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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.

Abstract

Vescicole extracellulari (SVE), particelle membranose rilasciate da vari tipi di cellule, in possesso di un grande potenziale per le applicazioni cliniche. Essi contengono acidi nucleici e proteine ​​carico e sono sempre più riconosciuti come un mezzo di comunicazione intercellulare utilizzato sia da eucarioti e cellule procariote. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni, attuali protocolli per l'isolamento di EVs sono spesso molto tempo, ingombrante, e richiedono grandi volumi di campione e attrezzature costose, come un'ultracentrifuga. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una piattaforma immunoaffinità cartaceo per la separazione sottogruppi di veicoli elettrici che è facile, efficiente, e richiede volumi di campione a partire da 10 ml. I campioni biologici possono essere pipettati direttamente su aree di prova di carta che sono stati modificati chimicamente con le molecole di cattura che hanno alta affinità per specifici marcatori di superficie EV. Abbiamo la convalida del saggio utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), a base di carta immunosorben enzimaticot test (P-ELISA), e l'analisi del trascrittoma. Questi dispositivi cartacei consentiranno lo studio dei veicoli elettrici nella clinica e l'impostazione della ricerca per far progredire la nostra comprensione delle funzioni EV in salute e malattia.

Introduzione

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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Protocollo

Uno schema generale della procedura operativa è prevista in Figura 1. Utilizzando pratiche etiche, abbiamo raccolto campioni di sangue di soggetti sani, e ottenuto campioni di umore acqueo pazienti attraverso la Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sotto IRB approvato protocolli ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Realizzazione di dispositivi di carta

  1. Tagliare la carta per cromatografia in cerchi di 5 mm di diametro per fornire lo stesso layout come una micropiastra a 96 pozzetti. Sandwich questi pezzi di carta con due fogli di polistirolo con sede fori passanti, e laminato.
  2. Modificare i dispositivi di carta con il metodo coniugazione chimica descritto nei passaggi seguenti 28.
    1. Trattare dispositivi di carta con plasma di ossigeno (100 mW, 1% di ossigeno, 30 sec) in una camera di plasma.
      ATTENZIONE: Particolare cautela deve essere presa quando si lavora con 3 mercaptopropil trimetossisilano e N--γ maleimidobutyryloxy succinimmideestere (GMBS), poiché entrambi sono sensibili all'umidità e tossici. Indossare guanti protettivi ed evitare l'inalazione o contatto con la pelle e gli occhi. Tenere il flacone magazzino ben chiuso e lasciarlo equilibrare a RT prima di aprire per evitare la formazione di condensa. In alternativa, aprire la bottiglia stock all'interno di un sacchetto guanto di azoto riempito o scatola. Aliquota in piccole fiale per evitare frequente apertura della bottiglia stock.
    2. Subito Incubare trattati dispositivi di carta in un (v / v) soluzione al 4% di 3-mercaptopropil trimetossisilano in etanolo (200 proof) per 30 min.
    3. Risciacquare dispositivi di carta con etanolo e incubare con 0,01 mmol / GMBS ml in etanolo per 15 min.
    4. Sciacquare con etanolo (200 proof) e incubare dispositivi di carta con 10 mg / ml soluzione avidina in tampone fosfato (PBS) per 1 ora a 4 ° C. Conservare a 4 ° C, se necessario, e utilizzare entro 4 settimane.
  3. Bagnare ogni zona di prova di carta con 10 microlitri PBS contenente 1% (w / v) di albumina sierica bovina (BSA) Per 3 × 10 min prima di avvistare 10 ml biotinilati molecole di cattura per 3 × 10 min. Utilizzare l'anticorpo anti-CD63 (20 ug / ml in PBS contenente 1% (w / v) BSA e 0,09% (w / v) di sodio azide) o annessina V (1:20, v / v in annessina V binding buffer) come molecole di cattura.
  4. Risciacquare anticorpi o annessina V molecole anti-CD63 non legati con 10 microlitri corrispondente PBS contenente 1% (w / v) BSA o annessina V soluzioni tampone vincolante per 3 × 1 min, rispettivamente.

2. siero e acqueo Umore Raccolta e lavorazione

  1. Collezione Serum.
    1. Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in tubi di siero di separazione e capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte. Impostare il tubo in posizione verticale e attendere 30 min.
    2. Centrifugare a 1.200 xg per 15 min. Trasferire il siero di strato superiore in una provetta pulita, e centrifugare di nuovo a 3.000 xg per 30 min.
    3. Passare il surnatante con un fil di 0,8 micronter. Mantenere il campione a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Collezione umore acqueo: raccogliere campioni di umore acqueo pazienti diagnosticati da un oculista direttamente attraverso procedure e conservare i campioni invasiva a -80 ° C fino al momento dell'uso.

3. Isolamento di extracellulare vescicole

  1. Campioni Spot su ogni zona di prova di carta a una velocità di 5 ml / min.
  2. Risciacquare veicoli elettrici non legati con 10 ml corrispondenti PBS contenente 1% (w / v) BSA o annexin V vincolante soluzioni tampone per 3 × 1 min per dispositivi carta funzionalizzati con molecole di anticorpi o annessina V anti-CD63, rispettivamente. Eseguire le seguenti saggi a valle.

4. valle Assay Esempio 1: Electromicrographs scansione

  1. Fissare EV catturati su funzionalizzata zona di prova di carta utilizzando 10 microlitri 0,5 × fissante di Karnovsky per 10 min.
  2. Sciacquare i campioni con ampio PBS per 2 × 5 min.
  3. Disidratare ilcampioni con conseguente 35% di etanolo per 10 min, 50% di etanolo per 2 × 10 min, 70% di etanolo per 2 × 10 min, 95% di etanolo per 2 × 10 min, e il 100% di etanolo per 4 × 10 min.
  4. Critical asciutto e sputtering rivestire i campioni con palladio / oro, ed esaminare con un microscopio elettronico a scansione funzionare a bassa tensione di accelerazione di elettroni (~ 5 kV).

5. valle Assay Esempio 2: a base di carta ELISA

  1. Aggiungere una soluzione 5 ml contenente anticorpo primario anti-CD9 a 1: 1.000 di diluizione in PBS per ogni zona di prova contenente EV catturati. Attendere 1 min.
  2. Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
  3. Aggiungere a 5 ml soluzione contenente perossidasi (HRP) -linked anticorpo secondario a 1: 1.000 di diluizione in PBS e attendere 1 min.
  4. Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
  5. Aggiungere un substrato colorimetrico 5 microlitri contenente rapporto 1: 1 volume di idrogeno perossido di und 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e la scansione con uno scanner da tavolo.

6. A valle Assay Esempio 3: RNA Isolation

  1. Immergere i campioni in 35 ml di aiuti isolamento RNA a base polivinilpirrolidone-e 265 ml di lisi / binding buffer per la lisi EV catturati. Vortex vigorosamente.
  2. Aggiungere 30 microlitri omogenato fornito nel kit di isolamento al lisato. Vortex energicamente e mettere in ghiaccio per 10 min.
  3. Estrarre l'RNA utilizzando acido separazione fenolo-cloroformio descritto nei seguenti passaggi.
    1. Prendere 330 ml di fenolo-cloroformio dallo strato fondo della bottiglia e aggiungere al omogenato / lisato. Vortex vigorosamente.
    2. Centrifugare a 10.000 xg per 5 min. Trasferire la fase acquosa (superiore) in una provetta pulita e notare il volume rimosso.
  4. Precipitare il RNA totale con il 100% di etanolo del volume che è 1,25 volte il volume della fase acquosa rimossa nel passaggio precedente e collect l'RNA nella soluzione di eluizione preriscaldato a 95 ° C.
  5. Concentrato e purificare ulteriormente l'RNA utilizzando un kit di RNA di pulizia secondo il protocollo del produttore.

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Risultati

La capacità del dispositivo di carta per isolare sottogruppi di veicoli elettrici si basa in modo efficiente sul suo riconoscimento sensibile e specifico di marcatori di superficie EV. La modifica stabile di fibre di carta con molecole di cattura è ottenuto utilizzando la chimica avidina-biotina come descritto altrove 28-30. L'efficacia di coniugazione chimica e quella del metodo fisisorbimento è valutata utilizzando letture basati sulla fluorescenza. Le zone di prova carta vengono preparati seguendo p...

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Discussione

Le fasi più critiche per il successo isolamento di sottogruppi di vescicole extracellulari sono: 1) una buona scelta di carta; 2) di copertura stabile ed elevato di molecole di cattura sulla superficie delle fibre di carta; 3) la corretta manipolazione dei campioni; e 4) la pratica di laboratorio di igiene generale.

Materiali porosi sono stati utilizzati in molti saggi economici e senza attrezzatura. Essi possono avere dimensioni sintonizzabile pori, funzionalità versatile, a basso costo e...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NSC 99-2320-B-007-005-MY2 Taiwan Consiglio Nazionale della Scienza grants- (CC) e NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), e il Veterans General Ospedali e sistema universitario di Taiwan Programma comune di ricerca (CC).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Riferimenti

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