Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Riepilogo

I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Abstract

miociti nodo seno-atriale (SAM) agiscono come i pacemaker naturale del cuore, avviando ogni cuore battere generando potenziali d'azione spontanei (AP). Questi punti di accesso pacemaker riflettono l'attività coordinata di numerose correnti di membrana e il ciclismo calcio intracellulare. Tuttavia i meccanismi precisi che guidano l'attività di pacemaker spontanea in SAM rimangono sfuggente. Acutamente SAM isolati sono una preparazione fondamentale per gli esperimenti di sezionare le basi molecolari della pacemaking cardiaco. Tuttavia, l'anatomia indistinto, microdissezione complessa, e le condizioni di digestione enzimatica meticolosi hanno impedito l'uso diffuso di acutamente isolato SAM. Inoltre, i metodi non erano disponibili fino a poco tempo per consentire la cultura a lungo termine di SAM per gli studi di espressione proteica. Qui forniamo un protocollo e video dimostrativo step-by-step per l'isolamento di SAM da topi adulti. Un metodo è dimostrato anche per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro e per espressivosu di proteine ​​esogene tramite infezione da adenovirus. Acutamente isolate e coltivate SAM preparati tramite questi metodi sono adatti per una varietà di studi elettrofisiologici e di imaging.

Introduzione

miociti pacemaker nel nodo seno-atriale del cuore (miociti seno-atriale, "SAM") generano, potenziali spontanei ritmiche d'azione (AP) che si propagano attraverso il miocardio di avviare ogni battito cardiaco. Gli esperimenti che utilizzano SAM acutamente isolati da molte specie sono stati fondamentali per la spiegazione dei meccanismi che contribuiscono alla generazione di attività pacemaker. SAM sono cardiomiociti altamente specializzati che differiscono sostanzialmente dalle loro controparti nel miocardio atriale e ventricolare in termini di morfologia, funzione e l'espressione della proteina. Il segno distintivo di AP spontanee SAM è una depolarizzazione spontanea durante la diastole che spinge il potenziale di membrana di soglia per far scattare la prossima AP ^1,2. Questa "potenziale pacemaker" dipende dall'attività coordinata di molte diverse correnti di membrana compreso il "divertente di" (I _f), correnti di calcio T e L-type, e la sodico-calcico scambiatore current (I _NCX), che è guidato da Ca ²⁺ rilascio dal reticolo sarcoplasmatico ^3,4.

Mentre acutamente isolato mouse SAM è una preparazione sperimentale essenziale per lo studio della pacemaking, l'isolamento di SAM da topi può essere un metodo difficile adottare perché l'anatomia indistinto e piccole dimensioni del mouse SAN richiede una microdissezione sfumata e la enzimatica combinata e meccanica dissociazione delle cellule richiede l'ottimizzazione attenta.

Forniamo qui un video dimostrativo dettagliata di un protocollo che è stato usato con successo per isolare SAM da topi adulti per le registrazioni di patch clamp ^5-8. A nostra conoscenza, non esiste una dimostrazione visiva disponibile da qualsiasi altra fonte. Inoltre, un nuovo metodo è dimostrato nella quale isolato SAM da topi adulti può essere mantenuto in vitro per diversi giorni, permettendo così l'introduzione di proteine, geneticamente codificatomolecole giornalista o RNAi tramite infezione da adenovirus ^9.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Colorado Anschutz Medical Campus. Il protocollo standard di seguito è stato ottimizzato utilizzando maschio C57BL / 6J topi di 2-3 mesi di età.

1. Preparare Azioni e accessori per la soluzione in anticipo di esperimenti

NOTA: vedi Materiali Tavolo per attrezzature e forniture necessarie.

1. Preparare 1 L ciascuna delle seguenti soluzioni come indicato nella Tabella 1:, basso Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode di, Modified Kraft-Brühe (KB) Soluzione e Bovine Serum Albumin (BSA) soluzione completa di Tyrode. Usa ultrapura filtrata acqua deionizzata per tutte le soluzioni. Dividere ogni soluzione in 50 ml aliquote e conservare a 20 ° C per un massimo di sei mesi. Scongelare singole aliquote immediatamente prima degli esperimenti, e conservare per un massimo di una settimana a 46; C.
2. Preparare 50 ml di 10 mM NaCl e 1,8 mM CaCl ₂ Adattamento soluzione sciogliendo NaCl e CaCl ₂ in ultrapura filtrata acqua deionizzata (Tabella 1). Conservare a temperatura ambiente per un massimo di sei mesi.
3. Preparare 4,75 unità di attività enzimatica (U) aliquote di elastasi pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a 4 ° C per un massimo di tre mesi.
4. Preparare 375 mg aliquote (in ultrapura H ₂ O) di collagenasi-proteasi miscela enzimatica pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a -20 ° C per un massimo di tre mesi.
5. Preparare due pipette ribruciate Pasteur, uno per il trasferimento di tessuto (~ finale diametro di apertura 1,5 millimetri; Figura 1Aiv e Figura 1C) e uno per la dissociazione (~ 2 mm di diametro; Figura 1Aiii e Figura 1C).
   1. Punteggio pipette Pasteur con un cutter vetro e scatto lungo il punteggio di produrre un'apertura leggermente più grande della dimensione desiderata. Fuoco-Polacco la fine del taglio di ogni pipetta per ~ 30-60 sec a fuoco lento su un becco Bunsen per la produzione di una parete spessa e lucida un'apertura del diametro desiderato. Garantire l'apertura del fuoco lucidato è privo di eventuali crepe o asperità.
6. Preparare due piatti di dissezione con l'aggiunta di ~ 25 ml elastomero di silicone miscelato secondo le istruzioni del produttore per ogni 100 millimetri piastra di Petri (Figura 1AI e Figura 1B). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore.
7. Solo per la cultura: preparare 25-50 ml ogni placcatura Medium e terreno di coltura come da Tabella 2 Store per un massimo di due settimane a 4 ° C..

2. Preparare le soluzioni da utilizzare il giorno di isolamento delle cellule

NOTA: Le seguenti importi per l'isolamento dei miociti seno-atriale da un mouse.

1. Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode (pH 6.9) a ciascuno dei tre piccoli, tubo a fondo tondo culturaS. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C.
2. Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca ²⁺ / a una grande provetta a fondo tondo di Mg ²⁺ Tyrode. Per questo tubo, aggiungere 1 aliquota (4,75 U) elastasi ed una aliquota (375 mcg) collagenasi-proteasi enzima miscela. Agitare per mescolare. Collocare il tubo nel 35 ± 1 ° C bagnomaria.
3. Aggiungere 2,5 ml di KB da medio a tre piccoli, tubi di coltura a fondo tondo aggiuntivi e una grande, provetta a fondo tondo aggiuntivo. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C.
4. Aggiungere ~ 7 ml di soluzione BSA di un grande tubo cultura Bottomed. Mantenere questo tubo a temperatura ambiente.
5. Posizionare 20-40 ml di soluzione completa di Tyrode in un bicchiere da 50 ml (Figura 1Aii). Aggiungere 10 USP / ml di eparina, turbine a mescolare, e posizionare il bicchiere in bagno d'acqua ° C 35 ± 1.

3. Preparare Altre soluzioni e materiali per colture cellulari (saltare questi passaggi per cellule acutamente isolato)

1. In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare due 12 millimetri vetrini rotondi per il mouse in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
   NOTA: La piastra 24 e viene utilizzato perché i pozzi sono una dimensione conveniente, che serve a limitare il volume di infezioni virali successive.
2. Dispensare circa 200 ml di 100 ng / ml soluzione di laminina del mouse diluita in fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ogni vetrino.
3. Incubare coprioggetto con laminina per la durata dell'isolamento (almeno 1 ora) in un incubatore a 37 ° C.
4. Pre-caldo la placcatura Medium e terreno di coltura (dal punto 1.7 e tabella 3) a 37 ° C.

Isolamento 4. senoatriale Nodo

1. In una cappa, posizionare il mouse in una camera di una scatola a due camere e anestetizzare con ~ 200 ml isoflurano liquido introdotto tramite un bastoncino di cotone nell'altra camera. Confermare anestesia (di solito entro 30-60 ~ sec) con un pizzico punta. euthanizemouse dislocazione cervicale.
   NOTA: 1 ml di dialogo punta della pipetta vuoto può essere usato per formare la scatola a due camere; girare la cremagliera a testa in giù nella casella per creare il vano separato per l'isoflurano per evitare che il mouse di contattare direttamente.
2. Rimuovere pelliccia dal petto con le forbici e transetto gabbia toracica per esporre la cavità toracica con pinze esterni dei tessuti (Figura 1Aviii) e forbici dissezione (Figura 1Avix). Bagnare la cavità toracica con ~ 2 ml riscaldati Completa Tyrode di con eparina con una pipetta di trasferimento.
   NOTA: Continua cavità toracica da bagno quando è necessario, non consentono la preparazione di asciugarsi.
3. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione i polmoni e timo con le forbici interne (Figura 1Avi) e pinze dissezione (Figura 1Avii).
4. Tenendo delicatamente l'apice del cuore con le pinze dissezione interni, accuratamente tagliato la vena cava inferiore e l'aorta con le forbici interne per rimuovere il cuore dalla cavità toracica. Trasferire il cuore di uno dei piatti dissezione silicone e fare il bagno con ~ 4 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di usare la pipetta di trasferimento.
5. Orientare il cuore in modo tale che i vasi posteriori sono visibili e rivolta verso l'alto, con atrio destro dell'animale sulla destra dello sperimentatore e atrio sinistro sulla sinistra dello sperimentatore. Una volta orientato, immobilizzare il cuore appuntando attraverso l'apice nel piatto dissezione silicone.
6. Individuare il solco tra i ventricoli e gli atri (chiaro anello di sopra del ventricoli).
7. Utilizzando le forbici dissezione interna, fare un'incisione in corrispondenza della scanalatura, mantenendo più vicino ai ventricoli rispetto atri. Lavare la scanalatura e incisione con ulteriore riscaldato Tyrode Completa eparinizzato di quanto necessario per consentire una visione chiara degli atri e le valvole. Continuare a tagliare lungo la scanalatura per separare gli atri dai ventricoli.
8. Trasferire il tessuto atriale per il secondo piatto dissezione silicone e fare il bagno con ~ 3 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di.
9. Orient il tessuto in modo che nell'atrio destro dell'animale è ora sulla sinistra dello sperimentatore, e l'atrio sinistro è sulla destra.
   NOTA: L'atrio destro è più trasparente, mentre l'atrio sinistro ha più di un tono di colore rosso scuro.
10. Pin il tessuto attraverso la vena cava inferiore e superiore e il diritto e appendici atriale sinistra, si estende la preparazione delicatamente. Rimuovere qualsiasi tessuto grasso o altro residuo per consentire una visione chiara della preparazione (attenzione a non tagliare nella parete atriale, come il nodo seno-atriale è molto delicata e può essere facilmente danneggiato).
11. Aprire la parete anteriore degli atri tagliando attraverso la vena cava. Riposizionare i perni come necessario per visualizzare il setto interatriale.
12. Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro. Re-pin della preparazione, che si estende dolcemente.
13. rimuovere tHa ragione atriale appendice e liberare il nodo seno-atriale tagliando lungo la terminalis creste, che appare come una striscia di colore arancione scuro al confine con l'appendice atriale.
14. Re-pin del tessuto nodale e tagliare lateralmente (perpendicolare al terminalis crista) per la produzione di tre strisce di uguali dimensioni.

5. senoatriale Nodo Digestione

1. Utilizzando la stretta incendio lucidato pipetta (Figura 1Aiv), trasferire i tre strisce di tessuto nodo seno-atriale nel primo dei tre piccoli, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode del nel 35 ± 1 ° bagnomaria C. Incubare per 5 min.
2. Strisce di tessuto trasferimento al secondo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode di in ° C bagnomaria 35 ± 1, utilizzando la stessa pipetta stretta. Lavare le strisce di tessuto delicatamente roteare il tubo o pipettando delicatamente con la pipetta stretto. Non invert tubo.
3. Strisce di tessuto trasferimento al terzo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode di, e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 5.2.
4. Strisce trasferimento nella grande tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode con enzimi (elastasi più miscela collagenasi-proteasi) nel bagno d'acqua a 35 ° C. Assicurarsi che tutte le tre strisce di tessuto sono presenti. Incubare per 10-15 minuti a 35 ± 1 ° C. Mescolare ogni 5 minuti agitando delicatamente il tubo. Non invertire il tubo.

6. senoatriale Nodo miociti Dissociazione

1. Dopo la digestione enzimatica, utilizzare la stretta pipetta incendio lucidato per trasferire delicatamente le strisce di tessuto al primo, il tubo a fondo tondo piccolo contenente 2,5 ml di soluzione KB a 35 ± 1 ° C. Lavare il tessuto agitando delicatamente il tubo.
   Nota: le strisce di tessuto saranno apparire un po 'trasparente e possono raggrupparsi a Thè il punto. Maneggiare molto delicatamente dopo la digestione enzimatica per evitare di perdere le cellule.
2. Trasferire il tessuto al secondo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare.
3. Trasferire il tessuto al terzo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare.
4. Trasferire il tessuto alla grande, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C.
5. Utilizzando la grande pipetta incendio lucidato (Figura 1Aiii e Figura 1C), dissociare le cellule nel grande tubo a fondo tondo da costante triturazione a circa 0,5-1 Hz per 5-10 minuti, avendo cura di mantenere il tubo di dissociazione sommerso nel 35 ± 1 ° C bagnomaria e per evitare di introdurre bolle nella soluzione.
   Nota: tempo di triturazione varia con diametro della pipetta di dissociazione e la forza di pipettaggio. Il tempo dovrebbe essere regolata in modo che i pezzi di tessuto rimanendo a tegli fine della dissociazione appare sottile, trasparente e ciuffi. Se il tessuto mantiene qualsiasi colore, la dissociazione è probabilmente incompleta. Frequenza (0,5-1 Hz) è determinato a mano.
6. Rimuovere il tubo a fondo rotondo contenente dissociata SAM dal bagnomaria ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min.

7. senoatriale Nodo calcio riadattamento (Eseguita a temperatura ambiente)

NOTA: Per SAM destinato per esperimenti di coltura, le procedure descritte nella sezione seguente devono essere eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti. Se SAM devono essere usati per esperimenti acuti, non vi è alcuna necessità di eseguire queste operazioni in un ambiente sterile.

1. Aggiungere 75 ml di NaCl / CaCl ₂ soluzione adattamento (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min.
2. Aggiungere 160 ml di NaCl / CaCl soluzione ₂ di adattamento. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min.
3. Aggiungere 390 ml di BSA solution (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
4. Aggiungere 1,25 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
5. Aggiungere 4,37 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
   Nota: La concentrazione finale di calcio sarà 1,8 mM.
6. A seguito di calcio riadattamento, raccogliere SAM consentendo di risolvere per gravità per ~ 10 minuti o per centrifugazione a ~ 2.000 xg per 3 min.
   1. Per le cellule acutamente isolate, rimuovere delicatamente e scartare circa 5 ml del surnatante con una pipetta Pasteur di vetro, lasciando le cellule in un volume di 2 ml ~. Conservare queste cellule a temperatura ambiente per un massimo di ~ 8 ore per le registrazioni di patch clamp.
   2. Per le cellule in coltura, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile utilizzando una pipetta di vetro sterile Pasteur. Pellet Risospendere cellule in 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) Placcatura Medium (Tabella 2).

8. placcatura e la cultura di senoatriale Myociti (Skip per cellule acutamente isolato)

1. Rimuovere la soluzione laminina da lamelle dal punto 3.3 con una pipetta Pasteur. seminare Immediatamente 500 microlitri (~ 50-100 cellule) su ogni vetrino laminina rivestite (dal punto 3).
   NOTA: L'inibitore contrattile 2,3-butanedione monoxime (BDM) è incluso nei media placcatura e cultura per prevenire la contrazione, che provoca logoramento delle cellule ^9.
2. Riportare la piastra 24 pozzetti contenente SAM appena seminato al incubatore e mantenere a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO _2. Consentono alle cellule di aderire a lamelle per 4-6 ore nei media placcatura (Tabella 2).
3. Rimuovere delicatamente placcatura Media utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Sostituire con 500 ml per pozzetto di pre-riscaldato (37 ° C) Culture Media (Tabella 2).

9. trasduzione adenovirale di adulti Culture senoatriali miociti (Vai a cellule acutamente isolato)

1. Stimare il numero di cells per coprioggetto immediatamente prima dell'applicazione adenovirus contando le cellule in un campo visivo al microscopio, regolando per l'ingrandimento. Contare tutte le cellule, non solo SAM.
2. Diluire adenovirus in Medium 199 e regolare la diluizione per il titolo virale in modo che l'applicazione di 1-10 microlitri è necessaria per ottenere una molteplicità finale di infezione (MOI) di 100 unità virali per cellula. Aggiungere la soluzione adenovirale in modo gocce direttamente sulla placcato SAM.
3. Incubare le cellule con il pernottamento medio virus contenente (~ 12-14 ore). Poi scambiare con terreno di coltura fresco. Mantenere le cellule in incubatrice, cambiando la cultura media ogni 48 ore, fino ad ottenere l'espressione della proteina desiderata.

10. La valutazione funzionale del Acutamente isolato o coltivate SAM

NOTA: Il seguente protocollo è un esempio di valutazioni funzionali di SAM isolato utilizzando l'amfotericina tecnica perforato-patch per registrare sia i punti di accesso spontanee e I _{f dalla stessa cellula (vedi riferimento ^9).}

1. Preparare soluzioni di registrazione come descritto nella tabella 3.
2. Preparare una soluzione stock di 20 mg / ml di amfotericina B-in DMSO fresco il giorno della registrazione. Mantenere magazzino a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Diluire amfotericina B-magazzino in soluzione intracellulare ad una concentrazione finale di 200 ug / ml al momento dell'uso. Mantenere la soluzione pipetta finale sul ghiaccio e al riparo dalla luce.
   NOTA: La soluzione pipetta amfotericina contenente per esperimenti deve essere preparato fresco oraria diluendo una aliquota della soluzione madre nella soluzione intracellulare e vortex per almeno 1 min.
3. Trasferire una aliquota della acutamente dissociate sospensione cellulare SAM o un frammento di vetro vetrino cuscinetto colta SAM ad una camera di registrazione contenente la soluzione di Tyrode a 35 ± 1 ° C. Profumato cellule con la soluzione di Tyrode per almeno 2 minuti prima recordin elettrofisiologicags per eliminare ogni residuo di BDM rimanente dal terreno di coltura.
   NOTA: contrazioni spontanee dovrebbe essere evidente subito dopo il trasferimento alla soluzione del Tyrode. SAM per la registrazione può essere identificato da una combinazione di funzioni, tra cui attività contrattile spontanea, morfologia caratteristica (ad es., Figura 2), la mancanza di striature, espressione della proteina HCN4, presenza di corrente I _f, capacità di membrana <50 pF, e spontanei AP con forme d'onda che includono una fase di depolarizzazione diastolica e una salita lenta.
4. Usando pipette di vetro borosilicato con resistenze di 1,5-3,0 MW, riempire la punta con la soluzione intracellulare carente amfotericina per immersione per 10-30 sec. Poi di nuovo riempire la pipetta con la soluzione di amfotericina contenente. Una guarnizione cell-attached GΩ dovrebbe essere ottenuto più rapidamente possibile. Se la formazione di tenuta è difficile, aumentare il tempo di punta-fill.
   NOTA: La resistenza accesso dovrebbe essere continuamentemonitorati dopo la formazione del sigillo cellule iscritti, e le registrazioni devono essere avviate solo dopo aver ottenuto una resistenza accesso stabile di <10 MW.
5. Per registrare i punti di accesso spontanee, commutare l'amplificatore in modalità di corrente-clamp veloce senza iniezione di corrente.
   NOTA: 1 nM isoproterenolo è incluso nella soluzione extracellulare Tyrode durante la registrazione di punti di accesso per stabilizzare il tasso di fuoco, come riportato in precedenza ^10.

Risultati

I protocolli descritti qui sono stati precedentemente utilizzati per isolare spontaneamente attivi SAM da topi adulti che sono adatti per una varietà di differenti di patch clamp studi ^5-8. Inoltre, i protocolli consentono SAM isolati che possono essere mantenute in coltura per fino ad una settimana. Il trasferimento genico nelle cellule in coltura può essere realizzato tramite infezione da adenovirus ^9. I risultati presentati in questa sezione derivano dal nostro...

Discussione

Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura di completamente differenziate miociti nodo seno-atriale da topi adulti. Il protocollo di isolamento produce in modo affidabile SAM spontaneamente attivi del mouse adatti sia per l'analisi elettrofisiologica immediata o successiva cultura. Protocolli simili sono stati riportati da molti altri gruppi (per esempio, vedere riferimenti ^{11,12,10,13-17).} Tuttavia, il protocollo per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgruard/Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes	Fisher Scientific	352059
Large, round bottomed culture tubes	Corning	14-959-11B
Elastase	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	Tissue dissociation solution
Heparin	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Mouse Laminin	Corning	CB-354232
12 mm round glass coverslips	Fisher	12-545-80
24-well culture plate	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
Plastic, disposable transfer pipette	Fisher Scientific
Micro scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 Forceps	Roboz Instruments	RS-4904
Tissue Forceps	Roboz Instruments	RS-8164
Dissecting Iris Scissors	WPI, Inc.	501264
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
glucose	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
taurine	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-glutamate	Sigma	G1501
K-aspartate	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
creatine	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
Amphotericin-B	Fisher Scientific	1397-89-3
Isoproterenol	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma	B0753
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A5611
Insulin	Sigma	I3146
Transferrin	Sigma	I3146
Selenium	Sigma	I3146
Penicillin	GE Healthcare	SV30010
Streptomycin	Hyclone	SV30010