Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Riepilogo

Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani e produce livelli di peptide superiori e consente la valutazione della forma molecolare corretta. Pertanto, questo metodo sarà uno strumento prezioso nella ricerca del peptide.

Abstract

La ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Questo spesso include la misurazione dei peptidi che regolano l'assunzione di cibo. Per la corretta determinazione della concentrazione di un peptide, dovrebbe essere stabile durante il trattamento del sangue. Tuttavia, questo non è il caso di diversi peptidi che vengono rapidamente degradati da peptidasi endogene. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di trattamento del sangue che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution (RAPID) per l'utilizzo nei ratti. Qui, abbiamo stabilito questa tecnica per l'uso nell'uomo e indagato recupero, forma molecolare e circolanti concentrazione di cibo ormoni regolatori. Il metodo RAPID ha migliorato significativamente il recupero per ¹²⁵ I-marcato somatostatina-28 (+ 39%), glucagone-like peptide-1 (+ 35%), acile grelina e glucagone (+ 32%), l'insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) e peptide YY _3-36 (+ 19%) rispetto al trattamento standard (sangue EDTA su ghiaccio, p <0.001). cromatografia liquida ad alte prestazioni ha mostrato l'eluizione di endogena grelina acile nella posizione prevista dopo l'elaborazione RAPID, mentre dopo il trattamento standard di 62% di acil grelina sono stati degradato con conseguente un picco precedente probabile che rappresenta desacyl grelina. Dopo l'elaborazione del rapporto RAPID grelina acil / desacyl nel sangue di soggetti normali di peso è stato di 1: 3 rispetto al 01:23 dopo trattamento standard (p = 0,03). Anche i livelli endogeni Kisspeptin erano più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard (+ 99%, p = 0,02). Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani, produce peptide superiori e permette di valutare la forma molecolare corretta.

Introduzione

Alla luce della crescente diffusione in tutto il mondo di obesità ^1,2, la ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Mentre finora solo un peptide noto che perifericamente prodotta e azione centrale per stimolare l'assunzione di cibo, cioè grelina ^3, negli ultimi decenni, una vasta gamma di peptidi è stato identificato che riducono l'assunzione di cibo, ad es. leptina, peptide YY (PYY) ed anche glucagone-like peptide-1 (GLP-1) e insulina ^4, Pertanto, negli studi in meccanismi regolatori di livelli di fame e sazietà peptidici sono spesso valutata e, allo stesso tempo, si presume che il peptide studiato è stabile e recuperato con rese elevate durante la formazione del plasma. Spesso, tuttavia, questo non è il caso a causa della rapida composizione endogena come indicato in precedenza per es. grelina che viene degradata da acile a desacyl grelina ^5. Pertanto, abbiamo recentemente descritto il metodo rapido per proces sanguecantare in ratti che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution ^6. Questo metodo migliorato recupero per ⁶ 11 di 12 peptidi testati e consentiti per la determinazione della forma molecolare circolante corretta rispetto al trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio). Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi successivi ^7-12 per la rilevazione di grelina circolante e dal fattore di rilascio della corticotropina ^13. Pertanto, il metodo si è dimostrato utile per la ricerca peptide nei roditori. Tuttavia, dal momento che studi su roditori non sono sempre traducibili ad un'altra specie, il metodo deve essere stabilito per l'uso nel sangue umano pure.

Lo scopo del presente studio è stato quello di testare il metodo rapido per il trattamento del sangue negli esseri umani rispetto al trattamento del sangue normale, il sangue EDTA sul ghiaccio, che è ampiamente consigliata ¹⁴ e frequentemente used nel così come ambiente di ricerca clinica. Abbiamo testato il recupero di una selezione di ¹²⁵ peptidi I-etichettati coinvolti nella regolazione dell'assunzione di cibo tra cui peptidi stabiliti così come nuovi candidati recentemente suggerito di svolgere un ruolo nell'alimentare regolamento (effetti sulla assunzione di cibo sono riportati nella tabella 1) dopo la trasformazione con entrambi i metodi. Ormoni stati scelti anche rappresentare peptidi di lunghezza e di carica (Tabella 2) differente. Inoltre, per grelina abbiamo studiato la forma molecolare (s) seguendo il metodo standard e RAPID. Infine, abbiamo valutato la grelina endogena (acil e desacyl grelina), così come i livelli di kisspeptin, un peptide anche recentemente suggerito di svolgere un ruolo nella regolazione dell'assunzione di cibo ^15,16 seguente trasformazione RAPID o standard. Inoltre, abbiamo anche studiato questi livelli di peptide in una popolazione di soggetti con una vasta gamma di indice di massa corporea (che vanno 10,2-67,6 kg / m ²⁾ per studiare possibLe differenze relative al peso corporeo cronicamente alterato.

La diagnosi, valutazione, e Piano:
I partecipanti allo studio
Tutti i partecipanti allo studio sono stati recentemente pazienti ricoverati (inclusione era entro due giorni di ricovero in ospedale) della Divisione di Medicina Psicosomatica a Charité-Universitätsmedizin Berlino e ha dato consenso informato scritto. Per evitare qualsiasi impatto del genere solo pazienti di sesso femminile sono stati inclusi. Un totale di 42 soggetti hanno partecipato a questo studio e sono stati divisi in tre gruppi: peso normale (BMI 18,5-25 kg / m ^2, n = 12), anoressia nervosa (BMI <17,5 kg / m ^2, n = 15) e obesità (BMI> 30 kg / m ^2, n = 15). pazienti obesi Anorexic e sono statidiagnosticata secondo la classificazione internazionale delle malattie-10 e ricoverati in ospedale per l'aumento di peso (anoressia nervosa) o la riduzione del peso (obesità), rispettivamente. Tutti i pazienti di peso normale sono stati ricoverati esclusivamente a causa di sintomi somatoformi senza rilevanti disturbi somatici. Sono stati esclusi i pazienti con sintomi somatoformi gastrointestinali o una storia di chirurgia gastrointestinale. I criteri di esclusione comprendevano anche un'età <18 anni, gravidanza in corso e le malattie psicotiche non trattati. Il prelievo di sangue è stata eseguita il giorno 2 o 3 dopo il ricovero in ospedale prima del trattamento dietetico per aumentare o ridurre il peso corporeo, rispettivamente. parametri antropometrici sono stati valutati nello stesso giorno.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal comitato etico locale per la ricerca umana (numero di protocollo EA1 / 114/10).

Processing 1. Sangue

1. Raccogliere il sangue venoso 7:00-08:00 al mattino a digiuno da una vena e il processo avambraccio in base alla procedura standard o il metodo rapido. Istruire i soggetti di non esercitare o di fumo prima di prelievo di sangue.
2. Per l'elaborazione di serie, raccogliere il sangue in provette EDTA contenenti refrigerati e centrifugare entro 10 min a 3.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione con metodo radioimmunologico.
3. Per l'elaborazione RAPID, subito diluire il sangue (entro 1 minuto dopo il ritiro del sangue) 1:10 in tampone ghiacciato (pH 3.6) contenente 0,1 M di acetato di ammonio, 0,5 M NaCl ed enzimi inibitori (diprotin A, E-64-D, antidolorifica , leupeptina, Chymostatin, 1 mg / ml). Poi, centrifugare entro 10 min a 3000 xg per 10 min a 4 ° C raccogli noi surnatanteing una pipetta in tubi di polipropilene come dettagliato prima nei ratti ^6.
   1. cartucce cromatografia di carica (360 mg, 55-105 micron) con 100% di acetonitrile (tasso di 10 ml / min), equilibrare con 0,1% trifluoroacetato (TFA, tasso di 10 ml / min) e carico con il surnatante a una velocità costante di 1 ml / min utilizzando una pompa a siringa.
   2. Successivamente, lavare cartucce con 3 ml di 0,1% TFA (tasso di 10 ml / min) e lentamente eluire con 2 ml di 70% acetonitrile contenente 0,1% TFA (2 ml / min).
   3. campioni secchi eluiti mediante centrifugazione vuoto e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione da parte radioimmunoassay.
      NOTA: Esegue tutte le fasi in polipropilene (elaborazione RAPID) e borosilicato (radioimmunologico) tubi che presentano superficie significativamente inferiore proprietà vincolante e quindi ridurre al minimo la perdita di peptide per la maggior parte dei peptidi studiati prima del ^26.

2. Misure

NOTA: I passaggi in questa sezione deve essere effettuata in un laboratoriocertificato per lavorare con materiale radioattivo. Precauzioni standard per il lavoro con ¹²⁵ mi dovrebbe essere presa.

1. Recupero di marcata radioattivamente Peptidi
   1. Ottenere ¹²⁵ peptidi umani I-radioattivi (ad es. Acil-grelina, GLP-1, il glucagone, l'insulina, kisspeptin, leptina, nesfatin-1, PYY _3-36 e somatostatina-28).
   2. Mantenere peptidi in polvere fino dell'esperimento, poi appena diluito in 0,1% di acido acetico (~ 100.000 cpm per ml).
   3. Per il trattamento del sangue normale, subito dopo il prelievo di sangue in EDTA refrigerata contenente tubi, trasferire 1 ml di sangue in una provetta con 50 ml di radiomarcato contenente 3,000-6,000 cpm (contato direttamente prima dell'esperimento inizia).
   4. Per l'elaborazione RAPID, trasferire 1 ml di sangue di EDTA contenente sangue in una provetta contenente 9 ml di tampone RAPID (per la composizione vedi 1.3) e 500 microlitri radiomarcato contenente 30,000-60,000 cpm. A causa dell'uso diluizione 1:10 10 volte maggiori volumi di radiolabel per l'elaborazione RAPID.
   5. In seguito, i campioni di processo come descritto nei punti 1.2 a 1.3.2.
   6. Per gli esperimenti di recupero, fare i campioni non secchi per centrifugazione vuoto e non conservare a -80 ° C. Invece, valutare il recupero dei peptidi marcati radioattivamente subito dopo, utilizzando un contatore gamma.
   7. Misurare tutta surnatante in campioni standard, mentre in RAPID campioni analizzano 1/10 del volume totale di ottenere la comparabilità della quantità di radiomarcato utilizzato. Per la misurazione, trasferire il surnatante in tubi montaggio nel contatore gamma e valutare i conteggi per minuto
   8. Come standard 100%, utilizzare due campioni con 50 ml di ¹²⁵ peptide I-radiomarcato che non sono sottoposti ad elaborazione. Misurare allo stesso tempo con altri campioni come descritto in 2.1.7.
   9. Eseguire l'esperimento cinque a sei volte per ogni peptide.
2. Cromatografia liquida ad alte prestazioni di marcata radioattivamente grelina
   1. Prelevare il sangue in cEDTA hilled contenente tubi e trasferimento 1 ml di provette contenenti 200 ml grelina radiomarcato-acile contenente 15.000-20.000 cpm (contati direttamente prima dell'esperimento inizia).
   2. Per l'elaborazione RAPID, trasferire 1 ml di sangue in una provetta contenente 9 ml di tampone RAPID (per la composizione vedi 1.3) e 200 ml radiomarcato acile grelina contenente 15.000-20.000 cpm.
   3. In seguito, i campioni di processo come descritto nei punti 1.2 a 1.3.2.
   4. Per ulteriori analisi mediante HPLC in fase inversa, caricare direttamente i campioni su una colonna stabile legame C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,8 micron) equilibrata nel 17% acetonitrile in acqua (sia completato con 0,1% TFA).
   5. Dopo 5 minuti di equilibrio, usare un gradiente 17-40% acetonitrile per eluire il campione in 40 minuti (velocità di 1 ml / min).
   6. Raccogliere frazioni di 1 ml ogni minuto e analizzare la radioattività in un contatore gamma.
   7. In un esperimento separato, carico di 200 l radioattivo acile grelina contenente 15.000-20.000cpm sulla colonna direttamente ed eseguire HPLC come descritto nei punti 2.2.4 a 2.2.6.
3. radioimmunoassay
   1. Per radioimmunoassay, scongelare supernatanti congelati (Processing Standard) e aspirare la polvere secca (metodo rapido) a temperatura ambiente.
   2. Immediatamente prima radioimmunoassay, risospendere campioni Rapid Dry a doppia H ₂ O distillata in base al volume originale di plasma (500 microlitri).
   3. Valutare kisspeptin e totale (includendo sia desacyl e acile grelina), così come acile grelina come descritto in precedenza ^12,27 utilizzando radioimmunologici commerciali secondo i protocolli dei produttori. Utilizzare tubi borosilicato che consentono la formazione di pellet stabile.
      1. Il primo giorno, incubare i campioni con tampone e anticorpo primario (es. Anti-grelina) in diluizione fornite dal produttore per un periodo di 24 ore.
      2. Il secondo giorno, aggiungere il ¹²⁵ I tracciante (per esempio, ¹²⁵ I-grelina), voRTEX e incubare per un periodo di 24 ore.
      3. Il terzo giorno, aggiungere il reagente precipitante, vortex e incubare come raccomandato dal produttore. Poi, provette per centrifuga a 3000 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e contare la radioattività nel pellet utilizzando un contatore gamma
   4. Calcolare desacyl grelina come la differenza del totale grelina meno acile. Valutare il rapporto grelina acil / desacyl dividendo acile da desacyl grelina per ogni singolo campione.
   5. Elaborare tutti i campioni - se possibile - in un unico lotto per evitare la variabilità inter-saggio. La variabilità intra-saggio nel presente esperimento è stato <8% per kisspeptin, <7% per il totale e <9% per acile grelina.

3. Analisi statistica

1. Determinare la distribuzione dei dati utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).
2. Valutare le differenze tra i duegruppi di t-test. Valutare le differenze tra più gruppi di tutte le procedure a coppie multiple di confronto (Tukey di test post hoc) o ANOVA a due vie seguita da metodo Holm-Sidak.
3. Considerare p <0.05 significativa ed effettuare analisi utilizzando un programma di statistiche.

Risultati

Trattamento del sangue RAPID aumenta il rendimento di ¹²⁵ peptidi I-radiomarcato nel sangue umano rispetto al trattamento del sangue standard.
Dopo il trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio), il recupero dei peptidi radiomarcati era ~ 60% in 9/9 peptidi (che vanno dal 48-68%, Figura 1A - K). Trattamento rapido migliore la resa in tutte le ¹²⁵ peptidi I-etichettati, vale a dire la somatostatina-28 (+ 39%,

Discussione

Abbiamo segnalato in precedenza che il metodo rapido per il trattamento del sangue migliorato il recupero per 11/12 peptidi rispetto al trattamento del sangue standard per ratti ^6. Nel presente studio abbiamo dimostrato che questo metodo è anche adatto per l'uso nell'uomo. Dopo l'elaborazione RAPID, il recupero per 9 di 9 ¹²⁵ peptidi marcati I-testato è stato migliorato rispetto al trattamento del sangue standard (EDTA di sangue sul ghiaccio). Il miglioramento osservato variava 19-39%...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin	Millipore, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioactive
GLP-1	Millipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioactive
Glucagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioactive
Insulin	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioactive
Leptin	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioactive
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioactive
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioactive
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	Radioactive
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioactive
Total ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	Radioactive
Active ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioactive
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA	online download