Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Riepilogo

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

Risposta immunitaria efficace dipende da una rapida mobilitazione dei leucociti del sangue al sito di infezione o lesioni. Indagare la migrazione dei leucociti in vivo è di fondamentale importanza per la comprensione delle basi molecolari della migrazione dei leucociti transendoteliale e l'interazione con l'endotelio vascolare. Un approccio potente coinvolge microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in cellule di interesse.

Qui vi presentiamo un protocollo per i monociti imaging e neutrofili nel CX ₃ CR1 ^{GFP / peso} del mouse iv iniettato con arancio neutrofili dye-etichettati con un microscopio confocale invertito. Film time-lapse raccolti da 30 minuti a diverse ore dell'imaging permettere l'analisi del comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche sia in condizioni di stato e infiammatorie costante. Abbiamo inoltre descritti i passi per indurre localmente infiammazione dei vasi sanguigni con TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 e monitorare la subsequent reclutamento dei neutrofili e monociti.

La tecnica presentata può anche essere utilizzato per monitorare altre popolazioni di leucociti e indagare le molecole implicate nel reclutamento dei leucociti o nel traffico con altri stimoli o topi transgenici.

Introduzione

Neutrofili e monociti sono cellule del sistema immune innato che circolano continuamente nel sangue. Su lesioni o infezioni, segnali infiammatori inducono leucociti diapedesi in tessuti danneggiati e infetti, qui l'avvio di una risposta immunitaria cellulare ^1-3. La rapidità di leucociti mobilizzazione determina l'esito positivo delle risposte immunitarie. Questi processi intricati basano su molecole specifiche (ad esempio, selectine, chemochine endotelio-bound) presenti sull'endotelio infiammata che aiutano per la creazione di contatti tra adesivi leucociti circolanti e l'endotelio ^1-3 .Per ottenere approfondimenti sulle molecole implicate nella leucociti assunzione in cascata, è importante visualizzare la cinetica di reclutamento di cellule e per monitorare il comportamento di ciascuna cella / popolazione. Un metodo efficace consiste microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in cellule di interesse.

content "> Ad oggi, diversi approcci usando la microscopia intravitale sono stati sviluppati per l'immagine del sistema vascolare ^4,5. Ad esempio, l'imaging del derma orecchio vascolarizzazione o vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravitale è stato utilizzato per identificare il comportamento pattugliamento delle Ly6C murino monociti ^{bassi e} umano CD14 ^dim CD16 ⁺ monociti sul lato luminale dei vasi sanguigni a regime ^{di 6-8.} Il modello di vascolarizzazione del mouse cremastere viene spesso utilizzato per monitorare il comportamento di neutrofili o Ly6C infiammatoria ^elevati monociti in condizioni infiammatorie o ischemiche in topi transgenici. In tale caso, Cremaster è stimolata mediante iniezione intrascrotale di IL1β, CCL2, TNFβ o fMLP. Dopo 2-4 ore, i tessuti vengono poi chirurgicamente esteriorizzate e analizzati da confocale microscopio intravitale ^9-11.

Il protocollo seguente descrive un metodo per monitorare monociti e neutrofili contemporaneamente con qualsiasifluorescenza invertito microscopio confocale. Inoltre, il nostro metodo descrive come immagine stessa nave prima (condizione di stato stazionario) e dopo l'infiammazione e come seguire la cinetica di reclutamento dei leucociti. A questo scopo, si usa il CX ₃ CR1 topo ^{GFP / peso,} il cui monociti esprimere eGFP, iv iniettato con un arancio neutrofili murini dye-etichettati. Utilizzando un microscopio confocale invertito, è possibile (1) per monitorare e analizzare le pattugliamento Ly6C ^basse monociti in condizioni stazionarie e (2) a seguire l'assunzione di entrambi i monociti e neutrofili nella stessa nave dopo infiammazione locale. Qui creiamo le condizioni infiammatorie utilizzando l'agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 ^12. Inoltre, tali immagini può aiutare a determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nelle varie fasi della cascata reclutamento dei leucociti se eseguita su specifici topi knock-out o in presenza di anticorpi bloccanti ^6,9,13.

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Protocollo

NOTA: le procedure di animali sono stati eseguiti in conformità con la Comitato Etico Istituzionale di Animal Care a Ginevra, in Svizzera e l'Ufficio cantonale di veterinaria. Numero di autorizzazione GE / 63/14.

1. Preparazione di una sospensione singola cella da midollo osseo

1. Mouse Sacrificio (8-12 settimane di età) per dislocazione cervicale. Sterilizzare zampe posteriori con il 70% di etanolo. Togliere la pelle dalle gambe posteriori.
2. Sezionare femori e tibie e il mouse rimuovere il tessuto da gambe con un bisturi. Sciacquare gambe con il 90% di etanolo e posto in un piatto cultura piena di PBS.
3. Sotto il cofano della cultura, il tessuto pulito da femore e tibia con un bisturi e separato ginocchio. Tagliare ogni estremità delle ossa.
4. Lavare midollo osseo da ciascun osso utilizzando un ago 23G e una siringa da 1 ml riempito con media preparazione (fenolo aneritro DMEM / F12, siero di ratto 1%), in 50 ml vite tubo. Disrupt aggregati di cellule da delicatamente passaging attraverso il non 23Gedle e una siringa da 1 ml. Portare il volume totale di 25 ml di media preparazione.
5. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml Globulo rosso tampone Lysis rblc (8,3 g di NH _{4 Cl,} 1 g NaHCO _3, 1 ml di EDTA (100 mm), completo di 1 L con acqua distillata, filtrare 0,22 micron) in 15 ml di vite tubo. Incubare 30 sec su ghiaccio.
6. Aggiungere 10 ml di terreno preparato e centrifugare a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere in 2 ml di mezzo di preparazione.

2. neutrofili Arricchimento per selezione negativa

1. Aggiungere 150 ml di mouse cocktail neutrofili arricchimento (isolamento delle cellule kit piattaforma come EasySep). Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
2. Aggiungere 10 ml di fenolo DMEM rosso gratuito. Invertire una volta e centrifugare 250 xg, 3 min, 4 ° C.
3. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1,75 ml di media preparazione in 5 ml di polistirolo tubi tondi fondo. Aggiungere 250 microlitri Biotin Selezione Cocktail. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
4. Agitare le particelle magnetiche (dal kit piattaforma di isolamento delle cellule) per 30 secondi per risospendere le particelle. Aggiungere 500 microlitri di particelle magnetiche sospensione cellulare. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
5. Mettere la provetta a magnete. Attendere 3 minuti.
6. Invertire il magnete su un nuovo 5 ml polistirolo tubi tondi fondo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l'ultima goccia appeso nel tubo. Cellule indesiderate rimarranno nel tubo all'interno del magnete. Eliminare questo tubo in una rifiuti a rischio biologico.
7. Posizionare il nuovo tubo nel magnete. Attendere 3 minuti.
8. Invertire il magnete su un nuovo 15 ml vite tubo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l'ultima goccia appeso nel tubo.
9. Completa il volume a 5 ml con rosso fenolo DMEM gratuito.

3. Etichettatura dei neutrofili

1. Aggiungere 0,5 ml di un colorante arancione come il cellulare Tracker Orange (concentrazione di lavoro1 micron, CMRA - clorometil-rodol-acetato, magazzino 10 mM in DMSO). Incubare 2 min a 37 ° C.
2. Aggiungere 2,5 ml di terreno preparato. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
3. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di media preparazione in una provetta da 1,5 ml.
4. Prelevare un 'aliquota di contare con hematocytometer.
5. Incubare 5 minuti a 37 ° C. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
6. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di PBS. Centrifugare 250 xg, 5 min, 4 ° C per lavare.
7. Surnatante scarto. Risospendere il pellet come 10x10 ^{6 cellule per} 100 l di PBS. Tenere in ghiaccio fino a iniezione endovenosa. NOTA: cellule devono essere iv iniettato il più rapidamente possibile. 6-12x10 ⁶ neutrofili / mouse sono solitamente ottenuti.

4. Preparazione del mouse per intravitale Microscopia

NOTA:.. Fase 4.1) e 4.2) deve essere eseguita all'inizio dell'esperimento per evitare tempi di attesa prolungato di neutrofili etichettati sulla ice.

1. Pesare il CX ₃ CR1 topo ^GFP (8-12 settimana di vita).
2. Preparare 800 ml di anestetici (ketamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS).
3. Anestetizzare il mouse. Ip Iniezione con 200 microlitri / 20 g di mouse. Controllo anestesia da punta pizzicotti e controllando la frequenza respiratoria.
4. Iniettare neutrofili (10x10 ^{6 cellule} in 100 microlitri di PBS) per via endovenosa utilizzando le vene coda laterali o seno retro-orbitale, alla convenienza dello sperimentatore.
5. Ponga il mouse sul tappetino riscaldamento e proteggere gli occhi con il gel oculare.
6. Un coprioggetto di vetro (diametro 35 mm) viene messo in un piatto di coltura di tessuto 10 cm, che ha un foro di diametro 30 mm. Usare olio è di mantenere il piatto di coltura di tessuto a contatto con il coprioggetto.
7. Incidere la pelle addominale con le forbici per esporre il peritoneo. Incidere peritoneo con le forbici per esporre intestino.
8. Aggiungere 200 microlitri di PBS (preriscaldata a 37 ° C) in pcavità eritoneal. Prendete il mouse in mano e girare a faccia in giù, in modo che l'intestino esce dalla cavità peritoneale con una leggera pressione. Posizionare il mouse nel piatto coltura di tessuti.
9. Deroll delicatamente l'intestino con bastoncini di cotone sterilizzati sul vetrino, al fine di esporre i vasi mesenterici.
10. Tagliate fazzoletti di carta in bande e bagnarli con 37 ° C riscaldata PBS. Immobilizzare l'intestino con i pezzi di fazzoletti di carta per ridurre i movimenti risultanti dal peristalsi.
11. Mettere il piatto di coltura tissutale e il mouse all'interno della camera termostatata 37 ° C sul palco del vassoio su misura del microscopio invertito. Introdurre una siringa contenente anestetici sc nella zampa posteriore. NOTA: Inoltre, il mouse può ricevere ossigeno (0,5 L / min) con una maschera.
12. Il mouse di controllo per l'anestesia da punta pizzicare e il controllo della frequenza respiratoria ogni 30 min. Se necessario, fornire una spinta di anestetici (20 ml) per mantenere correttamente anestesia. NONE: Essiccamento della vascolarizzazione deve essere evitato. Pertanto, l'umidità è mantenuta bagnando regolarmente i fazzoletti di carta usati per immobilizzare l'intestino con 37 ° C-riscaldato PBS.

5. Misurazione dei neutrofili e monociti comportamento in recipienti infiammate In Vivo con intravitale Microscopia

1. Impostare laser per 488- 561- e alla potenza minima necessaria per evitare la fototossicità indotta da laser. Nei nostri esperimenti, è inferiore a 0,5%. Intensità di GFP in monociti e arancio tintura dei neutrofili è così intensa che di solito lo 0,3% è sufficiente. NOTA: Ciò rappresenta una potenza laser di 0.15 al 0.25 mW con il nostro sistema.
2. Acquisire immagini da 512 x 512 pixel (vale a dire, 635 micron) in 2.2 secondi con un foro stenopeico aperto con l'obiettivo 20X secco del microscopio invertito. Utilizzare un z-profondità compresa tra 10 e 20 micron, che garantisce un segnale sufficientemente con le potenze laser bassi.
   NOTA BENE: Di solito effettuare esperimenti con una z-profondità compresa tra 12 a 1656; m. Nel caso delle cifre presentate e film, la z-profondità è di 20 micron. Contrasto di fase permette l'identificazione di pareti endoteliali e di imaging viene eseguita su vene mesenteriche. Poiché le cellule pattugliano muovono molto lentamente con una velocità di 5-10 micron / ^min 6, la registrazione di un campo di interesse ogni 20 s è soddisfacente. Con le impostazioni descritte, la fase motorizzato consente di registrare fino a 7 campi di interesse allo stesso tempo.
3. Posizionare il mouse e vasi mesenterici nella camera del termostato del microscopio sono consentirne il recupero dalla preparazione per 30 minuti prima dell'acquisizione del primo film. Durante questo tempo, scegliere diversi campi di interesse. Focus sulla superficie luminale della nave vicina all'obiettivo. Se necessario, sfruttare la leggera auto-fluorescenza di endotelio per impostare la messa a fuoco.
   NOTA: La chirurgia durante la preparazione del mouse sottolinea leggermente l'endotelio. Di conseguenza, a rotazione dei neutrofili e/ o monociti possono essere osservati nei primi 15 minuti dopo la preparazione del mouse.
4. Registrare un primo film per 30 min a regime, una immagine ogni 20 secondi.
   NOTA: Il software acquisisce ogni campo di interesse per 2,2 secondi e lo stadio motorizzato si sposta automaticamente da un campo all'altro. Si ritorna alla prima posizione entro 20 secondi durante i 30 min del film registrazione.
5. Per avviare infiammazione dei vasi sanguigni, aggiungere una goccia di 20 l di PBS contenente 100 mg di TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 ¹² direttamente sui vasi imaged.
6. Controllare il punto di riferimento per ogni campo di interesse.
   NOTA: Nel corso di acquisizione, c'è sempre lievi modifiche di focalizzazione su asse z. Nonostante il 10-20 micron z-profondità, questo può provocare una diminuzione dell'intensità di fluorescenza. Pertanto, riorientare manualmente ogni campo di interesse alla fine di ogni film, se necessario. Film record per 30 min-periodi e fino a 3 ore aTal dopo l'inizio di infiammazione.
7. Alla fine dell'esperimento, sacrificare topo anestetizzato per dislocazione cervicale.

6. Generazione di file di film e tracciamento dei leucociti

NOTA: Il software di acquisizione Nikon genera .nd2 file, ma la seguente procedura sarà simile con altri software e marchi.

1. I file di esportazione come serie tiff.
2. Vai a software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importare la serie tiff. Ogni canale come un file diverso.
3. Applicare un filtro mediano con un raggio di 2.0 pixel per i canali verde e rosso per ridurre il rumore di fondo (di processo> Filtri> mediani ...).
4. Convertire i file in binario (Processo> Binary> Crea Binary). Attivare il software per calcolare la soglia per ogni immagine.
5. Unire i canali in un'unica serie di immagini (Immagine> Colore> Unisci canali ...). Selezionare i monociti del green canali, i neutrofili nel canale rosso e la luce trasmessa nel canale grigio.
6. Convertire immagini impilate in colori RGB (Immagine> Colore> Stack per RGB).
7. Salvare il file come .avi
8. I dati vengono importati e compilati nel software Imaris (Bitplane). Movimenti di monociti e neutrofili vengono poi monitorati tramite il tracking guidata Spot.

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Risultati

Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato in modo da controllarne il comportamento di monociti e neutrofili nelle vene mesenteriche di topi anestetizzati in tempo reale. L'uso di una camera 37 ° C-termostatato è obbligatoria per mantenere la temperatura del mouse e anche a causa della temperatura di circolazione dipendente leucociti. Preparazione del mouse viene visualizzato in Figura 1. La Figura 2 mostra tutta la zona visto al microscopio. Luce trasmessa permette l'i...

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Discussione

Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare in modo efficiente monociti e il comportamento dei neutrofili nelle vene mesenteriche in condizioni di stato e infiammatorie costante.

La fase cruciale della preparazione è l'immobilizzazione dell'intestino con tessuti PBS-bagnate. Se eseguita correttamente, vasi mesenterici sono ben esposti sul vetrino per l'acquisizione delle immagini. Ciò consente la selezione di vari campi di intere...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Immersion Oil Type A	Nikon		any viscous oil
Life Box Temperature Control System	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R confocal microscope	Nikon	A1R	inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS	Life Technologies	D8537
phenol red free DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitute in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100	TPP	93100