Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

Riepilogo

La somministrazione di farmaci per il recupero della funzione renale richiede il controllo della localizzazione e distribuzione del composto terapeutico. Qui, descriviamo in dettaglio una semplice tecnica per la consegna intrarenale di farmaci nei ratti. Questa procedura può essere eseguita facilmente senza mortalità ed elevata riproducibilità.

Abstract

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Introduzione

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti su ratti femmina Sprague-Dawley, del peso di 250-300 g. Tutte le procedure sugli animali rispettate le norme indicate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto di laboratorio risorse animali, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) e sono stati approvati dal Mayo Clinic College of Medicine Istituzionale Animal Care e Comitato Usa (IACUC).

1. Preparazione

1. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico. Se interventi chirurgici multipli su diversi ratti sono in programma nella stessa giornata, lavare gli strumenti dopo ogni procedura di animale e poi sterilizzare utilizzando uno sterilizzatore a caldo tallone.
2. Anestetizzare il topo con il 4% isoflurano in 1 L / min O _2.
3. Trasferire il ratto ad una piastra elettrica controllata per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Mantenere l'anestesia con il 1-2% isoflurano in 1 L / min O _2.
4. Somministrare il farmaco analgesico (buprenorfina sostenuta di uscita 0,6 mg / kg) subcutaneously.
5. Applicare una pomata per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la procedura.
6. Al fine di compensare la perdita di fluidi corporei causa laparotomia, è importante somministrare 10 ml / kg di 0,9% sottocutanea soluzione fisiologica prima dell'intervento.
7. Radere la zona addominale e pulire la pelle con i rilievi etanolo povidone-iodio e il 70%.

2. Procedura chirurgica

1. Assicurarsi che la profondità di sedazione è adeguato per il monitoraggio riflessi fisici, quali il recesso dal pizzico punta, riflesso palpebrale, il tono della mascella, e la respirazione tasso / modello.
2. Eseguire una laparotomia attraverso una piccola incisione mediana (2-2,5 cm di lunghezza) con un bisturi chirurgico lama No. 10.
3. Estrarre l'intestino e colon al lato destro dell'addome utilizzando tamponi di cotone e coprire con garza sterile imbevuta di 0,9% soluzione salina per mantenere gli organi umido.
4. Delicatamente rientrare verso l'alto la milza, fegato, stomaco e del pancreas per esporre la aorta e l'arteria renale sinistra.
5. Con l'aiuto di un microscopio operatorio, separare con attenzione l'aorta addominale sopra e sotto il rene sinistro e l'arteria renale sinistra dalle vene, il grasso e il tessuto connettivo circostante con dissezione curvo forcipe smussato e tamponi di cotone sterili.
   1. Utilizzare le pinze con un moto (scollamento) open-close ripetuto lungo la lunghezza delle navi per rimuovere il tessuto connettivo e le tamponi di cotone con un moto di rollio laterale per rimuovere il grasso.
      NOTA: La dissezione della regione peri-aortica è un passo molto delicato come nervi e vasi linfatici potrebbe essere danneggiata. Assicurarsi di mantenere le arterie umido con soluzione salina durante la procedura di dissezione.
6. Collocare una sutura 4-0 seta sotto l'aorta.
7. Utilizzando clip microvascolari, bloccare l'aorta sopra (appena sotto l'arteria mesenterica superiore) e al di sotto della biforcazione dell'arteria renale.
8. Puntura dell'aorta a livello della kidn sinistrabiforcazione dell'arteria ey con un catetere endovenoso G 24 e far avanzare il catetere nell'arteria renale.
   NOTA: questo è un passo fondamentale, come la puntura attraverso l'arteria renale può verificarsi.
9. Collegare una siringa riempita con la soluzione farmaco o salina (fino a 500 microlitri) al catetere e profumato rene.
10. Subito dopo perfusione, bloccare la vena renale sinistra e dell'uretere sinistro con una clip microvascolare e rimuovere il catetere. Poi, posizionare un pezzo di spugna assorbibile emostatico gelatina, con una piccola goccia di tessuto adesivo, sopra la zona forata dell'aorta e applicare delicatamente pressione con un tampone di cotone.
11. Allo stesso tempo, rilasciare il morsetto dall'aorta addominale, sotto fianco biforcazione dell'arteria renale. Dopo 5 minuti, rilasciare il morsetto dalla vena renale e dell'uretere.
12. rilasciare con cautela il morsetto dall'aorta, sopra a sinistra biforcazione dell'arteria renale, e consentire la riperfusione renale. L'ischemia renale totale dovrebbe durare non più di 7 minuti.
13. garantire che non si verifichino sanguinamento attivo e osservare da vicino l'area per altri 10 min.
14. Chiudere l'incisione addominale in due strati (muscoli e la pelle), con 4-0 punti di sutura assorbibili e un modello continuo per prevenire l'infezione. Oltre alla tecnica modello sutura continua, un'altra opzione potrebbe essere quella di utilizzare una tecnica semplice ed interrotta, particolarmente per la chiusura parete del corpo per evitare deiscenza.
15. Applicare topico pomata antibiotica sopra l'area di incisione per prevenire le infezioni.
16. Trasferire il ratto in una gabbia di osservazione libera assestamento su un rilievo caldo fino al recupero completo con una gamma di temperatura impostata a 35-37 ° C. Assestamento allentato dovrebbe essere coperto (ad esempio con un asciugamano drappo o carta) o rimosso dalla gabbia fino a quando gli animali sono completamente recuperati per impedire il soffocamento o aspirazione di biancheria da letto.
17. Dopo l'intervento chirurgico, osservare gli animali continuamente fino a quando la respirazione spontanea, poi ogni ora per un paio d'ore. Re-dosare l'analgesico buprenorfina SR 72 orein seguito, se si osservano segni di disagio, come la letargia, curvo e trasandato, smorfia, non riprendere le normali attività.
18. Dopo il completamento di tutti gli studi, eutanasia degli animali con l'inalazione di una dose eccessiva di CO ₂ e di raccogliere i tessuti renali di analisi ex vivo come istologia e Western Blotting ^5.

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Risultati

Abbiamo iniettato due diverse dosi di VEGF ricombinante di ratto (rrVEGF, 0,17 mg / kg e 5 mg / kg) o PBS. Gli animali sono stati sacrificati post-chirurgico 8 ore per esaminare l'attivazione della via VEGF. La procedura chirurgica non ha influenzato la morfologia del rene perfuso (Figura 1A) rispetto al controllo (Figura 1B), come mostrato da H & E colorazione. Mentre Sirius colorazione rossa non ha mostrato alcun aumento nella deposizione...

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Discussione

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370