti da segnalazione CCL19. Inoltre, questa strategia ci ha permesso di gating Observe la segregazione di actina filamentosa (nella parte anteriore) e fosforilata proteine ​​Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (nella parte posteriore) in cellule T polarizzate dopo la stimolazione CXCL12. Questa tecnica è anche utile per osservare l'effetto di blocco sulla polarizzazione di due elementi differenti: inibizione della polimerizzazione mediante un inibitore farmacologico ed espressione dei mutanti del Par6 / atipica PKC percorso di segnalazione. Così, la prova viene dimostrato che questa tecnica è utile per analizzare sia le alterazioni morfologiche e redistribuzioni di proteine.

Introduzione

Chemochine sono piccole proteine ​​solubili che attirano le cellule a posizioni specializzate ^1. Pertanto, partecipano al corretto posizionamento delle cellule in tessuti, una funzione cruciale per lo sviluppo e la fisiologia. Il sistema immunitario non fa eccezione a questa regola in quanto si basa sull'azione di molti diversi tipi di cellule che agiscono di concerto per montare una risposta immunitaria efficace. Controllando la posizione specifica di un tipo di cellula immunitaria in un dato stato, chemochine sono pre-preliminare antigeni estranei possono essere rilevati e neutralizzati.

In linfociti T in particolare, chemochine si legano a specifici recettori di superficie che, dopo l'impegno, suscitano molti segnali intracellulari (aumento di calcio, ERK fosforilazione, attivazione Rho GTPasi, aumento delle integrine affinità e citoscheletro alterazioni) che favoriscono la motilità cellulare T ^2,3. A livello cellulare, si possono osservare alterazioni morfologiche indotte dopo stimolazione chemochine.Questi cambiamenti nella forma delle cellule sono particolarmente drammatica in cellule T: cellule T riposo hanno una morfologia rotonda tallone-come quando si viaggia nel flusso sanguigno. Tuttavia, il rilevamento della presenza di chemochine in siti infiammatori o in prossimità degli organi linfoidi sta per cambiare la forma delle cellule T che ora adottano una tipica morfologia "hand-mirror" costituito da un modulo bipolare: un bordo d'attacco al fronte e un bordo di uscita, o uropod, sul retro ^4. Inoltre, componenti intracellulari possono dividersi in queste due regioni opposte di una cellula T polarizzata per sostenere la migrazione. Ad esempio, i filamenti di actina polimerizzazione aumenta su chemochine stimolazione ⁵ e actina polimerizzata accumula nella parte anteriore di una T cellule polarizzate ^2. D'altra parte, diverse proteine, come le proteine ​​fosforilate della Ezrin-radixina-Moesin (ERM) famiglia che collegano la membrana plasmatica della corticale citoscheletro F-actina, ri-localizzano al uropod di polarizzataCellule T ^6. È interessante notare che, noi e altri hanno dimostrato che questo processo di polarizzazione è necessario per la migrazione delle cellule T. Infatti, qualsiasi trattamento che interferisce con la polarizzazione inibisce la motilità cellulare. Per esempio, l'inibizione dell'attività dei membri della proteina atipica chinasi C (PKC) famiglia, polarizzazione cellulare PKCζ e PKCι blocchi T e il loro processo di scansione migratoria delle cellule dendritiche ^7. Polarizzazione delle cellule T è anche regolato da Rho GTPasi. Abbiamo dimostrato che la modulazione dell'attività RhoA dalla proteina Fam65b recentemente descritta interferisce con i cambiamenti nella morfologia delle cellule T e la loro capacità di migrare in un saggio Transwell ^6. Come polarizzazione è un passo prerequisito per la motilità cellulare, è quindi essenziale essere in grado di quantificare come lettura principale di risposte chemochine. Alterazioni di forma delle cellule sono stati precedentemente misurati manualmente ^8. Tuttavia, questo tipo di quantificazione è molto in termini di tempo, in modo che di solito solo pochidecine di cellule sono presi in considerazione.

Qui, un nuovo metodo viene presentato per quantificare rapidamente il grado di alterazioni forma di T linfociti esposti a chemochine stimolazione. Un flusso di imaging citometria tecnologia (vedere Tabella di reagenti specifici / Equipment) viene utilizzato, che combina i vantaggi di un citofluorimetro e un microscopio ⁹ quantificare efficacemente la quantità di cellule polarizzate in diverse condizioni di stimolazione chemochine. Oltre alla quantificazione delle alterazioni morfologiche che si può misurare robusta con questa tecnologia, è anche possibile valutare le variazioni di localizzazione subcellulare di alcune proteine ​​su segnalazione chemochine.

Protocollo

1. Preparazione di linfociti T

1. Preparare principale del mouse o cellule T umane come descritto ^10,11.
2. Coltivare cellule T umane in mezzo completo RPMI con 10% siero umano AB ad una densità di 2 - 3 x 10 ⁶ cellule / ml.
   NOTA: L'uso di siero fetale di vitello (FCS) invece di siero umano può suscitare polarizzazione spontanea di una grande frazione di cellule T umane in coltura. Conservare queste cellule in coltura per 4 - 5 giorni ed ulteriormente processo in qualsiasi momento durante questo periodo.
3. Mantenere cellule T del mouse in mezzo completo RPMI supplementato con 10% FCS ad una densità cellulare simile. Utilizzare subito o il giorno successivo, dopo una / cultura O N a 37 ° C, in presenza di 10 ng / ml IL7.
4. Coltivare la linea cellulare T CEM umano completo RPMI supplementato con 10% FCS.

2. chemochine Stimolazione

1. Lavare 5 x 10 ⁵ cellule per condizione sperimentale in caldo medio HBSS integrato con Hepe 10 mMs. Per alcuni esperimenti, co-trasfettare cellule T umane primarie il giorno prima con 2 ug pmaxGFP e 8 mg pcDNA3.1 ⁺ (vettore vuoto, controllo), PKCζ chinasi morti, o N-terminali plasmidi PAR6.
2. Risospendere il pellet di cellule in warm medio HBSS-Hepes (utilizzare 0,3 ml x numero di condizioni sperimentali).
3. Distribuire le cellule in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
   NOTA: Pertanto, un tubo corrispondente ad una singola condizione sperimentale conterrà 5 x 10 ⁵ cellule in 0,3 ml di HBSS-Hepes medie. Per alcuni esperimenti, aggiungere 500 nM Latrunculin A o veicolo (DMSO) e incubare le cellule per 30 minuti prima della stimolazione chemochine.
4. Aggiungere da 10 a 500 ng / ml CCL19 o CXCL12 chemochine in ciascun tubo.
   NOTA: Usiamo solitamente 10-200 ng chemochine / ml per le cellule T umane. Cellule CEM non esprimono il recettore CCR7 che lega CCL19. Pertanto, le cellule CEM saranno in grado di rispondere a una stimolazione CXCL12. Inoltre, utilizzare concentrazioni più elevate chemochine (300-500 ng / ml) per polarizzare cellule T del mouse.
5. Capovolgere i tubi diverse volte e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 8 o 10 minuti per le cellule T primarie o CEM, rispettivamente.
6. Arrestare il processo di polarizzazione aggiungendo a ciascuna provetta 0,3 ml di una soluzione calda contenente 2% paraformaldeide (PFA) e 10 mM Hepes in PBS. Vibrazione le provette e incubare a 37 ° C per 5 min.

3. colorazioni

1. Trasferire le cellule dai tubi microcentrifuga di citometria a flusso tubi.
2. Riempire i tubi completamente con una soluzione contenente RT 1% di albumina sierica bovina (BSA), EDTA 0,5 mM e 10 mM Hepes in PBS.
3. Centrifugare le provette a 460 g per 4 min.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di una soluzione RT contenente 5% FCS in PBS.
5. Aggiungere 5 ml di FITC-anti-HLA-ABC in ogni provetta, li vortice, e incubare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
6. Lavare le cellule una volta con PBS contenente 5% FCS, unnd una volta con solo PBS.
7. A RT: aggiungere 500 microlitri 1% PFA, incubare per 10 min, poi lavare le cellule con una soluzione contenente 1% BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM in PBS.
8. Eliminare il surnatante, riempire completamente i tubi con una soluzione di PBS contenente 0,2% di BSA, 0,1% saponina, 0,5 mM EDTA e 10 mM Hepes (buffer permeabilizzazione).
9. Lavare le cellule due volte in questo mezzo.
10. Capovolgere i tubi per rimuovere il supporto e vortice li dissociare il pellet.
11. Aggiungere 0,25 mg / ml TRITC-falloidina e / o di una diluizione 1: 100 di anticorpi anti-P-ERM a ciascuna provetta, li vortex e incubare per 30 minuti a RT.
12. Lavare le cellule con il buffer permeabilizzazione. Incubare con un anticorpo secondario fluorescente se necessario.
13. Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS e trasferirli ai tubi microcentrifuga.
    NOTA: Le cellule sono pronte per l'acquisizione. Alternativamente, pur mantenendo un volume massimo totale di 200 microlitri per provetta, aggiungere PFA concentrata ad una finale 1%concentrazione al fine di preservare le colorazioni se non devono essere utilizzate le cellule lo stesso giorno per ulteriore elaborazione.

4. Immagini Acquisizione e analisi

1. Accendere l'apparecchio (vedi tabella di reagenti specifici / Equipment) e lasciarlo calibrare stesso, in base alle istruzioni del produttore.
   NOTA: Il software INSPIRE è stato utilizzato con un obiettivo 40X (0,75 NA). Il software IDEAS 3.0 è stato utilizzato per tutte le quantificazioni segnalati.
2. Preparare una serie di finestre di acquisizione che possono essere salvate in un modello per futuri esperimenti. Disegnare istogrammi che quantificano i valori di gradiente RMS. Dalla popolazione "In Focus", selezionati sulla RMS istogramma pendenza, delimitano la popolazione "cella singola" su un istogramma della zona. Una volta che la provetta è stata inserita nella macchina, regolare la potenza del laser, cancello a cellule singole e acquisire 5.000 T linfociti.
3. Nelle idee morbideware, aprire il file di acquisizione e creare un istogramma che mostra il valore del valore RMS gradiente per le immagini con sfondo chiaro (Canale 1) ottenuto per ogni singola cella. Disegnare un cancello sulla gradiente istogramma RMS che considera le cellule espositrici RMS valore gradiente sopra 57.
   NOTA: Il gradiente RMS permette di prendere in considerazione nell'analisi solo i linfociti T che sono nel piano focale. Abbiamo determinato empiricamente che singole cellule che presentano un valore di gradiente RMS superiore a 57 sono nel piano focale, e possono essere considerati accuratamente.
4. Nel menu Analysis / Maschere, creare una nuova maschera, chiamato Erode (M01,2) dalla maschera morfologia sulle immagini brightfield M01, eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova caratteristica della zona, calcolato sulla maschera Erode (M01,2). Dalle celle selezionate nel cancello precedente, aprire un istogramma che mostra l'area di celle che utilizzano questa maschera appena creato.
   La morfologia maschere che sono disponibili: NOTEpredefinito è molto più grande della dimensione reale della cella. Pertanto, è più preciso di erodere fino a 2 pixel.
5. Disegnare una porta sulle singole cellule T, escludendo sferette di calibrazione e detriti (piccola area) e le doppiette (Large Area). Regolare questa porta ad ogni acquisizione.
   NOTA: Variazioni nella dimensione della cella influenzerà la posizione del cancello. Come cellule T topo sono più piccoli delle cellule T umane che sono a loro volta inferiori cellule CEM, l'area di ogni tipo di cellula sarà proporzionale alle sue dimensioni.
6. Considerando i singoli, in-fuoco cellule che sono state gated ai passi precedenti, aprire un diagramma a punti costituito dal grezzo Max Pixel sulla colorazione HLA-ABC (canale 2, asse x) in funzione del grezzo Max Pixel sul falloidina colorazione (Channel 4, l'asse y). Creare una porta per escludere gli eventi fluorescenti senza macchia o saturi. Aperte due istogrammi che mostrano la Raw Max Pixel per HLA-ABC (Canale 2) e falloidina (Channel 4) colorazioni.
7. Nel Analysis / menù Maschere, createa nuova maschera, chiamato Erode (M02,2) dalla maschera morfologia delle cellule HLA-ABC macchiati (Canale 2), eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova funzione che consiste del parametro circolarità, calcolato sulla Erode (M02,2).
   NOTA: Questo parametro misura la deviazione della forma cellula da un cerchio. Pertanto, una cellula T perfettamente rotonda avrà un valore elevato circolarità che cellule polarizzate allungate esporrà un indice circolarità bassa.
8. Successivamente, creare un istogramma che riporterà i valori della funzione Circolarità dalle cellule gated precedenza. Utilizzare questo istogramma per tracciare direttamente la distribuzione di un individuo, popolazione cellulare a fuoco secondo il valore della circolarità per ogni singola cella.
9. Guardando la forma dell'istogramma per cellule non stimolate, elaborare un cancello per cellule polarizzate, a partire dal valore circolarità basso fino al valore limite circolarità dove la maggior parte delle cellule non stimolatesono tracciate. Guardate il display statistiche per la percentuale di cellule polarizzate tra la popolazione gated (% Gated).
   NOTA: Abbiamo impostato questa porta per valori di indice circolarità sotto 13.
10. Per guardare la polarizzazione della colorazione actina nelle cellule, tracciare un istogramma del brillante dettaglio valore Similarity R3, confrontando la colorazione HLA-ABC (canale 2) e la colorazione falloidina (Channel 4).
    NOTA: Più grande è il valore di questa funzionalità, il più sovrapposto le due colorazioni sono.
11. Utilizzando la stessa strategia di gating come prima, tracciare una porta e sulle cellule non stimolate per la colorazione segregato che mostra la percentuale di cellule con colorazione polarizzata actina.
12. Al termine, la percentuale di cellule che mostrano un segregazione nella distribuzione del MHC di classe I e colorazioni falloidina, la percentuale di cellule polarizzate insieme con i valori medi degli indici di similarità e circolarità di tutte le celle ± SD sono mostrati in correspStatistiche onding pannelli.

Risultati

Il primo esempio scelto qui riguarda l'uso di linfociti T primari umani stimolati con CCL19. Tuttavia, la stessa strategia può essere utilizzata con le cellule T di topo primaria, linee cellulari T o qualsiasi altro tipo di cellula sensibile alla stimolazione chemochine. La strategia di gating qui presentato comprende una serie di finestre che selezionano gli eventi focalizzato, poi le singole celle. Infine la gamma di intensità di fluorescenza è seguito come esempio su due marcatori: MHC classe I HLA-ABC e actin...

Discussione

Usando una tecnologia recente del flusso di imaging citometria, una strategia rapida ed informativo gating per analizzare gli eventi cellulari e molecolari indotti dalla stimolazione chemochine è presentato. Da un unico esperimento, si possono ottenere due tipi principali di informazioni: le variazioni di morfologia cellulare indotta da chemochine stimolazione e la distribuzione subcellulare di proteine ​​differenti durante il processo di polarizzazione. È interessante notare che la prova è prevista anche la poss...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis