Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Riepilogo

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Abstract

Microscopia intravitale è un metodo che può essere utilizzato per studiare processi diversi in diverse regioni e vasi negli animali viventi. In questo protocollo, si descrive la microscopia intravitale delle vene mesentere. Questo può essere eseguito in un breve periodo di tempo con risultati riproducibili mostrano interazioni leucociti-endotelio in vivo. Descriviamo un ambiente infiammatorio dopo LPS sfida dell'endotelio. Ma in questo modello si può applicare diversi tipi di patologie infiammatorie, come batteri, chimica o biologica e indagare la somministrazione di farmaci e dei loro effetti diretti sul animale vivente e il suo impatto sul reclutamento dei leucociti. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di diversi trattamenti di topi ei loro effetti sulla risposta infiammatoria nei vasi. Qui, si descrive la visualizzazione dei leucociti e piastrine etichettando fluorescente questi con rodamina 6G. Inoltre, qualsiasi immagini specifico può essere performed utilizzando mirati molecole fluorescente.

Introduzione

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica semplificata della microscopia intravitale delle vene mesentere in topi viventi per l'osservazione diretta di interazioni leucociti-endoteliale e leucociti-piastrine in condizioni infiammatorie.

Microscopia intravitale è stato sviluppato per studiare le interazioni leucociti-endotelio in vivo in condizioni infiammatorie ^1,2, che non è banale, ma importante per la comprensione infiammatorio reclutamento e la funzione dei leucociti. Il metodo che descriviamo in questo protocollo è stato sviluppato sulla base di pubblicazioni precedentemente pubblicati. Simile alla visualizzazione piastrinica incorporazione in un trombo crescente ³ e parallelo a quello che è stato pubblicato in precedenza ^4, un mesentere vena esteriorizzato viene esaminato al microscopio luce trasmessa. Ci sono vari altri modelli di microscopia intra-vitale, come il muscolo cremastere di ratti ⁵ o al fegato di topo e ratti ^6.

Microscopia intravitale di mesentere vena è stata sviluppata e applicata in precedenti studi da diversi gruppi. Abbiamo usato questa tecnica per osservare le differenze nel reclutamento dei leucociti tra topi wild-type e triptofano hydroxylase1 (TPH1) - / - topi, che sono carenti di serotonina non neuronale e confrontato i risultati al topo il cui serotonina piastrinica è stata farmacologicamente impoverito da a lungo termine la domanda di un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina fluoxetina ^7. Abbiamo anche esaminato le interazioni leucociti-endotelio dopo il trattamento con fluoxetina acuta ^8.

In questo protocollo ci concentriamo sulla microscopia intravitale di vene mesentere, perché questo modello è possibile eseguire in modo rapido, e consente misure valide di interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti. Questo è molto più difficile e in microscopia intravitale di altri organi, come le ossa, fegato, pelle, o muscolo cremastere richiede tempo. La modal qui descritto è ideale per la valutazione riproducibile di interazione cellula-cellula infiammatoria dopo stimolante con uno stimolo infiammatorio, come l'iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla legge sulla protezione degli animali tedesca (TierSchG). I topi sono stati alloggiati e trattati in conformità alle buone pratiche di origine animale come definito da FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) e il corpo al benessere degli animali nazionale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Il comitato benessere degli animali dell'Università di Friburgo, così come le autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg) ha approvato tutti gli esperimenti su animali.

1. Animal Handling, Preparazione e induzione di infiammazione

1. Utilizzare 4-6 settimane di età topi maschi con una gamma di peso di 16 - 20 g. Nota: se i topi sono più vecchi o più pesante che presentano grasso eccessivo che circonda la nave, limitando l'osservazione microscopica.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti e tavolo microscopio prima di un intervento chirurgico.
3. Iniettare 20 mg / kg LPS (lipopolisaccaride) per via intraperitoneale 4 ore prima di microscopia nel mouse vivente di indurre un inflamm battericazione.
4. Preriscaldare una soluzione salina allo 0,9% a bagnomaria a 37 ° C per umidificare la camera di plastica e il tessuto mesentere.
5. Anestetizzare il mouse con iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) subito prima della procedura di microscopia. Anestesia alternativi possono essere utilizzati, ad esempio, 2% inalazione isoflurano. Verificare il corretto anestesia dalla perdita di risposta alla stimolazione riflessa (punta o la coda pizzico di pressione costante).
6. Depilate l'addome con un rasoio elettrico e rimuovere i capelli sciolti con una garza saturato con etanolo al 70%.
7. Applicare veterinario pomata sugli occhi del mouse per prevenire la secchezza, mentre sotto anestesia.

2. Chirurgia

1. Sterilizzare l'addome, utilizzando il 70% di etanolo. Questo metodo non è un metodo sterile e potrebbe essere letale alla fine dell'esperimento.
2. Eseguire una laparotomia mediana: Aprire la pelle addominale con piccoli, pinze curve e forbicine. Identificare il epivasi gastrical e aprire il peritoneo nella regione della linea alba, per proteggere i vasi.
3. Applicare alcune gocce di soluzione salina preriscaldata nella cavità addominale per mantenere il tessuto umido.
4. Leucociti etichette e piastrine fluorescently iniettando 50 microlitri rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitale come descritto prima ^9,10.
5. Esteriorizzarmi un'ansa ileumand posto in un petridish con un diametro di 10 cm e assicurarsi di mantenere il tessuto umido applicando il 37 ° C preriscaldata soluzione salina (0,9%) ogni minuto.

3. intravitale Microscopia

1. Posizionare il mouse sotto il microscopio e portare la vena mesentere con un diametro di 200-300 micron nel centro di vista. Scegliere una nave senza un ambiente grasso visibile.
2. Non toccare i vasi mesentere evitando in tal modo la stimolazione dell'endotelio. Maneggiare il ciclo ileo cautela.
3. Visualizza interazioni delle cellule endoteliali nel sanguecon un microscopio invertito o verticale e una telecamera utilizzando un software microscopio. Record di sangue interazioni delle cellule endoteliali per 1 minuto a 4 diverse vene per mouse.
4. Euthanize il mouse per dislocazione cervicale dopo il completamento di esperimenti di imaging.

4. Analisi

1. Effettuare l'analisi offline e accecato per tutti i parametri. Effettuare analisi utilizzando qualsiasi programma software adatto.
2. Confermare condizioni stabili e interindividually comparabili flusso sanguigno in alta risoluzione tempo cine-clip (frame rate massimo) incentrati sul flusso di globuli endoluminale.
3. Quantificare il numero di leucociti rotolamento. Perciò tracciare una linea verticale attraverso la vena e contare tutti i leucociti che attraversano questa linea in 1 min.
4. Determinare velocità di rotazione misurando il tempo di un singolo leucociti deve passare una distanza di 50 micron mentre stabilmente rotola su endotelio. Per questo, tracciare due linee verticali in una distanza di 50 micron tttraverso la vena.
   1. Misurare il tempo di leucociti rappresentante deve ottenere da una riga alla other.Calculate la velocità dei leucociti dividendo 50 micron attraverso il tempo necessario (micron / s).
5. Misurare adesione dei leucociti in un campo di 0,04 mm ^2. Per fare questo, disegnare un quadrato con la lunghezza del lato 200 micron nella vena.
   1. Contare i leucociti aderenti dell'impresa, definiti come nessun movimento visibile per 30 secondi, all'interno di questa piazza.
6. Contare il numero di piastrine legate a uno dei leucociti quantificare le interazioni di piastrine-leucociti.

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Risultati

Una panoramica dell'impostazione sperimentale descritto in questo protocollo è mostrato in Figura 1. Essa mostra un mouse con un ileo-loop esteriorizzato e sue navi, che può essere osservata in microscopia intravitale. Figura 2 mostra certo grado di attivazione in animali non trattati a causa la procedura stessa. Ma non c'è quasi rotolamento lento o ferma adesione dei leucociti, rispetto ai topi LPS-trattati. La figura 2 mostra anche i diversi risultati della...

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Discussione

Qui si descrive la preparazione e l'esecuzione di microscopia intravitale delle vene mesentere di topi in vivo. Questo metodo ci dà l'opportunità di osservare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-endotelio ¹¹ direttamente nell'organismo vivente.

Come risposta precoce alla infiammazione dell'endotelio viene attivato e interagisce con leucociti e piastrine con conseguente rotolamento, aderenza e la trasmigrazione ^12. Ma leucociti inter...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma-Aldrich	L2637