Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Riepilogo

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

Regolamentato degradazione delle proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni funzione cellulare. Inizialmente Molto di ciò che è noto circa i meccanismi molecolari e requisiti genetici per eucariotica degradazione delle proteine ​​è stato fondato nel Saccharomyces cerevisiae. Analisi classici di degradazione delle proteine ​​hanno fatto affidamento su metodologie pulse-chase e cicloeximide-chase biochimici. Mentre queste tecniche prevedono mezzi sensibili per osservare la degradazione delle proteine, sono complessi, in termini di tempo, e bassa produttività. Questi approcci non sono suscettibili di screening rapido o su larga scala per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per l'identificazione facile dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​è descritto. In questo saggio, un enzima giornalista necessari per la crescita in condizioni selettive specifiche è fuso ad una proteina instabile. Le cellule privi del giornalista enzima endogeno, ma che esprimono la proteina di fusione può crescere sotto selecondizioni ctive solo quando la proteina di fusione è stabilizzato (cioè quando la degradazione delle proteine ​​è compromessa). Nel saggio di crescita qui descritto, diluizioni seriali di wild-type e le cellule di lievito mutanti che ospitano un plasmide codificante una proteina di fusione sono macchiati su terreno selettivo e non selettivo. Crescita in condizioni selettive è coerente con la degradazione compromissione da una determinata mutazione. Una maggiore abbondanza di proteine ​​deve essere confermata biochimicamente. Un metodo per la rapida estrazione di proteine ​​di lievito in una forma adatta per elettroforesi e western blotting è anche dimostrato. Una lettura di crescita a base per la stabilità proteica, combinato con un semplice protocollo per l'estrazione di proteine ​​per l'analisi biochimica, facilita la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine ​​di breve durata. Nell'esempio presentato, l'enzima HIS3, che è richiesto per la biosintesi istidina, è stata fusaa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 è mirato per la degradazione dopo si innesta aberrante reticolo endoplasmatico translocon. Le cellule che ospitano Deg1 -Sec62-HIS3 sono stati in grado di crescere in condizioni selettive quando la proteina è stato stabilizzato.

Introduzione

Degradazione delle proteine ​​selettiva è essenziale per la vita eucariotica, e alterata degradazione delle proteine ​​contribuisce ad una serie di condizioni mediche, tra cui diversi tipi di cancro, malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, e la fibrosi cistica ^1-5. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), che catalizza la degradazione delle proteine ​​selettivo, è un obiettivo terapeutico emergente per queste condizioni ^6-10. Ubiquitina ligases covalente attribuiscono polimeri dell'acido ubiquitina 76-amino alle proteine ^​​11. Le proteine ​​che sono stati marcati con catene polyubiquitin sono riconosciuti e proteolyzed dai ~ 2,5 megadalton proteasoma 26S ^12. Gli studi avviati nel organismo modello eucarioti Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono fondamentale nella spiegazione dei meccanismi di degradazione delle proteine ​​nelle cellule eucariotiche. Il primo substrato fisiologico dimostrato dell'UPS era il lievito repressore trascrizionale MATα2 ¹³, 14, e molti componenti altamente conservati dell'UPS stati identificate o caratterizzate dal lievito (es ^15-26). Scoperte fatte in questo versatile e geneticamente trattabili organismo modello è probabile che continueranno a fornire importanti informazioni sui meccanismi conservati di degradazione ubiquitina-mediata.

Il riconoscimento e la degradazione della maggior parte dei substrati UPS richiedono l'azione concertata di diverse proteine. Pertanto, un obiettivo importante nel caratterizzare il degrado regolamentato di una data proteina instabile è quello di determinare i requisiti genetici per proteolisi. Approcci classici (ad esempio impulso-chase e esperimenti cicloeximide-chase ²⁷⁾ per il monitoraggio degradazione delle proteine ​​in cellule di mammifero o di lievito sono laborioso e richiede molto tempo. Mentre questi tipi di metodi forniscono mezzi altamente sensibili per la rilevazione degradazione delle proteine, non sono adatti per l'analisi rapida di degradazione delle proteine ​​o screeni larga scalang per le mutazioni che impediscono la degradazione delle proteine. Qui, un test basato su una crescita del lievito per la rapida identificazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​instabili è presentato.

Nel metodo basato su crescita del lievito per analizzare degradazione delle proteine, una proteina instabile di interesse (o segnale di degradazione) è fusa, in cornice, per una proteina che è necessario per la crescita del lievito in circostanze specifiche. Il risultato è un substrato artificiale che può servire come un potente strumento per determinare i requisiti genetici di proteine ​​degradazione della proteina instabile di interesse. Convenientemente, ceppi di lievito laboratorio più comunemente utilizzati ospitano un pannello di mutazioni nei geni che codificano enzimi metabolici coinvolti nella biosintesi di particolari amminoacidi o basi azotate (ad es ^20,28-30). Questi enzimi sono essenziali per la proliferazione cellulare in assenza di metaboliti esogenamente fornite in cui sintesi enzimi partecipano. Taleenzimi metabolici possono quindi funzionare come reporter di crescita a base per la degradazione delle proteine ​​instabili a cui sono fusi. I requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​possono essere facilmente chiarita, in quanto le mutazioni che impediscono proteolisi permetteranno cellule che ospitano il giornalista degrado di crescere in condizioni selettive.

Un vantaggio di crescita è un'indicazione indiretta che una particolare mutazione aumenta l'abbondanza della proteina di interesse. Tuttavia, l'analisi biochimica diretta è necessario per confermare che una mutazione permette di crescita attraverso l'aumento dei livelli di proteine, piuttosto che tramite cause indirette o artefatti. L'effetto di una mutazione della proteina abbondanza può essere confermata da analisi Western Blot dei livelli di proteine ​​steady-state in cellule che fanno e non ospitano la particolare mutazione. Un metodo per l'estrazione rapida ed efficace delle proteine ​​di lievito (incubazione sequenziale di cellule di lievito con idrossido di sodio e tampone) in una forma adattaper l'analisi mediante western blotting è presentato anche ^{il 31.} Insieme, questi esperimenti facilitare la rapida identificazione dei regolatori candidati di degradazione delle proteine.

Protocollo

1. Lievito crescita Assay identificare Mutanti candidati difettosi in Protein Degradation

1. Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante una proteina fusa instabili, in cornice, per un enzima giornalista metabolica.
2. Seminare trasformanti in 5 ml di sintetico definito (SD) terreno minimo che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ di ciascuna coltura durante la notte.
   NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un diametro minimo _{di 600} di 0,2. Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
4. Preparare sei diluizioni seriali di cellule di lievito trasformate in una piastra a 96 pozzetti sterili, a cominciare con le cellule diluite in unn OD ₆₀₀ di 0,2. Posizionare ogni trasformante lievito per essere analizzati in una riga differente nella piastra a 96 pozzetti.
   1. Per ciascun trasformante, calcolare il volume di coltura overnight necessaria per diluire le cellule ad una OD ₆₀₀ di 0,2 in un volume finale di 200 microlitri. Aggiungere questo volume di coltura durante la notte per pozzetto corrispondente nella colonna 1. Aggiungere la quantità appropriata di acqua sterile per portare il volume a 200 ml.
   2. Per ciascuna fila di lievito, aggiungere 125 ml di acqua sterile ai pozzetti nelle colonne 2, 3, e 4.
      NOTA: piastre a 96 pozzetti sterili confezionati singolarmente possono essere forniti con coperchi sterili. I coperchi possono essere utilizzati come serbatoi per l'acqua sterile che viene distribuito in questa fase. Questo consente il trasferimento simultaneo di acqua sterile a tutti i pozzetti in una data colonna con una pipetta multicanale.
   3. Mescolare il contenuto della prima colonna (lievito diluito ad una OD ₆₀₀ di 0,2) pipettando su e giù con una pipetta multicanale.
   4. Trasfer 25 ml di lievito dalla colonna 1 alla colonna 2, utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù. Trasferire 25 ml da Colonna 2 a colonna 3, e 25 ml di Colonna 3 Colonna 4 (mescolando bene ad ogni passo).
5. Mescolare ogni campione con una pipetta multicanale. Procedendo da più diluito per almeno diluire colonne di lievito, pipetta 4 microlitri di ciascun campione su due piastre contenenti il ​​terreno selettivo appropriato. Utilizzare una piastra con mezzo che mantiene selezione plasmide (questo piatto serve come un avvistamento lievito e controllo della crescita). Utilizzare una seconda piastra con mezzo che seleziona per plasmide manutenzione e l'espressione della proteina fusa instabile all'enzima giornalista. Perché lievito risolvere rapidamente, mescolare le cellule pipettando su e giù a intervalli regolari.
   NOTA: Drier piatti saranno più facilmente assorbire il liquido di piatti preparati al momento e quindi sono consigliati per questi esperimenti. Piatti umidi possono essere essiccati per incubazione a temperatura ambiente in loumidità w per 1 - 2 giorni o incubazione più brevi in ​​una cappa a flusso laminare. Le piastre possono asciugare in modo non uniforme se il flusso d'aria laminare è parallelo al banco. L'uso di un modello rende più facile individuare cellule di lievito a distanze regolari. Due modelli di esempio sono forniti in Figura 1. Questi possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri.
6. Lasciare le piastre ad asciugare sul banco.
7. Incubare le piastre a 30 ° C per 2 - 6 giorni.
8. Fotografa ogni piatto dopo l'incubazione.

Figura 1. Modelli per individuare le cellule di lievito su 100 mm piastre di agar. Questi modelli possono essere utilizzati per facilitare individuare lievito a distanze regolari con una pipetta multicanale. I modelli possono essere stampati, tagliati, e incollate all'interno di un coperchio piatto Petri. Posizionare piastra Petri con la crescitaCoperchio all'interno media con template apposto. I modelli sono contrassegnati da una tacca per monitorare l'orientamento. Si raccomanda che le piastre utilizzate in saggi di crescita sono parimenti segnalate con una tacca per monitorare l'orientamento. Modelli per individuare quattro (A) o cinque (B) sono previsti diluizioni seriali di cellule di lievito. Cliccate qui per vedere una versione stampabile di questa figura con i modelli da 100 mm.

2. Conferma biochimica di Assay Crescita Lievito

1. La crescita di cellule di lievito e di post-alcalino di estrazione di proteine ​​(modificato da ³¹⁾
   1. Transform wild-type e mutanti cellule di lievito con un plasmide codificante la proteina instabile.
   2. Seminare trasformanti in 5 ml di terreno SD che è selettiva per le cellule che ospitano le molecole plasmidi. Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
   3. Misurare la OD ₆₀₀ di ogni cu nottelture.
      NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule possono essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria, ma dovrebbe aver raggiunto un OD ₆₀₀ che permetterà di diluizione per una OD ₆₀₀ di 0,2 in 10 ml di terreno selettivo fresco (punto 2.1.4). Molto crescita lenta lieviti possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
   4. Diluire le cellule di lievito ad una OD ₆₀₀ di 0,2 in 10 ml di mezzo fresco selettiva.
   5. Continuare a incubare cellule a 30 ° C, la rotazione o agitazione, fino a quando le culture raggiungere un diametro esterno _{di 600} tra 0,8 e 1,2 (cioè sono in crescita mid-logaritmica).
      NOTA: Se la proteina instabile di interesse sotto il controllo di un promotore regulatable, tempi ottimali per l'induzione dell'espressione della proteina e la raccolta delle cellule può variare secondo studi precedenti o osservazioni empiriche.
   6. Raccogliere 2,5 OD ₆₀₀ unità di cultura in 15 ml conicaal tubo mediante centrifugazione a 5000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
      NOTA: Un OD ₆₀₀ unità è definita come la quantità di lievito presente in 1 ml di coltura a OD ₆₀₀ di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere 2,5 OD ₆₀₀ unità (V) può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: V = 2,5 OD ₆₀₀ unità / OD ₆₀₀ misurato
   7. Risospendere le cellule in 1 ml di acqua distillata. Trasferire le cellule in sospensione in una provetta.
   8. Agglomerare cellule per centrifugazione a 6.500 xg per 30 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
   9. Risospendere le cellule in 100 ml di acqua distillata pipettando su e giù o vortex, e aggiungere 100 ml 0.2 M NaOH. Mescolare pipettando su e giù. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente.
   10. Cellule pellet (la maggior parte dei quali non hanno ancora rilasciato proteine ​​e sono ancora vitali) per centrifugazione a 18.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
   11. Risospendere pellet in 50 - 100 microlitri tampone 1x Laemmli, che la lisi delle cellule, pipettando su e giù o vortex.
       NOTA: La rimozione del surnatante dopo la centrifugazione alcalina e successiva risospensione delle cellule in tampone campione Laemmli estrae proteine ​​a pH compatibile con sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone Tris-glicina esecuzione e western blotting.
   12. Per denaturare completamente proteine, lisati incubare a 95 ° C per 5 min.
       NOTA: proteine ​​di aggregazione-inclini (ad esempio proteine ​​con diversi segmenti transmembrana) possono diventare insolubili quando incubato a 95 ° C. Pertanto, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 min, come determinato empiricamente, per l'analisi di tali proteine.
   13. Lisati fresco mettendo in ghiaccio per 5 min.
   14. Lisati centrifugare a 18.000 g per 1 minuto a temperatura ambiente a pellet materiale insolubile. Separare il surnatante (proteina estratta solubilizzato) per SDS-PAGE prima successiva analisi Western Blot (punto 2.2). In alternativa, negozio lisati a -20 ° C.
2. Rappresentante Protocollo Blotting occidentale
   1. Caricare empiricamente determinato volume di lisati in un gel SDS-PAGE.
   2. Eseguire gel a 200 V fino colorante anteriore ha raggiunto il fondo del gel.
   3. Trasferire proteine ​​dai gel di fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C.
   4. Block membrana incubando nel latte scremato 5% in Tris-Buffered Saline (TBS), dondolo, per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
   5. Decantare soluzione bloccante.
   6. Incubare membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (o epitopo della stessa) in 1% di latte scremato in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) per 1 ora a camera temperature, dondolo.
   7. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
   8. Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
      NOTA: Perché fluorofori sono sensibili alla luce, diluizioni di anticorpi fluoroforo coniugati devono essere preparati al buio. Inoltre, l'incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati fluoroforo deve avvenire in contenitori lightproof. Questo può essere realizzato avvolgendo vassoi di incubazione in un foglio di alluminio.
   9. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
   10. Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.
   11. Dopo l'imaging membrana, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per un caricoing proteina di controllo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
   12. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
   13. Incubare a membrana con appropriate anticorpo secondario coniugato fluoroforo in 1% di latte scremato in TBS / T per 1 ora a temperatura ambiente, a dondolo.
   14. Decantare soluzione di anticorpo, e lavare la membrana 3 x 5 minuti con TBS / T a temperatura ambiente, a dondolo.
   15. Acquisire immagine di membrana utilizzando Li-Cor Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), secondo le indicazioni del produttore.

Risultati

Per illustrare questa metodologia, l'enzima HIS3 è stato fuso al carbossi-terminale del modello reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) per creare Deg1 -Sec62-HIS3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 rappresenta uno dei membri fondatori di una nuova classe di substrati ERAD che sono indirizzate a seguito persistente, associazione aberranti con il translocon, il canale principale responsabile per lo spostamento...

Discussione

La metodologia qui presentata consente la rapida determinazione e la conferma biochimica dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule di lievito. Questi esperimenti sottolineano l'utilità e la potenza di lievito come organismo modello eucariote (diverse ottime recensioni di lievito biologia e compilazioni di protocolli per la gestione, la conservazione e la manipolazione cellule di lievito (ad esempio ^41-44) sono disponibili per gli investigatori nuovi per l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components			Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole	Fisher Scientific	AC264571000	Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)	Roche	11088726001	May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped	Sarstedt	82.1581.001	Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl	Gilson	F14401	Available from a variety of manufacturers
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl	Gilson	F14403	Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System)	Bio-Rad	170-8195	A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater	Fisher Scientific	1172011AQ	Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application