Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

Riepilogo

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un'ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduzione

Nanofibre sono un'utilità popolare per ingegneria tissutale a causa della loro capacità di mimare la matrice extracellulare nella sua struttura e dimensione relativa ^1. Tuttavia, alcune interfacce tessuto nativo, come il sito tendine-osso, contengono fibre collagene, che presentano una struttura organizzativa variabile che aumenta in allineamento verso il tendine e diminuisce al sito osseo ^2-5. Così, per la rigenerazione tissutale efficace è necessario per fabbricare un ponteggio che potrebbe efficacemente imitare questo gradiente strutturale.

In precedenza, vi è stata una ricerca condotta sui cambiamenti graduali nella composizione delle fibre, in particolare, il contenuto di minerali ^6. Tuttavia, ricreando la componente strutturale dei tessuti connettivi rimane in gran parte inesplorato. Uno studio precedente esaminato gradienti morfologiche studiando l'effetto della silice superficie densità di particelle sulla proliferazione degli osteoblasti ratto cranica e trovato un inverrapporto tra la densità se particella di silice e la proliferazione cellulare ^7. Ma i cambiamenti morfologici che mediate proliferazione cellulare in lavori precedenti erano per lo più relativi alla rugosità superficiale manca la capacità di mimare fibra cambiamenti organizzativi ^7,8. Uno studio recente ha tentato di realizzare un ponteggio che imitava gli orientamenti fibre collagene unici utilizzando un nuovo collettore per electrospinning ^9. Anche se questo studio è riuscito a produrre un ponteggio con fibre sia allineate e casuale, non è riuscito a imitare i graduali cambiamenti esposti nei tessuti nativi. Inoltre, nella produzione di componenti separati, con un cambiamento immediato dal allineato all'orientamento casuale, le proprietà biomeccaniche di questa impalcatura è diminuito in modo significativo. Nessun lavoro precedente è stato in grado di produrre applicabili ponteggi nanofibre con continui gradazioni orientamenti fibra di allineato e casuali. Il nostro recente studio ha dimostrato con successo la ricreazione di ponteggi nanofibrecon gradazioni nell'organizzazione fibra che può potenzialmente mimare l'organizzazione collagene nativo all'inserimento ^{di 10} tendine-osso. Questo lavoro si propone di presentare i protocolli utilizzati per la produzione di scaffold nanofibre con una struttura molto simile a quella di organizzazione fibre nell'interfaccia nativa tendine-osso tessuti.

Strutture nanofibre gradiente sono potenzialmente di vasta portata applicazioni attraverso una varietà di campi. Ci siamo concentrati sulle applicazioni per l'ingegneria tissutale del sito di tendine-osso combinando le nostre impalcature con le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) che sono già utilizzate per la rigenerazione dei tessuti su vari substrati ^11-14. Inoltre, ADSCs sono molto simili in natura per le cellule staminali del midollo osseo in termini di multipotenza e la loro risorsa è abbondante che può essere raccolto mediante una semplice procedura di liposuzione ^15,16. Semina queste cellule per ponteggi nanofibre sfumati aumenta ulteriormente la loro tiscitare applicazioni ingegneristiche consentendo la distribuzione controllata delle cellule che possono potenzialmente differenziarsi in vari tessuti. Oltre a seminare le cellule staminali, nanofibre possono essere incapsulati con molecole di segnalazione per la regolazione della risposta cellulare. Accoppiamento nanoencapsulation con il gradiente organizzativa di tali ponteggi consente lo studio del comportamento cellulare o possibili disegni implantari e rivestimenti. Incapsulamento di molecole funzionali come proteina morfogenetica 2 (BMP2), che ha dimostrato di indurre la differenziazione degli osteoblasti ^15,16, potrebbe migliorare ulteriormente le applicazioni di ingegneria tissutale di questi ponteggi ^10.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare una soluzione di poli (ε-caprolattone) (PCL) (M _w = 80,000 g / mol) ad una concentrazione approssimativa di 100 mg / ml. Sciogliere PCL in una miscela di diclorometano (DCM) e N, N-dimethlyformamide (DMF) con un rapporto di 4: 1 (v / v) con una concentrazione del 10% (w / v).
2. Porre la soluzione in un tubo di vetro da 20 ml per la miscelazione. Mettere tubo di vetro in ultrasuoni per 30 minuti, o fino a quando la soluzione è trasparente.

2. Apparecchiatura Preparazione

1. Aggiungere la soluzione PCL preparata in una siringa da 5 ml con un ago senza punta 21 gauge collegato.
2. Inserire pompa a siringa in posizione electrospinning verticale di figura 1.
3. Utilizzare un collettore in acciaio inox-gap con uno spazio aperto di 2 cm x 5 cm per il substrato di fibre allineate. Posizionare il collettore 12 centimetri dalla punta dell'ago.
4. Collegare la corrente continua (DC) ad alta tensione di alimentazione alago e terra il collettore. Assicurarsi che il collettore è individualmente a terra senza contatto per le altre apparecchiature di laboratorio.

3. Electrospinning

1. Set pompa a siringa a 1.50 ml / h, fino a quando le goccioline che formano sulla punta dell'ago vengono immediatamente sostituiti quando viene rimosso. Quindi, impostare la portata di 0,50 ml / h.
2. Girare l'operatore tensione di 12 kV.
3. Electrospin fino a quando le fibre uniaxially allineate coprire completamente il gap sul collettore.
4. Applicare la colla ai bordi di una piccola lastra di vetro e trasferire le fibre dal collettore gap alla lastra di vetro. Posizionare la lastra di vetro nella parte superiore di un pezzo di foglio di alluminio che ha la stessa dimensione della lastra di vetro ed è messo a terra.
5. Posizionare il secondo collettore siringa secondo la figura 3.
6. Fissare la maschera di plastica per la seconda pompa siringa e posizione it 2 mm sopra il collettore.
7. Aggiungi cumarina 6 a 1% (w / w) per il PCL soluzione se nanoencapsulation è desired- e mescolare fino a quando la soluzione è trasparente.
8. Caricare il PCL o PCL / cumarina 6 soluzione in un ago 5 ml con un ottuso ago 21 gauge. Impostare pompa verticale a 0,50 ml / hr e orizzontale per tirare 9 ml / hr o ad una velocità di circa 1 mm / min.
9. Electrospin finché la maschera è spostato quasi completamente fuori dal collettore, ma con la zona di bordo ancora sotto la maschera.

4. Fiber Caratterizzazione

1. I campioni con nastro adesivo conduttivo biadesivo al perno metallico e il cappotto con platino per 40 sec con una verniciatura polverizzazione a 40 mA.
   1. Esaminare fibre attraverso microscopio elettronico a scansione (SEM) secondo i nostri studi precedenti ^17,18.
   2. Raccogliere immagini ad una tensione di accelerazione di 15 kV.
2. Eseguire l'analisi rapida di Fourier (FFT) su un campione di fibra separato per misurare l'allineamento fibra. Le informazioni dettagliate su allineamento delle fibre di misura da FFT può riferirsi to studi precedenti ^19,20.

5. Cellule staminali Seeding.

1. Sterilizzare i campioni di fibre immergendola in una soluzione di etanolo al 70% per 2 ore. Quindi lavare le fibre con acqua distillata per rimuovere eventuali contaminanti.
2. Ottenere ADSCs umane e cellule di coltura in una beuta da 25 cm ² a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO _2. Modificare il terreno di coltura cellulare a giorni ^10.
3. Trypsinize cellule e contare il numero di cellule. Specificamente, rimuovere tutto terreno di coltura dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) due volte. Poi aggiungere 1 m ^l di una soluzione 0,25% tripsina-EDTA (pre-caldo in bagno d'acqua a 37 ° C) per coprire il monostrato cellulare e incubare la beuta nell'incubatrice coltura cellulare per 2-3 minuti. Aggiungere 4 ml terreno di coltura e lavare tutte le cellule dalla superficie pipettando il mezzo su tutta la superficie. Centrifugare la sospensione cellulare e ri-disperse esimoe pellet di cellule nel mezzo di coltura. Contare le celle tramite emocitometro. Seed circa 1 × 10 ⁴ celle al patibolo nanofibre collocato in un piatto -Cultura 35 millimetri e incubare per 3 e 7 giorni.
4. Cellule macchia con fluoresceina diacetato (5 mg / ml in acetone) (FDA) allora l'immagine dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. In particolare, aggiungere 100 ml di soluzione FDA al piatto cultura e incubare per 30 min. Lavare le cellule con PBS per tre volte prima di imaging fluorescente. Analizzare l'orientamento delle cellule da un programma personalizzato mat-lab in base alle nostre precedenti studi ^10.

Risultati

Usando questo protocollo, si è formata una stuoia in fibra con pendenza organizzativa. La figura 3 mostra le immagini SEM scattate in varie posizioni sul patibolo nanofibre. Qualitativamente, si può determinare che esiste una progressione da fibre uniaxially allineate a 0 mm (Figura 3A) ad una fibra assortimento casuale a 6 mm (Figura 3D). La FFT dà un valore quantitativo per l'allineamento delle fibre, specifiche sui processi quantitativi sono dettagliate qui

Discussione

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2