Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Riepilogo

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Abstract

Analizzando le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) quando stimolato con specifici ligandi è fondamentale per comprendere la base dei comportamenti olfattive-driven e la loro modulazione. Queste proprietà di codifica dipendono fortemente dalla interazione iniziale tra molecole di odore e il recettore olfattivo (OR) espresse nei OSNs. L'identità, specificità e ligando spettro della espressa o sono critici. La probabilità di trovare il ligando della OR esprime in OSN scelto casualmente all'interno dell'epitelio è molto bassa. Per affrontare questa sfida, questo protocollo utilizza geneticamente i topi con tag che esprimono la proteina fluorescente GFP sotto il controllo del promotore di RUP definiti. OSNs sono situati in un epitelio stretto e organizzato che riveste la cavità nasale, con le cellule vicine che influenzano la loro maturazione e funzione. Qui si descrive un metodo per isolare un epitelio olfattivo intatto e registrare tramite patch-clamp le proprietà di OSNs expressing recettori olfattivi definiti. Il protocollo consente di caratterizzare le proprietà della membrana OSN mantenendo l'influenza del tessuto adiacente. Analisi dei risultati di patch-clamp produce una precisa quantificazione del ligando / o interazioni, vie di trasduzione e farmacologia, codifica le proprietà OSN e la loro modulazione a livello della membrana.

Introduzione

Neuroni sensoriali olfattivi (OSN) rappresentano il primo passo della percezione olfattiva. Situato nell'epitelio olfattivo rivestimento della cavità nasale nei roditori, trasformano l'informazione chimica di odori in potenziali d'azione inviati attraverso il loro assone al cervello. Per meglio comprendere i meccanismi di codifica olfattive, è necessario caratterizzare le proprietà di trasduzione e membrana di OSNs. Fino a poco tempo fa, la maggior parte delle tecniche utilizzate per caratterizzare le proprietà di OSNs mammiferi sono stati effettuati su dissociato OSNs ^1-4. Il processo di dissociazione utilizza diversi (ad esempio, enzimi) processi meccanici e chimici per liberare i OSNs dal loro ambiente. Questi processi inducono un basso numero di cellule disponibili per le registrazioni. Questo numero basso può essere ancora più critico nel caso di cellule GFP etichettati. Dissociazione rimuove anche le interazioni locali cellula-cellula tra OSNs e altre cellule dell'epitelio olfattivo che possono aumentare survivabilityAl e modulazione delle proprietà OSN. Al fine di bypassare la procedura di dissociazione, una preparazione intatto è stato sviluppato ^5.

Ogni OSN esprime un recettore olfattivo (OR) selezionati da una famiglia numerosa multigene ^6. Ci sono ~ 1000 RUP espresse nella principale epitelio olfattivo nel topo. A causa del gran numero di OR in tipo animali selvatici, le possibilità di registrare OSNs esprimono la stessa OR sono molto basse. Per superare queste limitazioni, gene targeting topi sono disponibili in cui tutti OSNs esprimono un identificato o sono etichettati con una proteina fluorescente ^7-9. Questi OSNs etichettati sono stati usati per fare l'analisi funzionale in preparazioni dissociate ^7,10,11 con gli inconvenienti citati in precedenza. Un intatto preparazione epitelio ⁵ da topi geneticamente etichettati elude quindi questi problemi. Esso consente il monitoraggio dell'attività di OSNs esprimenti RUP precisamente definite in un ambiente il più vicino in vivo possibile. Inoltre, patch-clamp di OSNs consentono anche l'analisi precisa di proprietà di membrana, via di trasduzione del farmacologia, ligando / o interazioni. Tutti questi argomenti difficilmente possono essere analizzati utilizzando registrazioni extracellulari. Abbiamo usato questa tecnica per monitorare le risposte dei OSNs che esprimono i recettori olfattivi SR1 e MOR23 ^12,13. La fattibilità della tecnica è stata confermata da altri gruppi su MOR23 esprimenti OSNs ¹⁴ nonché su altri RUP esprimenti neuroni ^15,16. Il monitoraggio di una popolazione definita di OSNs può portare alla analisi delle loro proprietà in diversi contesti quali lo sviluppo ^14, invecchiamento ^17, odorizzante indotta plasticità ^18, e il ruolo delle variazioni di sequenza del recettore odorizzante in odore codifica ^15. Questo protocollo prevede quindi un potente strumento per monitorare le proprietà funzionali di OSNs definiti a livello della membrana.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della Université de Bourgogne ed è stato approvato dal comitato etico Université de Bourgogne.

1. Gli animali

1. Utilizzare tecniche di ingegneria genetica topi OR-IRES-tauGFP disponibili presso il laboratorio di Jackson. Questi topi sono stati sviluppati in laboratorio Dr. Peter Mombaerts 'al fine di analizzare il targeting degli assoni e lo sviluppo del sistema olfattivo ^19. Ad esempio, la linea di MOR23-IRES-tauGFP, fotografia numero 006.643, porta il nome della razza ufficiale B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; allo stesso modo, la linea SR1-IRES-tauGFP, fotografia numero 6717 porta il nome di B6 ufficiale; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. Per quanto riguarda l'età degli animali: per un migliore risultato del protocollo, utilizzare animali tra 2 e 4 settimane di età. In questa fascia di età, la dissezione è più facile (ossa più morbide, più solida epitelio olfattivo) e le manopole dendritiche sono bigger confrontare animali più vecchi.

2. Preparazione di elettrodi e soluzioni

1. Per le pipette stimolanti: acquisto prepulled stimolante pipette. In caso contrario, li prepara manualmente.
   1. Utilizzando una fiamma, piegare sei pipette di vetro di 1 mm circa 1 cm dalla punta. Inserire queste sei pipette più un diritto 7 ^° in 1,5 centimetri termoretraibile tubi rafforzare da un occhiello.
   2. Termoretraibile il tubo per mantenere i barili legati insieme. Collegare un guaina termoretraibile supplementare agli altri estremità delle canne. Tirare la pipetta stimolante con un estrattore multi-barile.
   3. Aggiungete un po 'di liquido colla bianca intorno l'occhiello di rafforzare le punte piegate. Lasciate asciugare O / N.
2. Preparare 1 o 2 L di soluzione extracellulare normale di Ringer (in mM: NaCl 124, KCl 3, _MgSO4 1,3, CaCl ₂ 2, _NaHCO3 26, NaH ₂ PO ₄ 1.25, glucosio 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Conservare a 4 ° Cfino al momento dell'uso.
3. Preparare soluzione madre intracellulare (in mm): KCl 70, KOH 53, acido metansolfonico 30, EGTA 5, HEPES 10, di saccarosio 70; pH 7.2 (KOH) e 310 mOsm. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Buon per diverse settimane.
4. Preparare la soluzione intracellulare di registrazione con nistatina estemporanea (all'ultimo minuto) prima dell'esperimento.
   1. Pesare 3 mg di nistatina, aggiungere 50 ml di DMSO; vortex 20 sec poi sonicare 2-3 minuti fino a quando tutto diluito.
   2. Aggiungere 20 ml di soluzione di DMSO-nystatin in 5 ml di soluzione madre intracellulare. Vortex 20 sec, poi sonicare 3 min. Conservare questa soluzione a 4 ° C e proteggere dalla luce diretta, nistatina è sensibile alla luce. Questa soluzione può essere utilizzata per alcune ore. Sostituire ogni giorno.
   3. Una volta che la preparazione epitelio olfattivo è sotto il microscopio, prendere alcuni di questa soluzione in una siringa da 1 ml con una punta gialla allungata fiamma per riempire gli elettrodi; proteggere dalla luce diretta. Una volta a RT, la soluzione nistatinanon è stabile; sostituire la soluzione nella siringa da 1 ml ogni ora o tenerlo in ghiaccio.
5. Tirare elettrodi di registrazione con un estrattore per ottenere il collo lungo e piccola mancia (~ 2 micron) con una resistenza di 15-20 MW con la soluzione nistatina interna.
6. Preparare la soluzione odorizzante a 0,5 M in DMSO sotto cappa; Un'aliquota e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Diluire odorizzante in soluzione di Ringer fino alla concentrazione desiderata. Riempire la pipetta stimolante.

3. Preparazione di epitelio olfattivo

Nota: i topi OR-IRES-tauGFP esprimono il tauGFP sotto il controllo del promotore OR. In questi topi, tutti i neuroni che esprimono l'OR di interesse sono etichettati con GFP. Questo protocollo è adattato per RUP espressi in tutte le zone. Tuttavia, dissezioni e registrazioni sono più facili per RUP espresse nella zona dorsale.

1. Anestetizzare l'animale iniettando una miscela di ketamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg bodPeso y, rispettivamente). Decapitazione può essere effettuata con forbici affilate per i topi giovani o con ghigliottina roditore corretta manutenzione per i topi più anziani.
   1. Utilizzando anelli forbici dissezione fare una incisione longitudinale mediale attraverso la pelle dorsale. Togliere la pelle tirandolo a parte. Utilizzando le forbici, tagliare le ganasce inferiori alla mandibola. Rimuovere i denti anteriori superiori da un taglio coronale parallelo ai denti.
   2. Fare un taglio coronale della testa dietro gli occhi e mantenere solo la parte anteriore della testa. Immergerlo in soluzione di Ringer ghiacciata per la dissezione nell'ambito di applicazione.
2. Sezionare nell'ambito di applicazione: nel lato ventrale, un taglio longitudinale lungo la mascella superiore / i denti. Tagliare le ossa dorsali longitudinalmente, seguendo il lato dorso-laterale della cavità nasale. Rimuovere la maggior parte delle ossa e del palato; trasferire il setto e l'epitelio collegato ad esso in ossigenato Ringer a RT.
3. Per la dissezione finale: Poco prima di iniziare la registrazionesessione, staccarsi l'epitelio dal setto sottostante con una pinza. Staccare l'epitelio con una pinza e con due tagli 4-5 mm forbice (uso microvannas forbici) alla parte anteriore del setto, dove l'adesione è più forte.
   1. Rimuovere con cautela l'organo vomeronasale, tagliando fuori lungo il suo collegamento dorsale all'epitelio settale. Trasferire l'epitelio ad una camera di registrazione con lo strato di muco rivolto verso l'alto; tenere piatta nella camera con l'arpa.
4. Installare camera sotto un microscopio verticale dotato di ottica di fluorescenza e una macchina fotografica sensibile. Visualizzare la preparazione sullo schermo del computer ad alto ingrandimento attraverso un obiettivo 40X acqua-immersion (apertura numerica 0,8) e un 2X o 4X supplementare ottenuto da una lente di ingrandimento. Profumato continuamente con ossigenato Ringer a RT (1-2 ml / min).

4. sessione di registrazione

1. Cerca cell fluorescente: eccitare la preparazione a 480nm per EGFP, che emette luce nel range 530-550 nm; indirizzare una manopola dendritiche, che è affidabile visibile in fluorescenza e in campo luminoso.
2. Riempire l'elettrodo con la soluzione intracellulare con nystatin; rimuovere le bolle picchiettando delicatamente sul dell'elettrodo.
3. Inserire elettrodo sul portaelettrodo, applicare una pressione positiva nella pipetta; La resistenza dovrebbe essere 15-20 MW.
4. Portare l'elettrodo vicino alla cella; una volta che la resistenza raggiunge ~ 40 MW, scaricare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per raggiungere un gigaseal.
5. Raggiunta sigillo, impostare il potenziale di membrana a circa -75 mV;
6. Una volta che la cellula si apre, procedere con protocolli di stimolazione, trattamenti farmacologici. Per misurare la risposta ad una singola stimolazione odorizzante, annotazione 200-500 msec di attività spontanea, stimolare per 500 msec e misurare la risposta della cella fino a 10 sec ^13. Per i trattamenti farmacologici, profumato gli agenti farmacologici inla concentrazione desiderata ^20.

Analisi 5. I dati

1. Analizzare correnti indotte da stimolazione odorizzante come seguito: l'ampiezza massima, il tempo di salita (tempo necessario per raggiungere il 90% della massima ampiezza, in msec), la corrente totale (area sotto la curva in PAS), il tempo al 50% (tempo tra l'inizio e l'offset della risposta al 50% della massima ampiezza, in msec).
   1. Utilizzando le correnti di picco di trasduzione (ampiezza massima raggiunta) a diverse concentrazioni, disegnare e montare una curva dose-risposta con la seguente equazione Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K _1/2 / C) ^n), dove I rappresenta la corrente di picco , Imax la massima risposta a concentrazioni saturazione, K1 / 2 la concentrazione alla quale è stato raggiunto metà della risposta massima, C la concentrazione di odorizzante ed n il coefficiente di Hill.
2. Analizzare registrazioni di potenziale di membrana a pinza per la massima depolarizzazione, la totapotenziale l suscitato (area sotto la curva in mVsec); registrazione spontanea attività spiking oltre 30 sec a 1 min registrazioni; record di eccitabilità attraverso picchi indotte da iniezione di correnti (5-10 Pa).

Risultati

Il risultato di questo protocollo dipende dalla qualità della dissezione. Questa procedura dissezione deve essere breve (meno di 10 a 15 minuti) e preciso (ad esempio, per evitare danni del epitelio). La figura 1 illustra come una preparazione ideale assomiglia a diversi livelli di ingrandimento. Ad un basso ingrandimento in campo luminoso i diversi tipi di cellule (ad esempio le manopole di OSNs, sostenendo le cellule) sono distinguibili (Figura 1A). Al livello più alto ingr...

Discussione

La capacità di questo protocollo per monitorare correttamente le proprietà di OSNs sani dipende fortemente dalla qualità della preparazione. Pertanto, la procedura di dissezione sono fondamentali. Innanzitutto è fondamentale prestare attenzione alla qualità (pH, osmolarità), l'ossigenazione e temperatura (ghiacciata ma non congelato) del mezzo dissezione. In secondo luogo, la manipolazione dell'epitelio con strumenti di dissezione deve essere limitata come possibile per evitare danni. Infine, è fondamenta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
vibration table with Faraday cage	TMC	63-500 SERIES	required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope	Olympus	BX51WI	upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives	Olympus	LUMPLFL40XW	at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera	Olympus	DP72	a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters	Olympus/Chroma		depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier	HEKA	EPC10 USB	monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software	HEKA	Patchmaster	controls the amplifier during the experiment
micromanipulator	Sutter	MP225	precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller	Sutter	P97	with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass	Sutter	BF120-69-10	in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber	Warner Instruments	RC-26G	a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass	WPI	TW100F-4	attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller	MDI	PMP-107-Z	by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector	Toohey Company	P/N T25-1-900 Single Channel	this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator	Narishige	YOU-1	a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings	N/A		tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump	gardner denver	300 series	a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system	N/A	N/A	gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin	Sigma-Aldrich	N3503	mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	extracellular solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	extracellular solution
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	E3889	internal solution
Potassium hydroxyde	Sigma-Aldrich	P1767	internal solution
Methyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	W387509	intracellular solution
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	intracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	intracellular solution