Metodi per studiare Mrp4 contenenti complessi macromolecolari nel regolamento di Fibroblasto migrazione

Riepilogo

MRP4 regola varie ciclici eventi di segnalazione nucleotidi-dipendenti, tra cui un ruolo di recente chiarito nella migrazione cellulare. Descriviamo un approccio diretto, ma multiforme per svelare i bersagli molecolari a valle di MRP4 con conseguente identificazione di un interattoma MRP4 unico che gioca un ruolo chiave nella regolazione messa a punto della migrazione dei fibroblasti.

Abstract

multidrug resistance proteina 4 (MRP4) è un membro della famiglia ATP-binding cassette di trasportatori di membrana ed è un trasportatore di efflusso endogena di nucleotidi ciclici. Modulando la concentrazione intracellulare di nucleotidi ciclici, MRP4 in grado di regolare molteplici eventi cellulari nucleotide-dipendente ciclici, tra cui la migrazione delle cellule. In precedenza, abbiamo dimostrato che, in assenza di MRP4, cellule di fibroblasti contengono livelli più elevati di nucleotidi ciclici intracellulari e possono migrare velocemente. Per comprendere i meccanismi alla base di questo risultato, abbiamo adottato un approccio diretto ma multiforme. In primo luogo, abbiamo isolato potenziali complessi proteici interagenti di MRP4 da un sistema di celle MRP4 sovraespressione usando immunoprecipitazione seguita da spettrometria di massa. Dopo aver identificato le proteine ​​uniche nel interattoma MRP4, abbiamo utilizzato Ingenuity Pathway Analysis (IPA) per esplorare il ruolo di queste interazioni proteina-proteina nel contesto di trasduzione del segnale. Abbiamo chiarito il Poil ruolo ziale del complesso proteico MRP4 nella migrazione cellulare e identificato F-actina come un importante mediatore degli effetti della MRP4 sulla migrazione delle cellule. Questo studio ha anche sottolineato il ruolo di cAMP e cGMP come protagonisti i fenomeni migratori. Utilizzando ad alta contenuto di microscopia, abbiamo eseguito test cell-migrazione e osservato che l'effetto di MRP4 sulla migrazione dei fibroblasti è completamente abolita dalla rottura del citoscheletro o l'inibizione di cAMP-dipendente chinasi A (PKA). Per visualizzare segnalazione modulazioni in una cella migrazione in tempo reale, abbiamo utilizzato un sensore FRET-based per misurare l'attività PKA e trovato, la presenza di attività più polarizzata PKA in prossimità del bordo anteriore della migrazione Mrp4 ^{- / -} fibroblasti, rispetto al Mrp4 ^{+ / +} fibroblasti. Questo a sua volta aumenta la formazione di actina corticale e aumentato il processo di migrazione. Il nostro approccio consente di identificare le proteine ​​che agiscono a valle di MRP4 e ci fornisce un overvista del meccanismo coinvolto nella regolazione MRP4-dipendente della migrazione dei fibroblasti.

Introduzione

la migrazione delle cellule è un complicato processo multi-step. Studi hanno dimostrato che durante cellule migrazione sono polarizzati in salita e di discesa. Aderendo alla matrice extracellulare, il bordo anteriore fornisce la trazione necessaria per il corpo cellulare di andare avanti. Infine, le finali rilascia bordo attacchi posteriori e completa il ciclo di ^1,2 migrazione.

la polarizzazione delle cellule per la migrazione delle cellule efficiente è regolata dalla segregazione spaziale di segnalazione intracellulare. Cellular secondi messaggeri, come campo, mediano la compartimentazione degli eventi di segnalazione necessari per la messa a punto ^3,4 migrazione delle cellule direzionale. Accumuli preferenziali di cAMP e cAMP-dipendente chinasi attività PKA all'avanguardia giocano un ruolo chiave nella migrazione delle cellule direzionale ^5,6. Fosforilando piccole GTPasi come Ras legati substrato C3 tossina botulinica (Rac) e il controllo della divisione cellulare della proteina 42 omologo o Cdc42, PKA attiva actina-related protein 2/3 (Arp 2/3) all'avanguardia e induce la formazione di lamellipodi ^7-9. PKA fosforila anche un agente anti-capping, vasodilatatore stimolato fosfoproteina (VASP), regola in tal modo i cicli oscillatori di estensione della membrana e retrazione ^10,11.

Nelle cellule, i livelli di cAMP sono regolati da tre grandi processi: i) sintesi di ciclasi, ii) la degradazione da fosfodiesterasi, e iii) il trasporto da parte dei trasportatori di efflusso di membrana ^3. Multidrug proteina resistenza 4 (MRP4), un membro della ATP-binding cassette (ABC) famiglia di trasportatori di membrana, funziona come un trasportatore d'efflusso endogena di nucleotidi ciclici. Pertanto, MRP4 può regolare i livelli intracellulari di cAMP e cAMP-dipendente cellulare segnalazione ^11-13. Abbiamo precedentemente dimostrato che in Mrp4 ^{- / -,} fibroblasti contengono livelli relativamente elevati di nucleotidi ciclici e migrare più velocemente compared a Mrp4 ^{+ / + 14} fibroblasti. Abbiamo inoltre riportato un effetto bifasico di nucleotidi ciclici sulla migrazione dei fibroblasti. Sulla base di studi precedenti e la nostra scoperta che Mrp4 ^{- / -} fibroblasti contiene cAMP più polarizzata nel corso della migrazione, abbiamo ipotizzato che questo regolamento MRP4-mediata della migrazione dei fibroblasti è cAMP dipendente. Al fine di comprendere il meccanismo a valle, abbiamo preso un approccio diretto ma multiforme.

Per identificare le proteine ​​associate e in interazione con MRP4, abbiamo immunoprecipitati MRP4 contenenti complessi macromolecolari a partire da cellule HEK293 che oltre esprimono MRP4. Utilizzando la spettrometria di massa, abbiamo identificato più proteine ​​MRP4 interagenti e analizzato la loro interconnettività con Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA è uno strumento utile per analizzare le interazioni proteina-proteina (sia strutturali e funzionali) ed esplorare il loro contributo, in particolare, fisiologica e patologicaeventi in base alla letteratura e evidenze sperimentali ^15,16. IPA indicato che F-actina è un obiettivo importante valle MRP4 nel contesto della migrazione cellulare dove cAMP e cGMP sono la chiave molecole di segnalazione ^17. Questi dati sono stati ulteriormente confermati mediante microscopia ad alta contenuto. -Alto contenuto di microscopia in grado di catturare e analizzare i comportamenti delle cellule, come la migrazione delle cellule in un più comodo, preciso e high-throughput modo ^18. I dati ad alto contenuto di microscopia dimostrato che l'effetto di MRP4 sulla migrazione dei fibroblasti è completamente abolita in perturbazioni del citoscheletro actina o inibizione della PKA ^17.

Inoltre, abbiamo usato un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di sensore PKA di monitorare le dinamiche PKA nella migrazione delle cellule in tempo reale. I sensori chinasi FRET-based di solito consistono in specifici peptidi substrato di fosforilazione affiancato da PCP e fluorofori YFP ^19-21. pmAKAR3 è un migliorato e mimbrane mirato sensore PKA FRET-based che contiene dominio forkhead-associato 1 (FHA1) e la sequenza PKA substrato LRRATLVD ^5,22. La fosforilazione di pmAKAR3 dalle PKA aumenta subunità catalitica FRET segnale tra CFP e YFP ^19. Inserimento di un dominio modifica lipidi nel sensore rivolge alla membrana plasmatica di monitoraggio dinamiche PKA, specificamente al vano membrana ^23.

Utilizzando pmAKAR3, abbiamo dimostrato che il bordo iniziale della migrazione Mrp4 ^{- / -} fibroblasti esposti più polarizzata attività PKA di Mrp4 ^{+ / +} fibroblasti, che a loro volta aumentano la formazione actina corticale a bordo di entrata della cella ^17. Insieme, questi eventi comportato una migliore polarizzazione cellulare e la migrazione delle cellule più veloce direzionale in assenza di MRP4. Il nostro approccio specifico e diretto identificato bersagli a valle chiave per MRP4 e fornisce un importante, ma comedell'ennesima meccanismo di inesplorato per la regolazione MRP4-dipendente della migrazione dei fibroblasti.

Protocollo

1. Ingenuity Pathway Analysis

1. Caricamento Protein-interattoma Dataset
   1. Inserire le proteine ​​/ geni di interesse in un foglio di calcolo con i loro identificatori univoci gene (preferibilmente simboli dei geni e numeri identificativi gene come ottenuti con dati di spettrometria di massa).
   2. Assegnare una colonna nel foglio di calcolo per il numero di identificazione del gene e una colonna per il valore di osservazione (ad es., Fold-modifica o p-value). Selezionare l'opzione 'contiene un'intestazione di colonna' per visualizzare le intestazioni delle colonne.
   3. Carica il set di dati su IPA facendo clic sulla scheda di upload di dati e selezionare il foglio di calcolo di cui sopra. Scegliere la scheda formato flessibile, e selezionare la categoria appropriata di identificazione del gene.
      Nota: un formato flessibile del set di dati supera le specifiche di formattazione per il caricamento.
   4. Dopo la visualizzazione del set di dati, selezionare ID e di osservazione colonne. Assicurarsi che tutte le proteine ​​(MRP4 interattoma come identificato da mass-spectrometry) vengono mappati controllando nella scheda Riepilogo dati. L'insieme di dati è ora pronto per l'analisi desiderata.
2. Analisi dei dati
   Nota: Descritto sono gli usi parziali di funzioni IPA che sono stati utilizzati per questo studio.
   1. Dopo aver caricato MRP4 interattoma con i loro nomi di geni come gli identificatori univoci, cliccare su nuovo e scegliere l'analisi di base nel menu in alto a sinistra del software IPA.
   2. Impostare il valore cutoff espressione per l'intensità in funzione del tipo esperimento (valore Intensità 100 è raccomandato per l'analisi).
   3. Calcolare la piega-cambiamento di espressione durante la preparazione del set di dati se le condizioni di controllo e sperimentali sono coinvolti e comprendono come parte del file di dati se un'analisi confronto deve essere eseguita (un valore di cut-off di 1,5 fold change è di solito raccomandato per l'analisi ).
      Nota: Dopo il completamento dell'analisi nucleo, più sezioni di analisi possono essere ottenuti. La prima scheda mostra la sintesi di ThE Totale analisi e suggerisce percorsi migliori canoniche, le autorità di regolamentazione a monte, le funzioni molecolari e cellulari e reti tra gli altri; tutti calcolati sulla base del livello di confidenza (valore p) e disposti in ordine crescente di valore di p.
   4. Aprire le principali vie canoniche (utilizzando l'opzione di percorso aperto) come grandi reti molecolari che mostrano pittoricamente croce parlante, sovrapposizioni, e colpiti vie di segnalazione.
      Guarda l'elenco dei percorsi canonici che sono majorly coinvolto basa sul valore p (p <0.05 è considerato come significativo).
      Nota: I valori di significatività per le vie canoniche sono calcolati con il test esatto di Fisher destro dalla coda. Il significato indica la probabilità di associazione di molecole dal set di dati con la via canonica solo per caso a caso.
   5. Confermare le proteine ​​di ingresso (MRP4 interattoma identificata mediante spettrometria di massa) nella lista dei proteine ​​coinvolte in ogni percorso.
      Nota: L'utilizzo di questo option, è stato osservato che la rete cellulare citoscheletro actina segnalazione è la principale via colpite e come le proteine ​​di ingresso inseriscono in esso (Figura 1). Questo approccio consente di identificare quali reti molecolari sarebbero strettamente associate e influenzati dalle proteine ​​di prova.
   6. Utilizzare la scheda di rete nelle analisi per identificare le malattie top e le funzioni che sono potenzialmente legati ad una particolare rete di proteine ​​in base al numero di molecole di messa a fuoco.
      Nota: un valore di punteggio viene dato sulla base delle proteine ​​note che sono determinati come parte di una rete ad esempio, assemblaggio cellulare e rete di organizzazione, attraverso la conoscenza della letteratura e evidenze sperimentali e mettere a fuoco le molecole che sono identificati dal set di dati e diventare parte della rete. . D'ora in poi, la rete viene filtrata in primo luogo in base al numero di molecole di messa a fuoco.

2. Alta contenuti Microscopia

1. Preparazione di cellule
   Nota: Tutti i lavori coltura cellulare è stato fatto sotto il cofano coltura cellulare orizzontale-flow.
   1. Utilizzare 96 pozzetti per il saggio di guarigione.
   2. Coat la micropiastra con soluzione fibronectina 1% (ricostituito in PBS), e mantenere la lastra in una serie CO ₂ incubatore a 37 ° C per 2 ore.
   3. Rimuovere Mrp4 ^{- / -} e Mrp4 ^{+ / +} topo fibroblasti embrionali (MEF) coltivate in 25 cm² fiasche di coltura cellulare dal incubatore, lavare 1 volta con PBS, e trypsinize le cellule per 5 minuti usando 1 ml di 4x soluzione tripsina-EDTA.
   4. Lavare le cellule con mezzo completo (DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina) e risospendere in 5 ml di mezzo completo.
   5. Aspirare la soluzione fibronectina dai pozzetti. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 30.000 celle (numero di cellulare deve essere ottimizzato in base al tipo di cellule) in tutti i pozzetti.
   6. Crescere le cellule a 100% di confluenza in uno standardCO ₂ incubatore a 37 ° C per 24 ore.
2. Creazione di ferita
   1. Assicurarsi che tutti i pozzetti vengono riempiti con la soluzione. Riempire i pozzetti non utilizzati con PBS per evitare di danneggiare lo strumento ferita facendo (ad es., WoundMaker).
   2. Dopo aver confermato confluenza delle cellule 100%, posizionare la piastra a 96 pozzetti all'interno dello strumento ferita fare sulla piastra di base in metallo e premere il somiere a 96 pozzetti verso il basso.
   3. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere tutte le cellule sloggiato e aggiungere 100 ml di terreno completo.
   4. Aggiungere i composti di prova - H-89 (50 micron; 1: 1000 diluizione con mezzi completi utilizzando 50 mM magazzino in DMSO) o Latrunculin B (1 mM, 1: 1000 diluizione con completo supporto utilizzando 1 mM magazzino in DMSO), in questa fase .
   5. Posizionare la piastra di dosaggio all'interno del lettore a 37 ° C e monitorare la migrazione nel periodo sperimentale.
3. Migrazione di monitoraggio delle cellule
   Nota: la migrazione delle cellule è stata monitorata utilizzando il microscopio e software provided con il sistema di microscopia ad alta contenuto. L'uso di 96 pozzetti assicura che le ferite sono monitorati automaticamente dal microscopio e registrati dal software.
   1. Impostare il software per la scansione piastra test ogni ora per test di migrazione utilizzando la scheda di scansione programma. Selezionare un orario di inizio di almeno 15 minuti dopo aver posizionato la piastra saggio all'interno del lettore per consentire il raggiungimento dell'equilibrio prima imaging.
   2. Selezionare il vassoio e scegliere il tipo di imbarcazione (96 pozzetti micropiastra) e il tipo di esperimento (Scratch Wound).
   3. Selezionare obiettivo 10X e scegliere i parametri di imaging a contrasto di fase. Selezionare i pozzi che devono essere a scansione utilizzando l'opzione di modifica esplorazione del modello.
   4. Specificare i gruppi di trattamenti e le eventuali repliche selezionando la scheda proprietà e la creazione di una mappa piatto. La scansione può essere interrotto in qualsiasi momento in base alle condizioni sperimentali.
4. Analisi dei dati
   1. Dopo la scansione viene eseguita, selezionare la scheda vaso vista per la piastra saggio. solo per i programmi di utilità del lavoro di analisi e selezionare lancio lavoro nuova analisi.
   2. Set temporaneo ferita come tipo di lavoro e selezionare l'intervallo di tempo per l'analisi (0 punto di tempo a punto a 24 ore).
   3. Selezionare i pozzi di essere scelti per l'analisi con un solo clic sul bene e fare clic su 'OK' per avviare l'analisi. Una volta che l'analisi viene fatta, visualizzare graficamente i dati densità relativa ferita (RWD) per ogni bene a ogni punto di tempo utilizzando l'esportazione verso l'opzione del grafico.
   4. Visualizza il contrasto di fase immagine insieme di tutti i pozzetti corrispondenti a diversi punti temporali utilizzando la scheda immagine vista. Selezionare un ben specifica facendo clic sulla mappa piatto, selezionare un punto di tempo specifico dalla scheda periodo e fare clic sulla scheda vedi immagine.

3. trasferimento di energia per risonanza (FRET)

1. Preparazione di cellule
   1. Coat 35 mm piatti di vetro a fondo con 100 ml di soluzione di fibronectina 1% (come descritto nella sezione 2.1) e tenerli inuno standard CO ₂ incubatore a 37 ° C per 2 ore.
   2. Aspirare la soluzione fibronectina dalle piastre e semi di un numero uguale di cellule HEK293 (10.000 cellule / piastra) in terreno completo.
   3. Far crescere le cellule a 60-70% di confluenza nei piatti fondo di vetro rivestite di fibronectina in uno standard CO ₂ incubatore a 37 ° C per 24 ore.
2. trasfezione
   1. Eseguire tutte le trasfezioni transienti con un reagente di trasfezione commerciale secondo le istruzioni del produttore.
   2. Aliquota 250 ml di terreno completo in due provette da 1,5 ml per centrifuga sterili separati per ogni piatto da 35 mm.
   3. Aggiungere 2 ug di DNA (pmAKAR3 o pmAKAR3-TA) in una provetta e 5 microlitri (2,5 volte la concentrazione di DNA) di reagente di trasfezione in un altro tubo.
   4. Incubare le provette per 20 min a temperatura ambiente e poi trasferire il DNA diluito nel tubo reagente contenente trasfezione.
   5. Mescolare bene e incubare a 37° C per altri 30 min.
   6. Aspirare il mezzo di fuori delle cellule e lavare una volta con PBS. Aggiungere 1 ml di DMEM senza antibiotico F-12 terreno contenente 10% FBS alle cellule.
   7. Aggiungere 507 pl di coniugato DNA-lipidi con media per le cellule in ciascuna piastra, miscelare delicatamente, e conservare in incubatore CO ₂ a 37 ° C per 48 ore. Utilizzare 2 mg di DNA (1 mg / mL magazzino) e 5 ml di lipidi per 10.000-50.000 cellule in ogni piatto.
3. Live-cell imaging
   1. Dopo 48 ore di trasfezione, togliere terreno di coltura e lavare le cellule 2 volte con Balanced soluzione salina di Hank (HBSS, pre-riscaldato a 37 ° C). Aggiungere un volume finale di 1,9 ml HBSS alle cellule lavate e montare su un sistema di microscopia a grande campo invertito per l'imaging FRET all'interno di una misura 37 ° C camera mantenuta.
      Nota: In questo sistema, la luce di eccitazione è fornita da una lampada da 300 W Xenon attenuata con un filtro neutro con il 50% di luce transmissionico.
   2. Utilizzare obiettivo 60X. concentrarsi manualmente sulle cellule e impostare un campo ottimale visivo usando il microscopio. Attivare il campo selezionato di vista sullo schermo del computer utilizzando l'opzione di messa a fuoco "F" sul software. Per l'esecuzione di misure tasto, selezionare il set corretto del filtro (filtro CFP / YFP set con un filtro di eccitazione 430/25 nm, un doppio divisore di fascio dicroico, e due filtri di emissione (470/30 nm per PCP e 535/30 nm per FRET) manualmente.
   3. Visualizza fluorescenza aver prima consultato l'opzione canale di CFP / YFP / FRET seguito facendo clic sulla scheda Fluor aperto. Migliorare l'intensità del segnale utilizzando lo strumento intensificazione nella scheda della fotocamera.
   4. Seleziona cellule esprimenti pmAKAR3 o pmAKAR3-TA evitando saturazione del intensità del segnale. Utilizzare la finestra di acquisizione per avviare la misurazione FRET.
   5. Selezionare l'opzione di time-lapse e impostare un tempo di scansione per 30 minuti con intervallo di 30 sec. Selezionare l'opzione tasto e impostare il tempo di esposizione a 100 msec. Inserire il un'etichetta immagined premere start per avviare la misurazione.
   6. Dopo cinque punti di tempo e una linea di base, aggiungere 25 mM di forskolina (5 ml di 10 mM magazzino in etanolo, diluita con 100 ml di HBSS) alle cellule senza disturbare la piastra e monitorare le cellule per un totale di 30 min.
4. Analisi dei dati
   Nota: utilizzare il modulo di calcolo raziometriche per l'analisi dei dati.
   1. Fare clic sullo strumento di selezione sul lato sinistro della finestra dell'immagine e scegliere un rettangolo dal menu a discesa. Trascinare il rettangolo sul campo di immagine in una zona di libero cellulare e fare clic destro su di esso per impostarla come sfondo allo scopo di sottrazione del fondo.
   2. Vai alla maschera e utilizzare 'creare una nuova maschera' opzione. Vai allo strumento di selezione e scegliere una penna dal menu a tendina per disegnare manualmente una maschera intorno alla cella per selezionarla per una misurazione. Selezionare almeno 4-6 cellule per condizione.
   3. Selezionare la scheda maschera ed eseguire statistiche maschera.
   4. Controllare 'intera maschera', espandere l'opzione cross-channel e selezionare donatore FRET normalizzato (N-FRET) (FRET / CFP). Il valore di N-FRET è rappresentativo di attività PKA a livello della membrana plasmatica.
   5. Aggiungere timestamp, look-up table e la scala a barre utilizzando le annotazioni.

Risultati

Per studiare l'effetto di MRP4 sulla migrazione dei fibroblasti, abbiamo usato un saggio di guarigione utilizzando alto contenuto microscopio ^14. Ferite precise sono state effettuate su monostrati confluenti di MEF isolati da entrambi Mrp4 ^{- / -} o Mrp4 ^{+ / +} mice, e le immagini sono state prese a intervalli di 1 h per 24 h. Abbiamo osservato un tasso di migrazione più elevato per Mrp4 ^{- / -}<...

Discussione

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing^1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis^24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.

Using high-content microscopy¹⁸, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen(Carlsbad, CA)	11668-027
DMEM	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock microplates	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	L5288	Stock in DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)	BML-EI196	Stock in DMSO
35 mm glass-bottomed dishes	(MatTek Corporation; Ashland, MA)	P35G-1.5-20-C
Fibronectin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media	Invitrogen (Carlsbad, CA)	31985-088
FRET microscopy system	Olympus inverted microscope (IX51)
CCD camera	Hamamatsu, Japan	ORCA285
SlideBook software 5.5	Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software	IPA, QIAGEN Redwood City,
Forskolin	Tocris (Ellisville, MO).	1099	Stock in 100% EtOH
DMEM F-12	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11330-057
HBSS	Invitrogen (Carlsbad, CA)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(Carlsbad, CA)	10010-023
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Invitrogen(Carlsbad, CA)	R-001-100
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen(Carlsbad, CA)	15140-122