Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

Riepilogo

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Abstract

Müller cellule sono le principali cellule gliali della retina. I loro finali piedi formano i limiti della retina alle membrane limitanti esterna ed interna (ILM), e in collegamento con astrociti, periciti e cellule endoteliali stabiliscono la barriera emato-retinica (BRB). BRB limita trasporto di materiale tra il flusso sanguigno e la retina mentre la ILM agisce come una membrana basale che definisce istologicamente il confine tra la retina e la cavità vitreo. Etichettatura cellule Müller è particolarmente rilevante per studiare lo stato fisico delle barriere della retina, in quanto queste cellule sono parte integrante della BRB e ILM. Sia BRB e ILM sono spesso alterati nelle malattie della retina e sono responsabili per i sintomi della malattia.

Esistono diversi metodi ben stabiliti per studiare l'integrità del BRB, quali il test blu Evans o fluorangiografia. Tuttavia questi metodi non forniscono informazioni sul grado di permeabilità BRB to molecole più grandi, in nanometri. Inoltre, essi non forniscono informazioni sullo stato di altri ostacoli retina, come la ILM. Per studiare BRB permeabilità al fianco della retina ILM, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità della BRB di molecole più grandi, pur indicando lo stato dei ILM e della matrice extracellulare proteine ​​in stati di malattia. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. AAV5 ha un tropismo naturale fotorecettori, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo quando l'ILM è intatto (cioè, in wild-type retine). ShH10 ha un forte tropismo verso le cellule gliali e selettivamente etichettare glia Müller sia retine sani e malati. ShH10 fornisce consegna del gene più efficiente in retine dove ILM è compromessa. Questi strumenti virali accoppiato con immunoistochimica e sangue-DNA analisi hanno fatto luce sulla condizione delle barriere retina nella malattia.

Introduzione

Müller cellule sono il principale componente gliale della retina. Morfologicamente, che abbracciano la retina radiale e la loro endfeet, in contatto con il vitreo, affrontano la ILM e componenti segreti di quest'ultima. La ILM è una membrana basale composta da una decina di diverse proteine ​​della matrice extracellulare (laminina, agrin, perlecan, nidogen, collagene e proteoglicani diversi solfato eparina). Durante lo sviluppo, la sua presenza è indispensabile per istogenesi retinica, la navigazione di assoni ottica, e la sopravvivenza delle cellule gangliari ^1-3. Tuttavia, ILM è inessenziale in retina adulta e può essere rimosso chirurgicamente in alcune patologie, senza causare danni alla retina ^4. Nella terapia genica, questa membrana diventa una barriera fisica per la trasduzione efficiente della retina mediante AAV per iniezione intravitreale ^5.

Attraverso l'ampia arborizzazione dei loro processi, le cellule Müller forniscono Suppo nutrizionale e regolamentarert per entrambi i neuroni della retina e cellule vascolari. Cellule Müller sono anche coinvolti nella regolazione dell'omeostasi retinica, nella formazione e mantenimento del BRB ^6. Giunzioni strette tra le cellule endoteliali dei capillari della retina, Müller cellule, astrociti e periciti formano la BRB. BRB previene alcuni sostanze di entrare i retina.In molte malattie come la retinopatia diabetica, occlusione venosa retinica e malattie respiratorie, ipossia della retina provoca perdita attraverso la BRB ^7-9. Questa rottura è associato ad un aumento della permeabilità vascolare che porta a edema vasogenico, distacco della retina e danni alla retina.

Cellule Müller sono strettamente associati con i vasi sanguigni e la membrana basale, svolgendo un ruolo importante sia l'integrità BRB e ILM. Di conseguenza, l'etichettatura cellule gliali Müller è particolarmente rilevante per lo studio dello stato fisico di queste barriere retiniche.

Classicoalleato, BRB permeabilità viene misurata usando il saggio blu Evans costituito da iniezione sistemica di Evans colorante blu, che lega non covalente all'albumina plasmatica. Questo test misura la perdita di albumina (proteine ​​di dimensioni intermedie, ~ 66 kDa) dai vasi sanguigni nella retina (vedi Protocolli sezione 5) ^10. In alternativa, la perdita vascolare può essere visualizzato con la fluorescenza angiografia retinica attestante l'assenza di perdite di fluoresceina (piccola molecola, ~ 359 Da, vedere Protocolli sezione 6) ^11. Tuttavia, entrambi i metodi consentono la valutazione della permeabilità BRB di piccole molecole e proteine, ma non forniscono informazioni circa l'integrità ILM.

Quindi, a studiare BRB permeabilità, abbiamo usato un metodo basato AAV che fornisce informazioni sulla permeabilità BRB di molecole più grandi (ad esempio, le particelle di AAV, 25 di diametro nm). In effetti, il nostro metodo in grado di rilevare la presenza di AAV transgene nel sangue, il che suggerisce che le particelle ~ 25 nm di diametro farebberoessere in grado di infiltrarsi nel flusso sanguigno. Questo metodo fornisce anche informazioni sulla struttura del ILM e proteine ​​della matrice extracellulare in condizioni patologiche. Due varianti di AAV sono utili per tale studio: AAV5 e ShH10. Subretinally iniettato, AAV5 ha un tropismo naturale per fotorecettori della retina e dell'epitelio pigmentato ^12, ma non si può ottenere attraverso la retina esterna quando somministrato nel vitreo in wild-type retine con ILM intatto ^5,13. ShH10 è una variante AAV che è stato progettato per indirizzare specificamente cellule gliali oltre neuroni ^14,15. ShH10 etichette selettivamente le cellule Müller sia retine sani e malati con maggiore efficienza in retine con barriere compromesse ^16. Questi strumenti virali accoppiato con immuhistochemistry e analisi del sangue-DNA forniscono informazioni sullo stato degli ostacoli retiniche e il loro coinvolgimento nella malattia (Figura 1).

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati curati e trattati secondo la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research.

1. Produzione di ricombinante AAV (rAAV) per Transient trasfezione di cellule HEK-293 ^17,18

NOTA: Vedere McClure C, JoVE (2011) ^19.

1. Purificare larga scala Miniprep (almeno 1 mg / ml) dei plasmidi vettore AAV. Utilizzare 3 plasmidi. Il plasmide AAV helper trasportano i geni del capside replica e senza terminale invertita AAV ripete ITR, la cassetta di espressione del transgene trasporta la AAV ITR denominato plasmide di trasferimento, e il plasmide fornendo i geni adenovirus helper E2, E4, e VA geni RNA contemplato come pHELPER.
2. Trasfezione 293 cellule con questi 3 plasmidi usano polietilenimina (o altro reagente trasfezione). Sopra 80% di efficienza di trasfezione è necessario per una buona vii rendimenti RAL.
3. Purificare AAV ricombinante da 293 lisati cellulari su una pendenza iodixanolo. 15%, 25%, 40% e 60% iodixanolo viene utilizzato per ottenere il gradiente. Colleziona 40% frazione iodixanolo contenente particelle AAV, concentrare la frazione dopo ultracentrifugazione a 500.000 xg per 1 ora e buffer di scambio contro PBS (tampone fosfato salino) con il 0,001% Pluronic.
4. Per determinare virale titolo genomico ^20, eseguire un DNAse ProteinaseK digest seguito da QPCR. I primer avanti e invertire amplificano la regione 62 bp situata nel AAV2 ITR. Per lo standard plasmide, la sonda è marcato con FAM e ha un buco nero quencher (BHQ).
5. Eseguire qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa) in un volume finale di 25 ml con 340 Nm invertire ITR fondo, 100 nM ITR avanti fondo, 100 nM sonda AAV2 ITR, 0.4 dNTPs mm, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq e mascherina 5 microlitri (standard, campione e nessun controllo modello).
6. Perlo standard, utilizzare il plasmide per la trasfezione in 7 x 10 diluizioni seriali (5 ml ciascuno di 2 x 10 ⁹ 2 x 10 ³ genomi / ml risultanti in una concentrazione finale ^{10 ottobre-4 ottobre} genomi / ml).
7. Iniziare il programma da una fase di denaturazione iniziale a 95 ° C per 15 min seguita da 40 cicli di denaturazione a a 95 ° C per 1 min e ricottura / estensione a 60 ° C per 1 min. Conservare a 4 ° C per una conservazione a breve termine oa -20 ° C per lunghi periodi di stoccaggio.

2. iniezione intravitreale di AAV

1. Anestetizzare topi C57BL6J con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita del riflesso di raddrizzamento, il ritiro e la coda reflex pinch risposta che indica il corretto anestesia. Dilatare gli alunni per l'applicazione della cornea del neosynephrine 5% e il 0,5% mydriaticum collirio. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
2. Passare un ultrafine 30 G disposable ago attraverso l'equatore e vicino al limbus, in camera vitreale (vedi Chiu K, JoVE (2007) ^21). Iniettare 1 ml magazzino contenente da 1 a 4 x 10 ¹¹ vp di ShH10-GFP o AAV5-GFP con l'osservazione diretta dell'ago al centro della cavità vitreale (Figura 1). Utilizzare un occhio come controllo per esperimenti ILM. Iniettare entrambi gli occhi per esperimenti BRB. Applicare un trattamento topico antinfiammatoria e antibatterica sugli occhi iniettati.
3. Dilatare alunni neosynephrine e mydriaticum collirio per l'imaging. Eseguire l'esame del fondo con una fotocamera fundus dell'occhio di seguire GFP (Green Fluorescent Protein) espressione 1 settimana, 2 settimane, 1 mese e 2 mesi dopo l'iniezione intravitreale (Figura 1). Sacrificio topi da CO ₂ inalazione 1 a 2 mesi dopo l'iniezione.

3. Immunoistochimica

1. Per criosezioni retina (Figura 1), sezionare occhi enucleati per rimuovere lens e della cornea, e l'immersione correzione in 4% paraformaldeide per 1 ora.
   1. Cryoprotect gli occhi fissi precedentemente a 10% di saccarosio per 1 ora a temperatura ambiente, 20% di saccarosio per un'altra ora a temperatura ambiente. Cryoprotect in soluzione di saccarosio al 30%, overnight a 4 ° C. Congelare e paraocchi incorporare in embedding resina, come Cryo-matrix. Fare 10 micron criosezioni e montare su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato e che migliorano l'aderenza del tessuto durante la colorazione.
   2. Permeabilize sezioni con 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 per 5 min. Lavare 2x in PBS e blocco per 1 ora a temperatura ambiente in PBS con 1% BSA, 0,1% Tween 20.
2. Per flatmounts retina (Figura 1), fissare gli occhi enucleati in 4% paraformaldeide per 15 min per facilitare la dissezione.
   1. In 15-30 min, sezionare gli occhi per rimuovere la cornea e la lente. Separare la retina da dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sclera tagliando intorno alla serrata eil nervo ottico. Immergere in 4% paraformaldeide per altri 30 minuti per fissare la retina e la proteina fluorescente in cellule retiniche trasdotte (fissaggio non deve superare 24 ore). Lavare 5 min in PBS sterile, pH 7.4.
   2. Cambiare il PBS al tampone di bloccaggio (PBS con 1% BSA, 2% di capra normale o siero asino, 0,5% Triton X-100), e incubare in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente oa 4 ° C durante la notte.
3. Incubare tessuti con anticorpi primari in tampone di bloccaggio sia per 4 ore a temperatura ambiente o in una notte a 4 ° C. Lavare 3x con PBS.
   NOTA: Gli anticorpi utilizzati sono i seguenti: anti-laminina (1 / 1.000) etichettatura della ILM, clone anti-rodopsina 4D2 (1/500) aste di etichettatura, anti-glutammina sintetasi clone GS-6 (1 / 1.500) di etichettatura cellule Müller , PNA Lectin (1/40) coni di etichettatura.
4. Incubare tessuti con diluizione 1: 500 di anticorpi secondari coniugati fluoro Alexa in tampone di bloccaggio per 1 ora (criosezioni) o 2 ore (flatmounts) presso la sala tempetura e al riparo dalla luce. Lavare 3x con PBS.
5. Effettuare tagli alleviare alla retina e flatmount è su un vetrino o con il fotoricettore o cellule gangliari della retina (RGC) lato rivolto verso l'alto. Aggiungi mountingmedium acquosa, applicare il coprioggetto e conservare a 4 ° C.
6. Eseguire microscopia confocale a scansione laser confocale. Acquisire le immagini in sequenza, riga per riga, per ridurre l'eccitazione e crosstalk emissione. Definire passo secondo il teorema del campionamento di Nyquist-Shannon. Utilizzare le impostazioni di esposizione che riducono al minimo i pixel troppo saturi nelle immagini finali. Elaborare immagini a 12 bit con le Figi, progetto Z-sezioni su un unico piano con la massima intensità in funzione Z-progetto ed infine convertire in modalità colore RGB a 8 bit.

4. PCR analisi di campioni di sangue del mouse

1. Iniettare 100 microlitri magazzino contenente da 1 a 4 x 10 ¹¹ particelle di un AAV-GFP nella vena del pene di topi anestetizzati C57BL6J (5% di isofluranoper l'induzione in una camera stretta e 2,5% di isoflurano attraverso un cono naso durante l'intervento chirurgico) utilizzando una siringa da insulina con un ultra-fine ago 6 millimetri. Questo animale servirà come controllo positivo di far circolare le particelle AAV.
2. Campione di sangue dalla coda di topo prima dell'iniezione e 3 ore, 24 ore, 2 giorni e 3 giorni dopo l'iniezione intravitreale ShH10 o dopo l'iniezione intrapenile (Figura 1). Circa il 10-20 microlitri è raccolto in tubi eparina. Sacrificio topi da CO ₂ inalazione dopo il completamento della procedura.
3. Estratto DNA genomico da campioni di sangue con il kit di estrazione di vostra scelta.
4. Eseguire PCR amplificazione del DNA genomico. Per questo protocollo utilizzare la seguente coppia di primer: GFP, senso 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisenso 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Il seguente programma PCR è stata effettuata: 95 ° C 2 min (1 ciclo); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cicli); 72 ° C 5 min (1 ciclo);4 ° C in attesa.

5. Opzionale Evans Metodo Blu

NOTA: quantificare permeabilità vascolare misurando fuoriuscita di albumina dai vasi sanguigni nella retina con il metodo blu Evans ^10.

1. Preparare Evans blu colorante per dissoluzione in una soluzione salina normale (6 mg / ml), sonicazione per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni, e filtrazione attraverso un filtro 5 micron.
2. Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1), controllare la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di ritiro e la risposta coda pizzico indica una corretta anestesia, e iniettare Evans blu (45 mg / kg), attraverso la vena del pene (Figura 1). Verificare che le zampe, il muso e le orecchie di topi diventano chiaramente blu dopo l'iniezione blu Evans, confermando l'assorbimento e la distribuzione del colorante.
3. Anestetizzare topi C57BL6J 3 ore dopo l'iniezione del colorante con ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verifica la perdita di righting reflex indicando una corretta anestesia. Esempio intracardiaca circa 500 ml di sangue in tubi eparina e nei profumi topi per 2 min attraverso il ventricolo sinistro con un tampone citrato (0,05 M, pH 3,5 e sciogliere 7,8 g di acido citrico e 3,8 g di citrato di sodio in 1 L di acqua distillata) preriscaldata a 37 ° C per evitare vasocostrizione. I topi sono sacrificati tramite perfusione.
4. Dopo la perfusione, enucleate e con attenzione sezionare entrambi gli occhi sotto un microscopio operatorio per raccogliere le retine (vedi Sezione 3.2). Retine secco in un evaporatore centrifuga durante la notte, pesano, ed estrarre il colorante blu Evans incubando retine con 100 ml di formammide per 18 ore a 65 ° C con agitazione (100 xg). Campioni Centrifuga retina a 30K tubi filtranti omega a 20,798.5 xg per 2 ore a 4 ° C e campioni di sangue centrifugare a 20,798.5 xg per 15 min a 4 ° C.
5. Usare entrambe surnatanti per misurare l'assorbanza. Determinare l'assorbanza di ciascun campione sottraendo il massimo assorbanza for Evans blu a 620 nm al minimo assorbanza a 740 nm. Calcola Evans concentrazione blu nel plasma e della retina di una curva standard di Evans blu in formammide. Esprimere BRB permeabilità in microlitro di Evans blu per grammo di retina secca per ora (ml di plasma / g retinica peso secco / hr).

6. Facoltativo Fluoresceina angiografia

NOTA: Perdita dai vasi sanguigni della retina nei topi può essere visualizzato mediante iniezione intraperitoneale di fluoresceina sodica.

1. Anestetizzare topi C57BL6J (isoflurano inalazione, vedere il punto 4.1) e dilatare gli alunni con collirio (neosynephrine e mydriaticum). Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
2. Iniettare intraperitoneale 0,01-0,02 ml 10% fluoresceina sodica in 0,1 ml di soluzione fisiologica sterile per fluorangiografia.
3. Raccogliere le immagini di entrambi gli occhi dopo l'iniezione utilizzando una telecamera fundus dell'occhio. Sacrificio topi da CO ₂ inalazione dopo la proprocedura.
   NOTA: 20 sec sono necessari per i vasi retinici a diventare visibile su angiografia. Le immagini devono essere catturato tra 3-10 min massimo dopo l'iniezione di fluorescina. I punti di fuga (se presenti) sono osservabili dopo 2.5 min. Al più tardi momenti la qualità dell'immagine è perso a causa di fluoresceina sodica diffusione nel vitreo, quindi solo immagini poco ottenuti dopo sono utilizzati per l'analisi.

Risultati

Probabilmente incrementata trasduzione retinica Müller cellule gliali utilizzando ShH10 se il modello animale mostra perturbazioni nella struttura del ILM (Figura 2A - B). Ad esempio, abbiamo dimostrato che, in assenza di DP71, obiettivi ShH10 particolare, ma in modo più efficiente Müller cellule gliali di iniezione intravitreale, indicando un aumento della permeabilità della ILM in questa linea di topi rispetto ai topi wild-type ¹⁶ (Figura 2C - F...

Discussione

La BRB regola lo scambio di molecole tra sangue e retina. La sua composizione è associata a diverse malattie come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo recentemente dimostrato che in un topo distrofina knock-out, che visualizza permeabile BRB, la retina diventa più permissiva di consegna del gene mediato da vettori virali adeno-associati (AAV). Tuttavia, nonostante BRB particelle permeabilità AAV iniettato intraoculare rimanere confinata al compartimento oculare in qu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6J mice strain	JANVIER LABS		mice
Ketamine 500	Virbac France		anesthetic
Xylazine Rompun 2%	Bayer Healthcare		anesthetic
Neosynephrine 5% Faure	Europhta		dilatant
Mydriaticum 0.5%	Thea		dilatant
Sterdex	Novartis		anti-inflammatory
Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	10143352	slides
anti-laminin	Sigma	L9393	antibody
anti-rhodopsin clone 4D2	Millipore	MABN15	antibody
anti-glutamine synthetase clone GS-6	Millipore	MAB302	antibody
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein	Dako	334	antibody
PNA Lectin	Invitrogen	L32459	probe
Alexa fluor conjugated secondary antibodies	Invitrogen		antibody
Fluorsave reagent	Calbiochem	345789	mounting medium
QIAmp DNA Micro Kit	QIAGEN	56304
GoTaq DNA polymerase	Promega	M3001
Evans Blue dye	Sigma	E2129	dye
5 µm filter	Millipore
Sodium citrate	Sigma	S1804
Citric acid	Sigma	C1909-2.5KG
Formamide spectrophotometric	Sigma	295876-2L
Fluorescein	Sigma	F2456	dye
Micron III	Phoenix Research Labs		Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Insulin Syringes	Terumo	SS30M3109
Syringe 10 µl Hamilton	Dutscher	74487	Seringue 1701
Needle RN G33, 25 mm, PST 2	Fisher Scientific	11530332	Intravitreal Injection
UltraMicroPump UMP3	World Precision Instruments	UMP3	Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller	UMP3-1	Digital controller
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection
Spring scissors straight - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Retinas dissection
curved Vanna scissor	15004-08
Pince Dumont 5	11254-20
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Life technologies	4375786	Thermocycler
Ultrasonic cleaner	Laboratory Supplies	G1125P1T
Nanosep 30k omega tubes	VWR
Speedvac	Fisher Scientific	SC 110 A
Spectrofluorometer	TECAN	infinite M1000