Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Riepilogo

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Abstract

Invasione di tessuti circostanti normali è generalmente considerata come una caratteristica fondamentale del maligno (al contrario di benigni) i tumori. Per alcuni tipi di cancro, in particolare (ad esempio, i tumori del cervello, il glioblastoma multiforme e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo -. SCCHN) si tratta di una causa di grave morbilità e può essere anche in assenza di metastasi a distanza in pericolo di vita. Inoltre, i tumori che hanno recidivato dopo il trattamento, purtroppo, spesso presente con un fenotipo più aggressivo. Pertanto, vi è la possibilità di indirizzare il processo di invasione di fornire nuove terapie che potrebbero essere complementare ad agenti anti-proliferativi standard. Fino ad ora, questa strategia è stata ostacolata dalla mancanza di robusti test riproducibili adatti per un'analisi dettagliata di invasione e per lo screening di stupefacenti. Qui forniamo un metodo di micro-plate semplice (sulla base di uniformi, auto-assemblaggio sferoidi tumorali 3D), che ha un grande potenziale per tale stumuore. Noi esemplificano la piattaforma test utilizzando una linea cellulare di glioblastoma umano e anche un modello SCCHN in cui lo sviluppo della resistenza contro mirata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è associato con una maggiore potenziale matrice invasivo. Forniamo anche due metodi alternativi di quantificazione semi-automatico: uno che utilizza un sistema di imaging citometro e al secondo, che richiede semplicemente la microscopia e immagine di acquisizione standard di analisi di immagine digitale.

Introduzione

Lo sviluppo di farmaci antitumorali classica è in gran parte concentrata sull'uso di vitro saggi cellulari in a schermo per gli agenti citotossici che inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali e / o promuovono la morte cellulare programmata (apoptosi). Più di recente, gli sforzi si sono spostati verso terapie mirate con lo sviluppo di inibitori delle cause molecolari alla base della proliferazione delle cellule maligne. Nonostante alcuni risultati spettacolari, tali agenti sono spesso associati con il rapido sviluppo di resistenza al farmaco. Dato che è il potenziale invasivo e metastatico delle cellule tumorali che è responsabile della maggior parte dei decessi per cancro, e che malattia recidivante presenta spesso un fenotipo più aggressivo, è logico anche considerare complementari in vitro modelli sperimentali ^1,2 per identificare nuovi agenti che inibiscono questi tasti aggiuntivi "caratteristiche" del cancro.

Durante la progressione maligna, le cellule tumorali acquisisconola capacità di invadere i tessuti circostanti e / o la diffusione in organi distanti (metastasi). Le cellule tumorali penetrano la membrana basale dalla formazione di invadopodi ^3,4. Queste strutture sono arricchiti con filamenti di actina, proteine ​​di adesione specifici e proteinasi e sono collettivamente responsabili per la motilità delle cellule tumorali e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) ^5. Invadopodi estendono nel ECM e si crede di essere importante per l'invasione delle cellule tumorali e di stravaso anche in canali vascolari, facilitando ematogena (o linfatica) diffusione e metastasi.

Metodi standard attuali per valutare l'invasione delle cellule tumorali in vitro sono i seguenti. Transwell o basato Boyden saggi camera ^2,6 dove sospensioni di cellule singole sono seminate in cima ad un filtro rivestito con uno spesso strato di proteine ​​ECM-derivato. Cellule poi invadono e muovono nella camera inferiore in risposta ad un chemio-attrattore. Comunemente usato ECMproteine ​​sono collagene di tipo I, o di una membrana simile matrice seminterrato (BMM, ad esempio, Matrigel, derivato dal tumore EHS ⁷⁾ che riproduce la composizione naturale delle membrane basali.

In alternativa alle Boyden tipo camera saggi basati ^filtro-8, le cellule possono essere seminati su di un gel di ECM (a cui possono essere aggiunti fibroblasti) dove formano un monostrato e quindi singolarmente o collettivamente invadere nel gel. Invasion può essere misurata in termini di numero di cellule che invadono e / o la distanza percorsa dalla superficie del gel ^9. Le cellule tumorali possono anche essere completamente incorporati in una matrice o come una sospensione di cellule singole o sferoidi - solitamente poste tra due strati di ECM gel- consentendo alle cellule di invadere dalla massa tumorale nella matrice circostante ^2,6,10,11.

Il tridimensionale (3D) tumore sferoide invasione test qui descritta fornisce un sistema rapido invasione automatizzabili utilizzando un highly riproducibile, metodo standardizzato ¹² in un formato di piastra da 96 pozzetti con uno sferoide per pozzetto. BMM viene aggiunto direttamente a ciascun pozzetto per fornire una matrice semi-solido in cui le cellule tumorali invadono dal corpo sferoidale. Il grado di invasione delle cellule tumorali è monitorata ad intervalli per un periodo di 72-96 ore. Questo metodo fornisce i seguenti vantaggi rispetto ai saggi attuali in vitro invasione citati: il tumore celle sono organizzate in una struttura 3D simulando una micro-regione tumore o un micro-metastasi; sferoidi tumorali sono altamente riproducibili in dimensioni; il saggio di invasione viene eseguita in situ nella stessa piastra come sviluppo del tumore sferoidale, senza la necessità di spostarli piastre secondarie; il metodo, in combinazione con le più recenti tecnologie di analisi automatica delle immagini, permette sia alto contenuto e alto rendimento analisi di invasione delle cellule tumorali.

L'analisi delle immagini viene effettuata utilizzando un sistema di imaging citometro, che analizza un 96 pozzettipiastra entro 10 minuti. Utilizzando l'applicazione confluenza, la portata e la velocità dell'invasione raggiunti sia da singole cellule o gruppi di cellule si diffondono dalle sferoidi tumorali e invasori nella matrice può essere misurata in modo dinamico. Per trasmissione inferiore, un metodo alternativo per l'analisi delle immagini viene presentato, basato sull'uso di un microscopio invertito e software di imaging standard.

Protocollo

1. Generazione di riproducibile Spheroids tumorali Sized

1. Lavare monostrati di cellule tumorali con tampone fosfato (PBS, 5 ml per 25 cm ² o 8-10 ml per un pallone 75 centimetri ^2), aggiungere la dissociazione delle cellule enzima (1 ml per 25 cm ² o 2 ml per 75 cm ² pallone) e incubare cellule a 37 ° C per 2-5 min.
2. Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare la dissociazione cellulare dell'enzima con mezzo di crescita completo (5 ml per 25 cm ² o 8 ml per un matraccio 75 centimetri ^2).
3. Sospensione cellulare Centrifugare a 500 xg per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante, toccare il tubo e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura completo utilizzando una pipetta P1000. Ciò dovrebbe produrre una sospensione di cellule singole, senza gruppi di cellule.
5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per ottenere 0,5-2 x 10 ⁴ cellule / ml (densità cellulare ottimale deve essere determinato per ciascuna linea cellulare in order per ottenere sferoidi tumorali di 300-500 micron di diametro 4 giorni dopo la semina cella ^12,13).
6. Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e, con una pipetta multicanale, dispensare 200 pl / pozzetto in ultra-low di attacco (ULA) 96 pozzetti piastre inferiori rotonde ^12.
7. Trasferire le piastre di un incubatore (37 ° C, 5% CO _2, 95% di umidità). Quattro giorni dopo, confermare visivamente tumore formazione sferoide e procedere con il test di invasione 3D.

2. 3D Tumore Spheroid Invasion Assay

1. Scongelare BMM sul ghiaccio.
2. Mantenere una serie di puntali con filtro sterili per P10, P200 e P1000 pipette e provette sterili (1,5 ml di volume o maggiore a seconda del volume totale richiesto) a -20 ° C.
3. Posizionare le piastre a 96 pozzetti contenenti ULA 4 giorni vecchi sferoidi sul ghiaccio.
4. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l / pozzetto di terreno di crescita dalle piastre sferoidali. Per questo angolo passo le punte verso l'inside parete dei pozzetti U-bottom, evitando il contatto con il fondo del pozzetto e la posizione degli sferoidi; minimizzare il disturbo degli sferoidi.
5. Utilizzando punte ghiacciate, trasferire BMM di tubi ghiacciati. Per invasione citochine indotta o per studi di valutazione di droga, aggiungere i reagenti (a 2x la concentrazione finale) per la BMM con punte ghiacciate. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico (EGF) per stimolare l'invasione delle cellule di carcinoma squamoso CAL ^S e ^R CAL. Mescolare bene agitando delicatamente, evitando la formazione di bolle.
6. Dispensare delicatamente 100 microlitri della BMM nel pozzetto U-bottom, puntando la punta verso la parete interna del pozzo. Questa fase è la più critica come, per l'analisi di immagine ottimale, sferoidi devono rimanere al centro del pozzo ^12.
7. Ripetere il passaggio 2.6 per tutti i pozzetti necessari, permettendo 5-6 ripetizioni / condizione. Se necessario, passare a una punta appena raffreddato.
   NOTA: quando più esperto, 'erogazionese BMM usando una pipetta multicanale.
8. Usando un ago sterile, rimuovere le bolle, se presente.
   1. Utilizzando un microscopio, controllare visivamente che sferoidi sono in una posizione centrale. In caso contrario, centrifugare la piastra a 300 xg per 3 min a 4 ° C. Questo farà sì che sferoidi occupano una posizione centrale in ogni pozzetto.
9. Trasferire la lastra in un termostato a 37 ° C e consentire al BMM solidificare.
10. 1 ora più tardi, con una pipetta multicanale, aggiungere delicatamente 100 ml / pozzetto di terreno di coltura completo. Per invasione o di valutazione farmaco studi citochine indotta, includere citochine o inibitori nel medio (1x concentrazione finale). In alternativa, se i reagenti non sono stati aggiunti al BMM nel passo 2.5, aggiungerli al mezzo a questo punto (3x la concentrazione finale desiderata).

3. Automated Image Acquisition

1. Piatti di scansione sul citometro (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali) ad intervalli starting da tempo zero (t0 = giorno del test di invasione istituito, subito dopo il punto 2.10 fino a 72 ore, o 96 ore per invasione linee cellulari tumorali più lente.
2. Selezionare l'applicazione 'Confluence'.
3. Controllare che il sferoide è a fuoco e, se necessario, regolare manualmente e fissare il 'Fuoco partì-'.
4. In "impostazioni di campionamento", selezionare la scansione un campo centrale visivo (FOV). Dopo BMM Inoltre, sferoidi tumorali dovuti rimanere in una posizione centrale, quindi non vi è alcuna necessità di eseguire la scansione dell'intero bene.
5. Nel software, definiscono i pozzetti da analizzare evidenziandoli sulla mappa piatto. Clicca su 'Start Scan'.
   NOTA: La scansione viene salvato e può essere rivisto in seguito off-line automaticamente.

4. Automated Image Analysis

1. Seleziona l'applicazione 'Confluence'.
2. Nella scheda 'Analysis', regolare applicImpostazioni ation (ad esempio, "precisione": basso, normale, alto, "soglia di intensità": 1 - 15) per produrre una segmentazione precisa intorno alla sferoide, inclusi i processi cellulari e invadopodi estendono nel BMM (vedi Figura 1). Regolare le impostazioni per ogni linea di cellule tumorali e / o in vari momenti. Misure di applicazione La 'Confluence' la% della superficie ben coperto dalle cellule invasori, nel FOV selezionato.
3. Verificare che le impostazioni di analisi sono appropriate (ad esempio, la segmentazione è preciso) per gli altri spheroids nella piastra cliccando su alcuni pozzi diversi. Se la segmentazione non delinea con precisione uno sferoide, regolare ulteriormente le impostazioni dell'applicazione.
4. Clicca su 'Start' analisi '.
5. Nella scheda 'Risultati', controllare più pozzi per verificare la qualità dell'analisi. Export 'Bene dati a livello di' a un foglio di calcolo.
6. Ripetanalisi t per tutti i punti temporali. Calcolare la media% di confluenza per pozzi replicati e invasione del terreno (% confluenza) contro il tempo in un grafico a barre, con grafici scientifici e software statistico di scelta.

5. Manuale Image Acquisition

1. Registrare un'immagine per ciascun sferoide tumore ad intervalli partire da t = 0 fino a 72-96 ore, a seconda della velocità di invasione della linea cellulare in questione, utilizzando un microscopio invertito (per una piastra a 96 pozzetti questo richiede circa 20 - 30 min). Utilizzare un obiettivo 10X. Utilizzare un obiettivo 4X quando un'area invasa è troppo grande per essere completamente catturato all'interno del campo di vista 10X.
2. Salvare ogni singola immagine acquisita.
3. Per la calibrazione, prendere le immagini di uno stadio reticolo (1 mm) utilizzando entrambi gli obiettivi 10X e 4X (e salvare le immagini).

6. Manuale Image Analysis

1. Aprire le immagini palco reticolo nel software di analisi delle immagini di scelta.
2. Inserisci il gratmisurazioni icule, le unità (micron), gli obiettivi usati (10X o 4X) e di eseguire la calibrazione. Questo passaggio è necessario solo una volta. Per la successiva analisi delle immagini, è sufficiente ricaricare le impostazioni di calibrazione necessarie.
3. Aprite le immagini del saggio di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in funzione dell'obiettivo del microscopio (10X o 4X) usata per ottenere le immagini.
   1. In alternativa, importare immagini ottenute su un citometro di imaging (fase 3) e analizzare manualmente, come descritto per le immagini ottenute con un microscopio invertito (vedere i risultati mostrati in Figura 3 e Figura 4).
4. Misurare l'area coperta da sferoidi.
   1. Nel software utilizzato qui per la Rappresentante dei risultati (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali), vai su 'misura' e selezionare 'Count / size'. Abbiamo scelto 'File' poi 'Carica impostazioni' e selezionare predeterminato assaImpostazioni y. Quindi scegliere 'Conte'. Il sferoide dovrebbe poi essere segmentato in modo accurato.
   2. In alternativa, andare su 'Modifica' poi 'Disegna / Unisci oggetti' per aprire la finestra 'bacchetta magica / Trace'. Usate il cursore bacchetta di cliccare sull'immagine sferoide su ed ottenere la segmentazione. Seleziona 'Traccia' (nella finestra 'bacchetta magica') per delineare manualmente la sferoide utilizzando un mouse.
5. Misure di esportazione di diversi parametri (area, diametro, perimetro ecc) ad un foglio di calcolo. Record sul foglio le informazioni sull'immagine rilevanti (ad esempio, ben il numero, punto di tempo relativo).
6. Tracciare l'area media di sferoidi ripetute (invasione) in funzione del tempo con grafica scientifica e software statistico. In alternativa, calcolare la variazione dell'area sferoide ciascun tempo, rispetto alla zona a t = 0. Quindi invasione trama (% t0) in funzione del tempo come gra lineariph.

Risultati

3D tumore sferoide invasione è valutato attraverso un riproducibile, metodo semplice, automatizzato schematicamente illustrata in figura 1: sferoidi tumorali riproducibile dimensioni sono ottenuti placcatura cellule in ULA 96-pozzetti a fondo sferico. 4 giorni sferoidi post-iniziazione sono incorporati in BMM. Questo fornisce una struttura semi-solido in cui le cellule tumorali invadono e sparsi dello sferoide. Spheroids sono in posizione centrale alla base di ogni bene e di invasione nella BMM è facilmente monitorata ad intervalli a partire da t = 0 fino a 72-96 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. Questo può fornire un'analisi immagine completamente automatizzato.

Esempi di diversi tipi di invasione delle cellule del cancro sono illustrate nelle figure 2 -. 4 L'altamente maligno multiforme glioblastoma umano (GBM) linea cellulare U-87 MG, forma una struttura 3D sferica stretto e viene qui utilizzato per esemplificare tumori cerebrali nei quali locali invasione è una chiave pericolo di vitacaratteristica. Una volta incorporato in BMM, cellule da sferoidi U-87 MG si sviluppa con un tipico "starburst" invasione modello ^12. Le cellule tumorali radialmente estendono nella matrice in cui mantengono una forma 3-dimensionale. Il processo è seguito in un periodo di 72 ore, come mostrato in Figura 2 per U-87 sferoidi MG, quando il grado di invasione delle cellule tumorali, con dettagli dei processi cellulari e invadopodi estendono nella BMM è chiaramente evidente. Completamente automatizzato analisi delle immagini utilizzando un'immagine citometro consente la quantificazione precisa della invasione delle cellule tumorali nel corso del tempo. La quantificazione in figura 2 è ottenuto come illustrato nella figura 1, dove l'analisi automatizzata produce segmentazione attorno alle sporgenze cellulari estendono nella BMM dal 87-U MG corpo sferoidale. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo sferoidale tumore è escluso dalla misurazione dell'area invasa.

Un modello diverso di invasion è stato visualizzato da linee umani squamose della testa e del collo di cellule tumorali. CAL ^S e CAL ^R sono isogenico ma CAL ^S è sensibile a, e CAL ^R resistente agli inibitori della chinasi di EGFR tirosin ^14. In assenza di EGF, né linea cellulare invaso nel BMM (Figura 3) Tuttavia, poiché la concentrazione di EGF è stato aumentato (a 2,5 ng / ml), gli sferoidi sembrano 'germoglio'. Alle concentrazioni elevate di EGF (40 e 80 ng / ml) il grado di invasione è stata ridotta. Questo è coerente con il classico a campana dose-risposta per EGF in termini di invasione che è stato precedentemente riportato ^15. In 20 ng / ml EGF, sporgenze simili a dita estruso dal corpo principale di sferoidi CAL ^R mentre cellule CAL ^S erano meno invasiva dopo 72 ore (Figura 3). Questa invasione differenza era evidente 48 ore dopo sferoidi sono stati collocati in BMM (contenente 20 ng / ml FEG per distinguere la massima tra le linee cellulari) Ed il meglio dopo 72 ore (Figura 4). Queste immagini sono state acquisite rapidamente utilizzando un citometro di imaging, come per U-87 MG. Tuttavia, in questo caso, per esemplificare un metodo alternativo, il grado di invasione è stata quantificata manualmente utilizzando il software di analisi di immagine stand-alone e si presenta graficamente (figure 3 e 4). Questi risultati mostrano una differenza fenotipica tra cellule farmaco-sensibili e resistenti all'azione che potrebbero essere utilizzati per lo screening per composti che specificamente antagonizzare l'resistente fenotipo invasivo droga.

Figura 1. Schema di 3D tumore sferoide saggio di invasione. Il flusso di lavoro mostra i passaggi del metodo comporta l'inclusione di immagini rappresentative di sferoidi U-87 MG glioblastoma solo dopo l'incorporazione in BMM (pannello superiore; t = 0) e dopo l'invasione in BMM (pannello inferiore; t = 72 ore) con e senza la segmentazione che misura l'area coperta dalle cellule invasori. Bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Time-corso di U-87 MG glioblastoma sferoide invasione in BMM. U-87 MG sferoide invasione 3D nel BMM è stato monitorato e quantificato fino a 72 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione sono mostrati invasione delle cellule tumorali. Bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. CAL ^R (resistenza) e CAL ^S (sensibilità) tumore sferoidale invasione. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione manuale di EGF dose-dipendente ^R CAL e CAL ^S tumore sferoide invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Le cellule da CAL ^R (resistente) sferoidi sono più invasivi rispetto CAL ^S (sensibili) sferoidi tumorali quando sono immessi in BMM. Dopo stimolazione EGF CAL ^R sferoidi tumorali mostrano una invasione più pronunciato rispetto CAL ^S. (A) Immagini rappresentative e (B) la quantificazione manuale dell'invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

I due modelli tumorali qui descritti (glioblastoma e SCCHN) sono stati appositamente selezionati per esemplificare il nostro test 3D come siano clinicamente rilevanti tumori localmente invasivi con un bisogno insoddisfatto per terapie efficaci ^12. A seguito di trattamento farmacologico, la valutazione dei cambiamenti in vitro farmacodinamica (PD) biomarker in può essere eseguita facilmente mediante western blot o immunologici del lisati in seguito all'uso di specifici reagenti commercialmente disponibili per consentire il recupero delle cellule da BMM e / o l'analisi di immunofluorescenza di invadere sferoidi tumorali tutto colorazione mount.

Questo saggio di invasione è una tecnica utile per la valutazione rapida e riproducibile di invasione delle cellule tumorali in un mezzo semisolido e quindi particolarmente adatto per il futuro in screening di farmaci vitro. Le cellule tumorali invadono la matrice in modo 3D come si diffondono fuori da un "micro-tumorale", rappresentata dalla sferoidale tumore, e si estendono in un extracellulambiente ar a matrice. La vera tridimensionalità del dosaggio è evidente nella morfologia cellulare, che è diverso dal piatto, morfologia aderente cellule assumono quando si spostano su un substrato solido. Il grado di invasione è facilmente quantificato utilizzando un citometro di imaging, permettendo una lettura-out automatico, oppure utilizzando un microscopio convenzionale in combinazione con software di imaging. Inoltre, questo metodo è adatto per l'imaging fluorescente ¹³ (per esempio con linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti o pre-etichettato con coloranti fluorescenti).

Il metodo è semplice da eseguire con la sola fase critica rappresentata dall'aggiunta della BMM, quando vi è un rischio di disturbare la posizione centrale dello sferoide nel U bene. Questo può portare ad analisi di immagine ottimale, con sferoidi in diversi piani focali. E 'quindi fondamentale per aggiungere lentamente e con cautela la BMM di ogni bene. Dopo BMM Inoltre, è consigliabile verificare la targasotto un microscopio e se la localizzazione è considerata inaccettabile, questo può essere risolto dolce centrifugazione. Con l'esperienza, questo è raramente necessaria. Anche se questo metodo è molto robusto e riproducibili, variabilità inter-sperimentale potrebbe verificarsi con diversi lotti di BMM. Per evitare ciò, si consiglia di acquistare sufficiente BMM da una singola partita per completare una serie di studi.

Una limitazione del metodo (come per tali dosaggi) è la difficoltà nel distinguere tra l'invasione e la proliferazione, che le cellule tumorali probabilmente subiscono durante il periodo di tempo del test. Anche se il tempo di raddoppio delle cellule può essere preso in considerazione, o inibitori del ciclo cellulare come citocalasina D introdotto, non è facile da controllare o chiaramente distinguere tra questi due aspetti diversi della progressione tumorale, in particolare per le cellule tumorali in rapida crescita e per coloro che hanno una più "espansiva", piuttosto che infiltrante, modello di invasione. Per questo motivosi suggerisce che un saggio di crescita 3D parallelamente viene eseguito per valutare gli effetti specifici di agenti inibitori o stimolatori. Se si eseguono studi di risposta attenta dosi, può essere possibile selezionare concentrazioni che minimizzano gli effetti sulla proliferazione. Per esempio abbiamo dimostrato che l'inibitore HSP90 17-AAG inibisce U-87 MG 3D tumore sferoide invasione già a 24 ore ed a concentrazioni inferiori concentrazione che inibisce la crescita 3D del 50% (GI ₅₀₎ ^12.

D'altra parte, il significato di questo test rispetto ad altri test invasione standard (ad esempio, saggi filtro basato o invasione delle singole cellule in matrici 3D ^1), è che le cellule tumorali invadono nella matrice circostante dalla sferoidale, che assomiglia a una " micro-tumorale "o" micro-metastasi ", e quindi tiene conto degli aspetti importanti della fisiopatologia di una massa tumorale. Il metodo presentiamo fornisce informazioni sullacomportamento collettivo delle cellule tumorali, quando lasciando inizialmente sferoidi, e anche individualmente, quando singole cellule raggiungono le regioni più lontane nel BMM. Inoltre, le cellule all'interno sferoidi tumorali possono verificarsi ipossia e nutrienti privazione che, attraverso i cambiamenti nell'espressione genica, in grado di promuovere la migrazione e l'invasione; tali caratteristiche sono assenti nelle analisi 2D. Inoltre, tutto questo è disponibile in un formato ad alta produttività attraverso l'utilizzo di piastre a 96 pozzetti specifici e la recente tecnologia di imaging, consentendo un saggio 3D più complesso da essere facilmente utilizzato nella convalida di destinazione e la scoperta di farmaci.

Il metodo che presentiamo in grado di ospitare ulteriori applicazioni per affrontare ulteriori aspetti di invasione delle cellule tumorali. In particolare, la complessità supplementare può essere previsto con l'aggiunta di cellule ospiti, come i fibroblasti e / o cellule endoteliali, nel sferoidale stesso o matrice circostante. Questo può anche essere modificato, non solo in termini di rigidità (con l'uso di diversi concentrations di BMM), ma anche in termini di composizione (con l'aggiunta di altri componenti dipendenti dalla specifica del tessuto / organo del modello adottato tumore: ad esempio, per i tumori cerebrali tenascin ¹⁶ e collagene per carcinoma mammario ^17).

Un simile set-up (generazione di sferoidi e di imaging) possono anche essere adattate per valutare invasione tissutale in 3D, dove sferoidi tumorali sono co-coltura con corpi embrionali simile a un tessuto complesso ¹² o con altri organoidi specifici delle cellule (ad esempio, per astrociti glioma ¹⁸ o cripta colture per i tumori gastrointestinali), ma ulteriore lavoro è necessario per consentire l'analisi automatica delle immagini.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix	Corning	354234	Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear	Trevigen	3432-005-01	Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate	Corning	7007
EGF	Miltenyi Biotec	130-093-825	Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium	Stem Cells Inc.	SCS-SF-NB-01	For diluting EGF
DMEM	GIBCO	31966-021	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	Biosera	1001/500	Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE	GIBCO	12605	Cell dissociation solution
Celigo cytometer	Nexcelom Bioscience	n/a	Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope	Olympus	n/a	Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera	Qimaging	n/a	Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	n/a	Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0	Media Cybernetics	n/a	Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010	Microsoft	n/a	Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0	GraphPad	n/a	Scientific graphing and statistical software