Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Felix Heymann; Patricia M. Niemietz; Julia Peusquens; Can Ergen; Marlene Kohlhepp; Jana C. Mossanen; Carlo Schneider; Michael Vogt; Rene H. Tolba; Christian Trautwein; Christian Martin; Frank Tacke

doi:10.3791/52607

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In questo articolo

Riepilogo
Abstract
Introduzione
Protocollo
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Riconoscimenti
Materiali
Riferimenti
Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

Fegato infiammazione come risposta al danno è un processo altamente dinamico che coinvolge l'infiltrazione di distinti sottotipi di leucociti tra cui monociti, neutrofili, sottogruppi di cellule T, cellule B, natural killer (NK) e le cellule NKT. Microscopia intravitale del fegato per monitorare la migrazione delle cellule immunitarie è particolarmente difficile a causa degli elevati requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione e la fissazione, risoluzione ottica e animale sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, la dinamica dei processi infiammatori così come studi di interazione cellulare potrebbe fornire informazioni fondamentali per comprendere meglio l'iniziazione, la progressione e la regressione della malattia epatica infiammatoria. Pertanto, un metodo altamente sensibile ed affidabile è stato istituito per studiare migrazione e cellula-cellula-interazioni di diverse cellule immunitarie in fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM) in combinazione con terapia intensiva monitoraggio. ent "> Il metodo fornito comprende una preparazione dolce e fissazione stabile del fegato con il minimo turbamento dell'organo; di imaging intravitale lungo termine utilizzando la microscopia multicolor multiphoton praticamente senza photobleaching o effetti fototossici per un periodo di tempo massimo di 6 ore, consentendo il monitoraggio di specifici sottoinsiemi di leucociti, e le condizioni di imaging stabile a causa monitoraggio estensivo di topo parametri vitali e la stabilizzazione della circolazione, la temperatura e lo scambio di gas.

Per studiare la migrazione dei linfociti su infiammazione del fegato CXCR6.gfp knock-in topi sono stati sottoposti a esami del fegato intravitale in condizioni basali e dopo danno epatico acuto e cronico indotto da un'iniezione intraperitoneale (s) di tetracloruro di carbonio (CCL _4).

CXCR6 è un recettore per chemochine espressi sui linfociti, soprattutto su Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - e sottoinsiemi di linfociti T come le cellule T CD4 ma anche Associ mucoseATED invariante cellule (MAIT) T ^1. Seguendo il modello migratorio e il posizionamento di CXCR6.gfp ⁺ cellule immunitarie permesso una visione dettagliata del loro comportamento alterato sul danno epatico e quindi il loro potenziale coinvolgimento nella progressione della malattia.

Introduzione

La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo ^2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l'imaging intravitale del fegato ^3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico.

A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale ^5, il problema più comune per l'imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla re....