La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Riepilogo

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

Abstract

La prova aumentante indica che ematopoiesi normale è regolata da stimoli microambientali distinti in BM, sono specializzati nicchie cellulare modulazione critica di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni^1,2. Infatti, un quadro più dettagliato del microambiente ematopoietico ora sta emergendo, in cui l'endostali e le nicchie endoteliali formano unità funzionali per la regolazione del normale HSC e loro progenie^3,4,5 . Nuovi studi hanno rivelato l'importanza delle cellule perivascolari, adipociti e cellule neuronali nel mantenimento e regolamentare HSC funzione^6,7,8. Inoltre, c'è prova che le cellule da stirpi differenti, vale a dire le cellule mieloidi e linfoidi, casa e risiede in nicchie specifiche all'interno del microambiente di BM. Tuttavia, una mappatura completa del microambiente BM e dei suoi occupanti è ancora in corso.

Diversi ceppi di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti specifico lignaggio o topi geneticamente per mancanza di molecole selezionate in specifiche cellule della nicchia BM sono ora disponibili. Knock-out e lignaggio rilevamento modelli, in combinazione con approcci di trapianto, offrono la possibilità di perfezionare le conoscenze sul ruolo di specifici "di nicchia" cellule per popolazioni ematopoietiche definite, ad esempio HSC, B-cellule, cellule T, cellule mieloidi e cellule eritroidi. Questa strategia può essere ulteriormente rafforzata unendo l'uso di microscopia del due-fotone del calvarium. Fornendo in vivo imaging ad alta risoluzione e rendering 3D del calvarium BM, possiamo ora determinare precisamente la posizione dove specifici sottoinsiemi ematopoietiche home in BM e valutare la cinetica della loro espansione nel corso del tempo. Qui, Lys-GFP topi transgenici (marcatura cellule mieloidi)⁹ e RBPJ topi knock-out (carente canonico tacca di segnalazione)¹⁰ sono utilizzati in combinazione con IVFM per determinare l'attecchimento di cellule mieloidi ad un microambiente BM difettoso di tacca.

Introduzione

Microscopia di fluorescenza multifotonica videomicroscopia (IVFM) è una potente tecnica di imaging che permette ad alta risoluzione, in tempo reale immagini di tessuti con profondità fino a 1mm, a seconda del tessuto. Quando applicato al calvarium del mouse, permette di osservare il comportamento delle cellule ematopoietiche all'interno il BM in maniera non invasiva fino a 60-100 μm¹¹. Questo approccio è usato qui per determinare la cinetica di attecchimento dei progenitori mieloidi normali nei topi knock-out BM di RBPJ carente canonico tacca di segnalazione.

Recenti lavori del nostro gruppo ha dimostrato quello difettoso canonico tacca di segnalazione nel BM microambiente porta a una malattia mieloproliferativa simil-¹². Perdita della tacca di segnalazione è stata ottenuta tramite l'omissione condizionale del dominio obbligatorio del DNA di RBPJ, il fattore di trascrizione critica a valle del canonico tacca di segnalazione, utilizzando Mx1-Cre indotto ricombinazione¹⁰. In questo studio, è stato utilizzato il modello di topi^lox/lox Mx1-Cre/RBPJ. Eliminazione condizionale del motivo DNA-legante di RBPJ provoca la perdita del segnale da tutti i recettori di tacca. Nel modello Mx1-Cre, Cre espressione è guidata dal promotore Mx1 attivato in seguito a somministrazione di polyI:C con conseguente induzione di delezione genica mirata nelle cellule di sangue così come componenti stromal degli organi multipli, compreso BM, milza e fegato.

MX1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox e Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox topi indotti con polyI:C (hereon indicato come RBPJKO e RBPJWT, rispettivamente) sono stati irradiati letalmente e trapiantati con cellule ematopoietiche normali, wild-type. A partire dalla settimana 4 dopo il trapianto, i destinatari RBPJKO sviluppato la leucocitosi significativa seguita da splenomegalia. Anche se topi RBPJKO presentato percentuale aumentata dei progenitori mieloidi in BM alla settimana 8 dopo trapianto e intervalli di tempo più tardi, analisi di BM alle settimane 4 e 6 non ha rivelato differenze evidenti nel loro contenuto delle cellule mieloidi rispetto al controllo RBPJWT destinatari. Questa osservazione, insieme al fatto che Mx1-Cre è espresso in diversi organi ematopoietici, ha sollevato la questione se il microambiente BM avuto impatto diretto sull'inizio del fenotipo mieloproliferativa.

Per stabilire se il BM è un sito critico iniziale di sviluppo della malattia, IVFM del calvarium del mouse è stato usato in combinazione con BM trapianto (BMT), il modello knock-out RBPJ e un sistema di tracciamento di lignaggio. Topi transgenici che esprimono EGFP sotto il controllo del promotore (Lys-GFP) lisozima specifico⁹ sono stati utilizzati per ottenere le cellule erogarici che potrebbero essere visualizzate durante BM imaging dopo BMT. Espressione di lisozima è specifico di cellule mieloidi e Lys-GFP segna celle dal comune progenitore mieloide (CMP) per i granulociti maturi¹³.

IVFM del BM in diversi momenti ha dimostrato che cellule di Lys-GFP homed similmente ai destinatari BM di RBPJWT e RBPJKO, ma ampliato e innestate più velocemente nei destinatari del BM di RBPJKO. Questa differenza era drammatica al punto precedente di tempo (settimana 2) ed è diminuito nel tempo (settimane 4 e 6). Tuttavia, questi intervalli di tempo più tardi, valutazione del compartimento ematopoietico in stesso destinatario ha mostrato un aumento costante del numero di cellule mieloidi circolanti nel PB e localizzato nella milza dei topi RBPJKO, che indica un'uscita aumentata delle cellule da BM nella circolazione. Analisi della localizzazione di cellule Lys-GFP in BM di topi trapiantati a 6 settimane ha rivelato che le cellule mieloidi risiedevano più lontano del sistema vascolare nel microambiente RBPJKO che nel controllo.

Collettivamente, la combinazione di IVFM con questi specifici modelli animali fornito le comprensioni nella dinamica attecchimento delle cellule mieloidi nel microambiente RBPJKO BM. Il disegno sperimentale e l'approccio quantitativo descritto qui è proposto come un paradigma che possa essere applicato per affrontare simili questioni. Ad esempio, può consentire l'uso di altri stirpe specifico cellulare rilevamento modelli, ad esempio RAG1-GFP¹⁴ o Gata1-GFP¹⁵ topi, seguendo il comportamento di linfoide o progenitori eritroidi, rispettivamente, in BM.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state effettuate con l'autorizzazione della cura degli animali e utilizzare Comitato di Indiana University School of Medicine. Assicurarsi di rispettare la legislazione sulla sperimentazione animale del paese dove il lavoro viene eseguito.

1. preparazione del Mx1CreRBPJ^{- / -} Mice destinatario

1. Cross Mx1-Cre⁺ topi con RBPJ^lox/lox topi¹⁰ per ottenere Mx1-Crepositivo ^RBPJlox/lox topi¹² e Mx1-Cre negative littermates^lox/lox RBPJ da utilizzare come controlli. Verificare il genotipo di PCR¹⁰.
2. Utilizzare 6-8 settimana-vecchio Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox e Mx1Cre topi di^lox/lox /RBPJ^–per eseguire l'induzione di polyI:C.
3. Iniettare polyI:C 200 µ g i.p. in Cre⁺ e Cre^– topi. Dare una iniezione di polyI:C ogni altro giorno per 3 giorni la settimana prima. Dare una iniezione di polyI:C la seconda settimana, 7 giorni dopo l'iniezione precedente (quattro iniezioni in totale).
   1. Utilizzare RBPJKO (indotta Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox) e RBPJWT (indotta Mx1Cre^–/RBPJ^lox/lox) topi come destinatari 3 settimane dopo l'ultima iniezione di polyI:C.
      Nota: Si consiglia di utilizzare topi indotti dal pI: pC 3 settimane dopo l'iniezione. La risposta IFNα innescata da polyI:C induce cambiamenti significativi in BM, conseguente l'espansione di immunophenotypic di HSC e diminuito output di progenitori maturi nel sangue periferico^16,17. Rappresentazione dei sottoinsiemi ematopoietici è normalizzato a 3 settimane dopo l'iniezione e i topi possono essere utilizzati senza gli effetti confondenti di infiammazione. Questo protocollo di induzione è stato ottimizzato per RBPJ. Se l'eliminazione di un gene differente, il protocollo di induzione può variare a seconda del costrutto, e cancellazione dovrà essere convalidati. Abbiamo validato ~ 100% omissione della regione RBPJ tra i siti loxP mediante RT-PCR dopo un totale di quattro iniezioni di polyI:C.

2. preparazione di cellule del midollo osseo di Lys-EGFP donatore per trapianto

1. Eutanasia di un mouse di Lys-EGFP (anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale) 1 o 2 h prima del trapianto.
2. Spruzzare la superficie del corpo animale con etanolo al 70%.
3. Utilizzare forbici chirurgiche per effettuare un'incisione della pelle su entrambe le gambe intorno alla caviglia e con pinze chirurgiche tirare via pelle e pelliccia insieme per esporre il tessuto muscolare pulita.
4. Utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere come muscolo molto dalle gambe come possibile. Utilizzando un paio di forbici, tagliare le ossa (presso il ginocchio e della caviglia) e pulire qualsiasi residuo tessuto muscolare dai femori e le tibie utilizzando spugne garza. Inserire le ossa (due femori e due tibie) in una piastra a 6 pozzetti contenenti DMEM 10% FBS.
5. Schiacciare le ossa in un mortaio con 10 mL di EDTA PBS al freddo 2mM e dispensare le cellule del midollo osseo per portare le cellule in sospensione unicellulare. Alternativamente, svuotare le ossa con tempi di 2 mM EDTA PBS 3 da ogni lato con una siringa da 1 mL.
6. Filtrare le cellule del midollo osseo utilizzando un filtro da 70 µm in una provetta da centrifuga da 15 mL. Risciacquare il filtro con 2-3 mL di PBS. Le celle in basso 10 min a 460 x g di spin, risospendere le cellule in 10 mL di fresco DMEM 10% FBS.
7. Contare le celle del midollo osseo su un emocitometro e regolare la concentrazione a 1,5 x 10⁷ cellule/mL in IMDM senza siero. Utilizzare 3 x 10⁶ cellule per animali con un volume di 200 µ l. Cellule di circa 1/3 del totale BM sono GFP + cellule mieloidi. Lasciare le cellule su ghiaccio fino a che pronto per l'iniezione. Utilizzare 0,5 x 10⁵ celle per determinare l'espressione di GFP di FACS⁹.

3. midollo osseo trapianto di cellule di Lys-GFP in topi RBPJKO

1. Trattenere il destinatari topi in una gabbia di torta. Irradiare topi con una dose letale di radiazione gamma (1.200 Rad) su un irradiatore di Cs 137. Utilizzare un protocollo di dose di Spalato: 900 rads la sera seguita da 300 rads la mattina successiva (16h apart).
2. Trapiantare i topi irradiati letalmente di destinatario RBPJWT e RBPJKO 5-6 h dopo la seconda dose di radiazione. BM di iniettare cellule ottenute da topi di Lys-EGFP ad una concentrazione di 3 x 10⁶ cellule per animali tramite iniezione della vena della coda (Vedi dettagli per la raccolta delle cellule nella sezione 2).
3. Immagine indipendente coorti di topi trapiantati da IVFM in diversi momenti: 24 h ed alle settimane 2, 4 e 6, come descritto di seguito (vedere paragrafo 4 & 5 per in vivo imaging procedura).

4. preparazione chirurgica per l'Imaging di videomicroscopia

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici. Due bei forcipe (uno dritto, uno ad angolo), un paio di forbici bene e un paio di Portaghi. Preparare area operativa con tutte le forniture necessarie per la procedura.
2. Dare il mouse un'iniezione di IP di ketamina anestetico cocktail (xilazina 2.5-5 mg/kg + acepromazina 1.0-2.5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) utilizzando una siringa ago 26-28 G.  Animale sarà monitorati ogni 15 minuti durante la procedura e anestetico si aggiungeranno come necessario a ¼ della dose originale.
3. Posizionare il mouse su una fonte di calore adeguata (37 ° C riscaldamento pad, animale protetto dal contatto diretto con il rilievo di riscaldamento) e monitorare visivamente la frequenza respiratoria.
4. Controllare i riflessi usando la punta pizzico risposta. Garantire che l'animale è completamente sotto anestesia prima di iniziare qualsiasi procedure chirurgiche.
5. Uso un 26-28 calibro ago siringa per dare topi un'iniezione della vena della coda di un marcatore fluorescente vascolare (destrano, 100 μL di soluzione di 20 mg/mL).
6. Applicare unguento oculare IFP in entrambi gli occhi. Clip della superficie dorsale della testa dell'animale con piccoli tagliatori elettrici. Applicare una crema depilatoria per 5 min. utilizzare spugne garza rimuovere la crema e poi sciacquare con soluzione fisiologica. Preparare il cuoio capelluto pulito con alcol al 70% con un batuffolo di cotone.
7. Utilizzare una pinzetta e forbice per fare un'incisione della pelle del midline piccole (10-20 mm) sul cuoio capelluto per esporre la superficie dorsale teschio sottostante. Utilizzare seta chirurgica 5-0 per due soggiorno suture in pelle su ogni lato dell'incisione, creazione di un lembo per esporre la volta cranica per l'imaging.
8. Posizionare i mouse sulla loro schiena e immergere il cuoio capelluto esposto in un piatto fondo di vetro riempito con olio di microscopio. Trasportare l'animale a mutiphoton camera di imaging.
9. Metti l'animale sul palco microscopio con calvarium posizionato sul piatto di vetro sopra l'obiettivo e poi coprire con un 37rilievo di riscaldamento ° C (l'animale deve essere protetto dal contatto diretto con il calore).

5. in Vivo Imaging ad alta risoluzione del Calvarium Mouse

1. Utilizzare un sistema confocale invertito modificato per l'imaging multiphoton (Vedi materiali tavolo). Seguenti istruzioni sintonizzare un laser 2-fotone a 830 nm, posto a 20 W X, NA 0.95 lente obiettiva nel nasello di microscopio e controllare l'allineamento del fascio laser.
   Nota: Sistemi di microscopio verticale sono più comunemente utilizzati per questi studi, ma un sistema multifotonica invertito può anche essere utilizzato. In questo studio, è stato utilizzato un dispositivo stereotassiche personalizzato progettato atraumatica. Anche se ci sono diversi dispositivi stereotassiche commercialmente disponibile per i sistemi di microscopio dritto, non c'è nessun dispositivo stereotassica commercialmente disponibile per un sistema di microscopio invertito per assicurare il cranio del mouse. Come alternativa a un dispositivo personalizzato stereotassica, il cranio può essere fissato in posizione sopra l'obiettivo utilizzando diversi metodi di nastro o colla per la stabilità.
2. Aprire un software di acquisizione immagini. Nella sezione "impostazioni di acquisizione" pannello Verifica se è selezionata una modalità di scansione direzionale. Impostare la velocità di scansione a 4 μs/pixel, frame rate a 512 x 512 pixel e zoom a 1.5. Selezionare 20 X W Na 0.95 obiettivo dall'elenco delle lenti obiettivo disponibili per abbinare l'obiettivo posizionato a ogiva.
3. Accedere alla "lista di tintura" dal pannello "Controllo di acquisizione immagine" e selezionare "Due fotoni". Aprire la finestra di "Luce percorso & coloranti" e selezionare DM690-980 eccitazione DM. Apri l'otturatore laser 2P selezionando la casella di controllo nell'unità Laser 2. Nella finestra "Microscopio Controller", selezionare RDM690 specchio.
4. Selezionare "EPI LAMP", scegliere cubo epi-filtro B/G e focalizzare l'obiettivo sul campione per visualizzare il flusso vascolare e la nicchia di midollo osseo calvarium, utilizzando come riferimento la biforcazione della vena centrale (a) e la sutura coronaria (b) (Figura 2A).
5. Raccogliere immagini utilizzando la modalità non-descanned. Selezionare tre rivelatori esterni: PMT detector1 per raccogliere il segnale SHG di collagene (filtro di emissione - 430/100 nm), GaAsP detector2 a raccogliere GFP segnale (filtro di emissione - 525/50) e GaAsP detector3 per raccogliere il segnale di TRITC-destrano (filtro di emissione - 605/90 nm).
   1. Eseguire la creazione di immagini a una velocità di scansione di 4μs/pixel con nessun media per ridurre al minimo la fototossicità. Raccogliere immagini a un guadagno di potenza e rivelatore laser costante regolata per utilizzare l'intera gamma dinamica del rivelatore con saturazione minima.
   2. Raccogliere serie delle sezioni attraverso la profondità del tessuto (60 x 1 μm Z-stack) da 6 regioni del midollo osseo calvarium. Utilizzare le impostazioni di dimensione di passo di 1 μm, zoom 1.5 e grandezza di 512 x 512 pixel (423 µm x 423 µm).
      Nota: Nel complesso tempo totale richiesto per un mouse di immagine è 1-1,5 h.

6. analisi quantitativa

1. Eseguire le ricostruzioni di quantificazione e 3D immagine utilizzando un software di quantificazione e la visualizzazione di immagini 3D/4D dedicati secondo le istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). Visualizzare in modo interattivo Z-stack in 3D utilizzando la massima intensità di proiezione (MIP), alfa-blend o algoritmi di rendering di ombra proiezione volume.
2. Segmentare le cellule GFP utilizzando il "modulo di segmentazione di Spot oggetto". Applicare l'elaborazione dello stack aritmetica (sottrazione di canale) per eliminare i false positive conte di cellule GFP (questo Elimina il segnale di cellule ossee visualizzazione forte fluorescenza nei canali verde e rosso).
3. Eseguire la segmentazione della superficie dell'osso e del sistema vascolare, utilizzando il modulo di superficie segmentazione. Se necessario, calcolare le distanze delle cellule a qualsiasi delle suddette superfici applicando algoritmi di X-tension, chiamati "distanza di punto di superficie".

Risultati

Coorti di 2 RBPJKO e 2 RBPJWT destinatari erano imaged in una singola sessione di imaging in diversi momenti: 24 h e 2, 4 e 6 settimane dopo il trapianto di cellule BM Lys-GFP (flusso di lavoro è illustrato in Figura 1A).

In ogni mouse, le immagini sono state acquisite da 6 regioni standard del calvarium BM, identificati dalla loro posizione in relazione alla biforcazione della vena centrale (Figura 2A<...

Discussione

Questo protocollo descrive un disegno sperimentale ottimizzato per studiare la cinetica di attecchimento di cellule ematopoietiche da microscopia di fluorescenza Intravital. In questo studio, l'espansione di cellule progenitrici mieloidi in un BM WT o in una tacca di segnalazione difettosa BM è stato registrato in calvarium osseo dalle cellule mieloidi positive di Lys-GFP seguente dopo BMT in destinatari RBPJWT o RBPJKO. Questo approccio è proposto come un modello che può essere applicato per affrontare simili questio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software